專利名稱：Glp-1融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與一些蛋白融合的胰高血糖素樣肽，包括其類似物和衍生物，所述蛋白具有延長(zhǎng)胰高血糖素樣肽的體內(nèi)半衰期的作用。這些融合蛋白可以用于治療非胰島素依賴型糖尿病和各種狀況。
胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一個(gè)含有37個(gè)氨基酸的、可對(duì)食物攝入作出應(yīng)答的肽，是由腸L-細(xì)胞分泌的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1可刺激胰島素分泌(促胰島素活性)，從而引起細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和血清葡萄糖水平下降(見(jiàn)如Mojsov，S.，Int.J.Peptide ProteinResearch，40333-343(1992))。然而，GLP-1活性很低。隨后在第6位和第7位之間的內(nèi)源性裂解產(chǎn)生了生物活性更強(qiáng)的GLP-1(7-37)OH肽。已知有很多GLP-1類似物和衍生物，在此稱作“GLP-1化合物”。這些GLP-1類似物包括GILA毒蜥(monster)毒液中的Exendins。Exendins具有與天然GLP-1同源的序列，結(jié)合GLP-1受體并起始由GLP-1(7-37)OH引起的負(fù)責(zé)多種活性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)。
GLP-1化合物具有各種重要的生理活性。例如，已經(jīng)證明GLP-1刺激胰島素釋放，降低胰高血糖素分泌，抑制胃排空，并且增強(qiáng)葡萄糖利用。[Nauck，M.A.，et al.(1993)Diabetologia 36741-744；Gutniak，M.，et al.(1992)New England J.of Med.32613161322；Nauck，M.A.，et al.，(1993)J.Clin.Invest.91301307]。
GLP-1表現(xiàn)出作為非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的治療方法的最大潛能。市場(chǎng)上已經(jīng)有許多口服藥物，用于治療與NIDDM相關(guān)的胰島素抵抗。然而，當(dāng)疾病進(jìn)展時(shí)，患者必須開(kāi)始刺激胰島素釋放，并最終進(jìn)行涉及胰島素注射的治療。然而，當(dāng)前刺激胰島素釋放的藥物和胰島素的實(shí)際給藥也可導(dǎo)致低血糖癥。GLP-1活性受血糖水平的控制。當(dāng)該水平降低到某一域值水平時(shí)，GLP-1無(wú)活性。因此。沒(méi)有發(fā)生與GLP-1治療相關(guān)的低血糖癥的危險(xiǎn)。
然而，涉及GLP-1肽的治療的用途受到了它們的迅速清除和短半衰期的限制。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘。當(dāng)皮下給藥時(shí)，GLP-1(7-36)酰胺的作用時(shí)間為約50分鐘。甚至抗內(nèi)源性蛋白酶裂解的類似物和衍生物也沒(méi)有足夠長(zhǎng)的半衰期以避免在24小時(shí)的時(shí)間段中重復(fù)給藥。當(dāng)需要在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持治療劑的高血液水平時(shí)，治療劑的迅速清除是不方便的，因?yàn)楸仨氈貜?fù)給藥。此外，長(zhǎng)作用時(shí)間的化合物對(duì)于過(guò)去的治療方案只包括口服藥物的糖尿病患者特別重要。這些患者通常對(duì)于包括多次藥物注射的方案具有極為困難的時(shí)間過(guò)渡。
本發(fā)明克服了與遞送具有短血清半衰期的化合物相關(guān)的問(wèn)題。本發(fā)明包括與另一種具有長(zhǎng)的循環(huán)半衰期的蛋白，如免疫球蛋白或白蛋白的Fc部分融合的GLP-1化合物。
一般地，小的治療性肽難以操作，因?yàn)榧词故撬鼈兊慕Y(jié)構(gòu)中的輕微改變也可以影響穩(wěn)定性和/或生物活性。對(duì)于目前開(kāi)發(fā)中的GLP-1化合物來(lái)說(shuō)更是如此。例如，例如，GLP-1(7-37)OH具有進(jìn)行構(gòu)象改變的傾向，從主要為α螺旋結(jié)構(gòu)改變成主要為β折疊結(jié)構(gòu)。β折疊的形成導(dǎo)致被認(rèn)為是無(wú)活性的物質(zhì)的聚集。因此，能夠開(kāi)發(fā)半衰期增加的生物活性GLP-1融合蛋白是出乎意料的。因此，由于對(duì)GLP-1(737)OH本身和相對(duì)于所連接的GLP-1肽來(lái)說(shuō)很大的融合配偶體進(jìn)行工作的困難，這尤其是預(yù)料不到的。
本發(fā)明的化合物包括一種異源融合蛋白，它包含第一個(gè)多肽，該多肽具有N末端和與具有N末端和C末端的第二個(gè)多肽融合的C末端，其中第一個(gè)多肽是GLP-1化合物，并且第二個(gè)多肽選自a)人白蛋白；b)人白蛋白類似物；和c)人白蛋白的片段，并且其中第一個(gè)多肽的C末端與第二個(gè)多肽的N末端融合。
本發(fā)明的化合物還包括一種異源融合蛋白，它包含第一個(gè)多肽，該多肽具有N末端和與具有N末端和C末端的第二個(gè)多肽融合的C末端，其中第一個(gè)多肽是GLP-1化合物，并且第二個(gè)多肽選自a)人白蛋白；b)人白蛋白類似物；和c)人白蛋白的片段，并且其中第一個(gè)多肽的C末端通過(guò)肽接頭與第二個(gè)多肽的N末端融合。肽接頭優(yōu)選選自a)富含甘氨酸的肽；
b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1，2，3，4，5或6；和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
本發(fā)明的其它化合物包括一種異源融合蛋白，包含第一個(gè)多肽，該多肽具有N末端和與具有N末端和C末端的第二個(gè)多肽融合的C末端，其中第一個(gè)多肽是GLP-1化合物，并且第二個(gè)多肽選自a)免疫球蛋白的Fc部分；b)免疫球蛋白的Fc部分的類似物；和c)免疫球蛋白的Fc部分的片段，并且其中第一個(gè)多肽的C末端與第二個(gè)多肽的N末端融合。GLP-1化合物可以通過(guò)肽接頭與第二個(gè)多肽融合。肽接頭優(yōu)選選自a)富含甘氨酸的肽；b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1，2，3，4，5或6；和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
作為異源融合蛋白的一部分的GLP-1化合物一般優(yōu)選具有不超過(guò)6個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。GLP-1化合物甚至更優(yōu)選具有不超過(guò)5個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。GLP-1化合物最優(yōu)選具有不超過(guò)4，3或2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。GLP-1化合物優(yōu)選為第8位具有甘氨酸或纈氨酸的異源融合蛋白的一部分。
本發(fā)明還包括編碼此處描述的異源融合蛋白的多核苷酸，包含這些多核苷酸的載體，和用此處描述的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。還包括一種產(chǎn)生異源融合蛋白的方法，該方法包括在以可檢測(cè)量表達(dá)異源融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯此處描述的多肽的步驟。
本發(fā)明還包括一種使有需要的哺乳動(dòng)物中的血糖水平正常化的方法，包括給予治療有效量的此處描述的異源融合蛋白。
參考以下附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述

圖1包括鉸鏈區(qū)，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的IgG1 Fc氨基酸序列。
圖2人血清白蛋白氨基酸序列。
圖3A.SDS-PAGE凝膠和同一凝膠的免疫印跡，描述IgG1-Fc和GLP-1-Fc融合蛋白的分子量(第1道，分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道，純化的Fc；第3道，偽轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基；第4道，Val8-GLP-1-Fc；第5道，Exendin-4-Fc)。B.SDS-PAGE凝膠和同一凝膠的免疫印跡，描述人HSA和GLP-1-HSA融合蛋白的分子量(第1道，分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道，純化的HSA；第3道，偽轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基；第4道，Val8-GLP-1-HSA；第5道，Val8-GLP-1-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA；第6道，Exendin-4-HSA；第7道，Exendin-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA)。
圖4純化Fc，白蛋白和GLP-1融合蛋白的SDS-PAGE凝膠(第1道，分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道，純化的Fc；第3道，Val8-GLP-1-Fc；第4道，Exendin-4-Fc；第5道，分子量標(biāo)準(zhǔn)；第6道，Val8-GLP-1-HSA；第7道Exendin-4-HSA；第8道，Exendin-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA)。
圖5含有圖1所示Fc區(qū)的表達(dá)克隆載體。
圖6含有圖2所示Fc區(qū)的表達(dá)克隆載體。
圖7含有與圖2所示白蛋白序列的5’框內(nèi)融合的含15個(gè)氨基酸的接頭的編碼DNA的表達(dá)克隆載體。
圖8GLP-1融合蛋白的體外劑量反應(yīng)活性。
圖9GLP-1 Fc和HSA融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)。
圖10兩只正常禁食狗中對(duì)Exendin-Fc的葡萄糖動(dòng)力學(xué)(Glucodynamic)反應(yīng)。
圖11兩只正常禁食狗中對(duì)Exendin-Fc的促胰島素反應(yīng)。
圖12編碼人IgG1 Fc區(qū)的DNA序列。
圖13編碼人白蛋白的DNA序列。
本發(fā)明的融合蛋白包含與人白蛋白，人白蛋白類似物，人白蛋白的片段，免疫球蛋白的Fc部分，免疫球蛋白的Fc部分的類似物，或免疫球蛋白的Fc部分的片段融合的GLP-1化合物。GLP-1化合物的C末端可以直接或通過(guò)肽接頭與白蛋白或Fc蛋白的N末端融合。這些異源融合蛋白具有生物學(xué)活性并且與天然GLP-1相比，半衰期增加。
組成異源融合蛋白的一部分的GLP-1化合物優(yōu)選包括具有約25-約39個(gè)天然存在的或非天然存在的與天然GLP-1(7-37)OH具有充分同源性的氨基酸的多肽，使得它們可以通過(guò)與胰腺β細(xì)胞上的GLP-1受體結(jié)合而表現(xiàn)出促胰島素活性。GLP-1化合物一般包括具有GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-37)OH的類似物，GLP-1(7-37)OH的片段或GLP-1(7-37)OH的片段的類似物的氨基酸序列的多肽。GLP-1(7-37)OH具有SEQ ID NO1的氨基酸序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQ ID NO1)按照本領(lǐng)域中的習(xí)慣，GLP-1(7-37)OH的氨基末端定為第7位殘基，而羧基末端定為第37位殘基。對(duì)多肽中的其他氨基酸依次進(jìn)行編號(hào)，如SEQ ID NO1中所示。例如，第12位為苯丙氨酸而第22位為甘氨酸。
GLP-1化合物也包括“GLP-1片段”。GLP-1片段是從GLP-1(7-37)OH或其類似物或衍生物的N-末端或C-末端截掉一個(gè)或多個(gè)氨基酸后得到的多肽。用于描述GLP-1(7-37)OH的術(shù)語(yǔ)也適用于GLP-1片段。例如，GLP-1(9-36)OH表示從N-末端截掉2個(gè)氨基酸和從C-末端截掉1個(gè)氨基酸后得到的GLP-1。此片段中的氨基酸是用與GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)氨基酸的數(shù)字來(lái)表示的。例如，GLP-1(9-36)OH中的N-末端谷氨酸在第9位；第12位是苯丙氨酸；而第22位是甘氨酸，這與GLP-1(7-37)OH相同。對(duì)于GLP-1(7-36)OH，GLP-1(7-37)OH第37位的甘氨酸被去除。
GLP-1化合物也包括在GLP-1(7-37)OH或其片段或類似物的N-末端和/或C-末端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后得到的多肽。這類GLP-1化合物含有的氨基酸優(yōu)選最多可達(dá)約39個(gè)?！把娱L(zhǎng)的”GLP-1化合物中的氨基酸是用與GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)氨基酸的數(shù)字來(lái)表示的。例如，通過(guò)在GLP-1(7-37)OH的N-末端添加兩個(gè)氨基酸得到的GLP-1化合物的N-末端氨基酸在第5位；而通過(guò)在GLP-1(7-37)OH的C-末端添加一個(gè)氨基酸得到的GLP-1化合物的C-末端氨基酸在第38位；因此，與GLP-1(7-37)OH中的序號(hào)相同，在這兩類“延長(zhǎng)的”GLP-1化合物中第12位是苯丙氨酸；而第22位是甘氨酸。“延長(zhǎng)的”GLP-1化合物的1-6位氨基酸優(yōu)選與GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)的氨基酸相同，或是對(duì)GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)氨基酸的保守取代?！把娱L(zhǎng)的”GLP-1化合物的第38-45位氨基酸優(yōu)選的與胰高血糖素或Exendin-4中相應(yīng)的氨基酸相同，或是對(duì)胰高血糖素或Exendin-4中相應(yīng)氨基酸的保守取代。
本發(fā)明的GLP-1化合物也包括“GLP-1類似物”。GLP-1類似物與GLP-1(7-37)OH或其片段具有充分的同源性，從而這些類似物也具有促胰島素活性。優(yōu)選地，GLP-1類似物包含有GLP-1(7-37)OH或其片段的氨基酸序列，對(duì)其進(jìn)行修飾，這樣其氨基酸序列中有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH片段中相應(yīng)位置上的氨基酸不同。在此處用來(lái)命名GLP-1化合物的命名法中，取代氨基酸及其位置與母結(jié)構(gòu)相同。例如，Glu22-GLP-1(7-37)OH表示這樣一個(gè)GLP-1化合物，其中GLP-1(7-37)OH正常的第22位甘氨酸由谷氨酸取代；Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH表示這樣一個(gè)GLP-1化合物，其中GLP-1(7-37)OH正常的第8位丙氨酸和第22位甘氨酸分別由纈氨酸和谷氨酸取代。
本發(fā)明的GLP-1化合物也包括“GLP-1衍生物”。GLP-1衍生物也定義為具有GLP-1或GLP-1類似物的氨基酸序列的分子，但在其一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)基、α碳原子、末端氨基或末端羧基還額外具有化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾包括，但不限于，添加化學(xué)部分，產(chǎn)生新的鍵，和去除化學(xué)部分。氨基酸側(cè)基的修飾包括，但不限于，賴氨酸ε氨基的?；彼?，組氨酸，或賴氨酸的N烷基化，谷氨酸或天冬氨酸的羧基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰胺。末端氨基的修飾包括，但不限于，脫氨基、N-低級(jí)烷基、N-二-低級(jí)烷基和N-?；揎?。末端羧基的修飾包括，但不限于，酰胺、低級(jí)烷基?；?、二烷基酰胺和低級(jí)烷基酯修飾。低級(jí)烷基為C1-C4烷基。此外，可以用化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的保護(hù)基對(duì)一個(gè)或多個(gè)側(cè)基或端基進(jìn)行保護(hù)。氨基酸的α碳可以被單或二甲基化。
任何GLP-1化合物都可以是本發(fā)明的異源融合蛋白的一部分，只要該GLP-1化合物本身可以結(jié)合GLP-1受體并通過(guò)GLP-1受體誘導(dǎo)信號(hào)傳遞。GLP-1受體結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)可以分別用EP 619,32 2和美國(guó)專利5,120,712中描述的體外測(cè)定方法進(jìn)行評(píng)估。
許多有活性的GLP-1片段、類似物和衍生物是本領(lǐng)域公知的，這些類似物和衍生物的任意一個(gè)都可以是本發(fā)明的異源融合蛋白的一部分。此處提供了新的GLP-1類似物和本領(lǐng)域公知的GLP-1類似物和衍生物的一些例子。
本領(lǐng)域公知的一些GLP-1類似物和GLP-1片段包括，例如，GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，GLP-1(7-36)，Gln9-GLP-1(7-37)，D-Gln9-GLP-1(7-37)，Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)，以及Lys18-GLP-1(7-37)。GLP-1類似物如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)公開(kāi)于美國(guó)專利5,118,666。具有促胰島素特征的GLP-1的生物加工形式，例如GLP-1(7-36)是已知的。其它已知的生物活性GLP-1化合物公開(kāi)于Buckley等人的美國(guó)專利5,545,618，以及Adelhorst等，J.Biol.Chem.2696275(1994)。
一組優(yōu)選的GLP-1類似物由式I(SEQ ID NO2)的GLP-1類似物組成7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-40 41 42 43 44 45Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa式 I(SEQ ID NO2)其中第8位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第9位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；第11位的Xaa是Thr，Ala，Gly，Ser，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；
第14位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第16位的Xaa是Val，Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Tyr，Glu，Asp，Trp，或Lys；第17位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第18位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，Trp，Tyr，或Lys；第19位的Xaa是Tyr，Phe，Trp，Glu，Asp，Gln，或Lys；第20位的Xaa是Leu，Ala，Gly，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，Met，Trp，Tyr，或Lys；第21位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；第22位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第23位的Xaa是Gln，Asn，Arg，Glu，Asp，或Lys；第24位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Arg，Glu，Asp，或Lys；第25位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第26位的Xaa是Lys，Arg，Gln，Glu，Asp，或His；第27位的Xaa是Leu，Glu，Asp，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第31位的Xaa是Trp，Phe，Tyr，Glu，Asp，或Lys；第32位的Xaa是Leu，Gly，Ala，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第33位的Xaa是Val，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Glu，Asp，或Lys；第34位的Xaa是Asn，Lys，Arg，Glu，Asp，或His；第35位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第36位的Xaa是Gly，Arg，Lys，Glu，Asp，或His；
第37位的Xaa是Pro，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第38位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或被去除；第39位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或被去除；第40位的Xaa是Gly，Asp，Glu，或Lys，或被去除；第41位的Xaa是Ala，Phe，Trp，Tyr，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第42位的Xaa是Ser，Pro，Lys，Glu，或Asp，或被去除；第43位的Xaa是Ser，Pro，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第44位的Xaa是Gly，Pro，Glu，Asp，或Lys，或被去除；并且第45位的Xaa是Ala，Ser，Val，Glu，Asp，或Lys，或被去除；前提是當(dāng)?shù)?7，38，39，40，41，42，43或44位的氨基酸被去除時(shí)，該氨基酸下游的每個(gè)氨基酸也被去除。
式I的GLP-1化合物優(yōu)選具有不超過(guò)6個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。更優(yōu)選具有不超過(guò)5個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。甚至更優(yōu)選具有不超過(guò)4個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
本發(fā)明的GLP-1化合物包括式I的衍生物，如其C-1-6-酯或酰胺或C-1-6-烷基酰胺，或C-1-6-二烷基酰胺。WO99/43706描述了式I的GLP-1化合物的衍生物，在此引入作為參考。WO99/43706描述的衍生的式I化合物和未衍生的式I化合物都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另一組優(yōu)選的GLP-1化合物由式II(SEQ ID NO3)的GLP-1類似物組成7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Leu-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R式 II(SEQ ID NO3)
其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第9位的Xaa是Thr，Ser，Arg，Lys，Trp，Phe，Tyr，Glu，或His；第11位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Tyr，Glu，或Ala；第18位的Xaa是His，Pro，Asp，Glu，Arg，Ser，Ala，或Lys；第19位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，Gln，或Arg；第24位的Xaa是Glu，Arg，Ala，或Lys；第26位的Xaa是Trp，Tyr，Phe，Asp，Lys，Glu，或His；第27位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第31位的Xaa是Asp，Glu，Ser，Thr，Arg，Trp，或Lys；第33位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；第34位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第36位的Xaa是Thr，Ser，Asp，Trp，Tyr，Phe，Arg，Glu，或His；第37位的R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
另一組優(yōu)選的GLP-1化合物由式III(SEQ ID NO4)的GLP-1類似物組成
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R式 III(SEQ ID NO4)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第11位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第24位的Xaa是Glu，His，Ala，或Lys；第25位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；第27位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第33位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；第34位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第36位的Xaa是Arg，Glu，或His；第37位的R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
另一組優(yōu)選的GLP-1化合物由式IV(SEQ ID NO5)的GLP-1類似物組成
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-R式 IV(SEQ ID NO5)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第26位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第37位的R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被去除。
另一組優(yōu)選的GLP-1化合物由式V(SEQ ID NO6)的GLP-1類似物組成
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Glu-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R式 V(SEQ ID NO6)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第24位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第37位的R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
式I，II，III，IV和V的優(yōu)選GLP-1化合物包含GLP-1類似物或GLP-1類似物的片段，其中該類似物或片段在第8位含有除丙氨酸以外的氨基酸(第8位類似)。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些第8位類似物優(yōu)選含有在9、11、12、16、18、22、23、24、26、27、30、31、33、34、35、36和37位上進(jìn)行的一或多個(gè)額外改變。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物也優(yōu)選含有6個(gè)或少于6個(gè)改變。與天然GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物更優(yōu)選含有5個(gè)或少于5個(gè)改變或含有4個(gè)或少于4個(gè)改變。與天然GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物甚至更優(yōu)選的含有3個(gè)或少于3個(gè)改變。與天然GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物最優(yōu)選含有2個(gè)或少于2個(gè)改變。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，式II，III，IV和V的化合物降低了聚集并產(chǎn)生不溶形式的傾向。這在融合蛋白的范圍中也是重要的，其中相對(duì)小的GLP-1肽盡管融合于大得多的蛋白，也必須保持活性構(gòu)象。本發(fā)明的融合蛋白包含的式II，III，IV和V的優(yōu)選GLP-1化合物包括GLP-1類似物或GLP-1類似物的片段，其中第22的甘氨酸，優(yōu)選第8位的丙氨酸被其它氨基酸取代。
當(dāng)?shù)?2位氨基酸是天冬氨酸、精氨酸或賴氨酸時(shí)，第8位氨基酸優(yōu)選為甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，而更優(yōu)選是纈氨酸或甘氨酸。當(dāng)?shù)?2位是磺酸如半胱磺酸時(shí)，第8位優(yōu)選為甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，而更優(yōu)選為纈氨酸或甘氨酸。
其它優(yōu)選的GLP-1化合物包括式IV(SEQ ID NO5)的GLP-1類似物，其中該類似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，但第8位的氨基酸優(yōu)選是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選是纈氨酸或甘氨酸，而第30位是谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸或組氨酸，更優(yōu)選為谷氨酸。
其它優(yōu)選的GLP-1化合物包括式IV(SEQ ID NO5)的GLP-1類似物，其中該類似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，但第8位氨基酸優(yōu)選是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選為纈氨酸或甘氨酸，而第37位是組氨酸、賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，而更優(yōu)選是組氨酸。
其它優(yōu)選的GLP-1化合物包括式IV(SEQ ID NO5)的GLP-1類似物，其中該類似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，但第8位氨基酸優(yōu)選是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選的為纈氨酸或甘氨酸，而第22位是谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或精氨酸，更優(yōu)選的是谷氨酸或賴氨酸，而第23位是賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和組氨酸，更優(yōu)選的是賴氨酸或谷氨酸。
其它優(yōu)選的GLP-1化合物包括式V(SEQ ID NO6)的GLP-1類似物，其中該類似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，但第8位氨基酸優(yōu)選是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選是纈氨酸或甘氨酸，而第22位是谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或精氨酸，更優(yōu)選是谷氨酸或賴氨酸，而第27位是丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或組氨酸，更優(yōu)選是丙氨酸。
其它優(yōu)選的GLP-1化合物包括式II的GLP-1類似物，其中該類似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，但第8位氨基酸和選自第9位、11位、12位、16位、18位、22位、23位、24位、26位、27位、30位、31位、33位、34位、35位、36位及37位氨基酸的1、2或3個(gè)氨基酸與天然的GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)位置的氨基酸不同。
其它優(yōu)選的式II的GLP-1化合物包括Val8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-37)OH，Glu22-GLP-1(7-37)OH，Asp22-GLP-1(7-37)OH，Arg22-GLP-1(7-37)OH，Lys22-GLP-1(7-37)OH，Cys22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Cys22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Cys22-GLP-1(7-37)OH，Glu22-GLP-1(7-36)OH，Asp22-GLP-1(7-36)OH，Arg22-GLP-1(7-36)OH，Lys22-GLP-1(7-36)OH，Cys22-GLP-1(7-36)OH，Val8-Glu22-GLP-1(7-36)OH，Val8-Asp22-GLP-1(7-36)OH，Val8-Arg22-GLP-1(7-36)OH，Val8-Lys22-GLP-1(7-36)OH，Val8-Cys22-GLP-1(7-36)OH，Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)OH，Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)OH，Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)OH，Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)OH，Gly8-Cys22-GLP-1(7-36)OH，Lys23-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH，His24-GLP-1(7-37)OH，Val8-His24-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His24-GLP-1(7-37)OH，Lys24-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH，Glu30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Asp30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Asp30-GLP-1(7-37)OH，Gln30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Gln30-GLP-1(7-37)OH，Tyr30-
GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH，Ser30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Ser30-GLP-1(7-37)OH，His30-GLP-1(7-37)OH，Val8-His30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His30-GLP-1(7-37)OH，Glu34-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu34-GLP-1(7-37)OH，Ala34-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ala34-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Ala34-GLP-1(7-37)OH，Gly34-GLP-1(7-37)OH，Val8-Gly34-GLP-l(7-37)OH，Gly8-Gly34-GLP-1(7-37)OH，Ala35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ala35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Ala35-GLP-1(7-37)OH，Lys35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys35-GLP-1(7-37)OH，His35-GLP-1(7-37)OH Val8-His35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His35-GLP-1(7-37)OH，Pro35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Pro35-GLP-1(7-37)OH，Glu35-GLP-1(7-37)OH Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH，和Gly8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH.
用于本發(fā)明的另一組優(yōu)選GLP-1類似物和衍生物由式VI(SEQ IDNO7)的分子組成R1-X-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Y-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-z-Phe-IIe-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2式 VI(SEQ ID NO7)其中R1選自L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，和α-甲基-組氨酸；X選自Ala，Gly，Val，Thr，Ile和α-甲基-Ala；Y選自Glu，Gln，Ala，Thr，Ser和Gly；Z選自Glu，Gln，Ala，Thr，Ser和Gly，并且R2是Gly-OH。
用于本發(fā)明的另一組優(yōu)選的GLP-1化合物公開(kāi)于WO 91/11457，并且基本由以下化合物組成GLP-1(7-34)，GLP-1(7-35)，GLP-1(7-36)，或GLP-1(7-37)，或其酰胺形式，及其可藥用鹽，它們具有選自下組的至少一種修飾(a)用甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，或D-賴氨酸取代第26位和/或34位的賴氨酸；或用甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，或D-精氨酸取代第36位的精氨酸。
(b)用抗氧化氨基酸取代第31位的色氨酸；(c)以下取代的至少一種用酪氨酸取代第16位的纈氨酸；用賴氨酸取代第18位的絲氨酸；用天冬氨酸取代第21位的谷氨酸；用絲氨酸取代第22位的甘氨酸；用精氨酸取代第23位的谷氨酰胺；用精氨酸取代第24位的丙氨酸；并且用谷氨酰胺取代第26位的賴氨酸，和(d)以下取代的至少-種用甘氨酸，絲氨酸，或半胱氨酸取代第8位的丙氨酸；用天冬氨酸，甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸取代第9位的谷氨酸；用絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸取代第10位的甘氨酸；用谷氨酸取代第15位的天冬氨酸；以及(e)用甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸，或組氨酸的D形式或N-?；蛲榛问饺〈?位的組氨酸；其中，當(dāng)取代為(a)，(b)，(d)，和(e)時(shí)，被取代的氨基酸可以任選為D形式，并且在第7位被取代的氨基酸可以任選為N-酰化或N-烷基化形式。
由于二肽基-肽酶IV(DPP IV)可以負(fù)責(zé)觀察到的所給予的GLP-1的迅速體內(nèi)滅活[見(jiàn)，例如，Mentlein，R.，et al.，Eur.J.Biochem.，214829-835(1993)]，在融合蛋白范圍內(nèi)防止了DPP IV活性的GLP-1類似物和衍生物是優(yōu)選的，其中的GLP-1化合物是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-37)OH，α-甲基-Ala8-GLP-1(7-37)OH，或Gly8-Gln21-GLP-1(7-37)OH的融合蛋白更優(yōu)選。
用于本發(fā)明的另一組優(yōu)選GLP-1化合物由美國(guó)專利5,512,549所要求保護(hù)的式VII(SEQ ID NO8)化合物組成，在此引入該文獻(xiàn)作為參考。
R1-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Xaa-Glu-phe-Ile-Ala30- 式VII (SEQ ID NO8)其中R1選自4-咪唑丙基，4-咪唑乙基，或4-咪唑-α，α二甲基-乙基，R2選自C6-C10未分支的?；虿淮嬖?；R3選自Gly-OH或NH2；并且Xaa是Lys或Arg。
用于本發(fā)明的更優(yōu)選的式IV化合物的Xaa是Arg，并且R2是C6-C10未分支的?；Ｓ糜诒景l(fā)明的甚至更優(yōu)選的式IV化合物的Xaa是Arg，R2是C6-C10未分支的?；⑶襌3是Gly-OH。用于本發(fā)明的高度優(yōu)選的式IV化合物的Xaa是Arg，R2是C6-C10未分支的?；琑3是Gly-OH，并且R1是4-咪唑丙基。用于本發(fā)明的尤其優(yōu)選的式IV化合物的Xaa是Arg，R2是C8未分支的?；?，R3是Gly-OH，并且R1是4-咪唑丙基。
優(yōu)選的GLP-1化合物包括GLP-1類似物，其中這些類似物或片段的主鏈在第8位含有除丙氨酸外的其他氨基酸(8位類似物)。主鏈的第7位也可包括L-組氨酸、D-組氨酸或修飾形式的組氨酸如脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基-組氨酸或α-甲基組氨酸。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些第8位類似物優(yōu)選含有在12、16、18、19、20、22、25、27、30、33和37位上進(jìn)行的一個(gè)或多個(gè)額外改變。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些第8位類似物更優(yōu)選含有在16、18、22、25和33位上進(jìn)行的一個(gè)或多個(gè)額外改變。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第12位的氨基酸選自色氨酸或酪氨酸。更優(yōu)選地，除了第12位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第12位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第16位的氨基酸被色氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸取代。更優(yōu)選地，除了第16位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第12位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。除了第16位和第8位的取代，第30位的氨基酸也優(yōu)選被谷氨酸取代。除了第16位和第8位的取代，第37位的氨基酸也優(yōu)選被組氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第18位的氨基酸選自色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，亮氨酸，或異亮氨酸，優(yōu)選色氨酸，酪氨酸，和異亮氨酸。更優(yōu)選地，除了第18位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第18位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。除了第18位和第8位的取代，第30位的氨基酸也優(yōu)選被谷氨酸取代。除了第18位和第8位的取代，第37位的氨基酸也優(yōu)選被組氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第19位的氨基酸選自色氨酸或苯丙氨酸，優(yōu)選色氨酸。更優(yōu)選地，除了第19位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第19位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。除了第19位和第8位的取代，第30位的氨基酸也優(yōu)選被谷氨酸取代。除了第19位和第8位的取代，第37位的氨基酸也優(yōu)選被組氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第20位的氨基酸選自苯丙氨酸，酪氨酸，或色氨酸。更優(yōu)選地，除了第20位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第20位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。除了第20位和第8位的取代，第30位的氨基酸也優(yōu)選被谷氨酸取代。除了第20位和第8位的取代，第37位的氨基酸也優(yōu)選被組氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第25位的氨基酸選自纈氨酸，異亮氨酸，和亮氨酸，優(yōu)選纈氨酸。更優(yōu)選地，除了第25位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第25位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。除了第25位和第8位的取代，第30位的氨基酸也優(yōu)選被谷氨酸取代。除了第25位和第8位的取代，第37位的氨基酸也優(yōu)選被組氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第27位的氨基酸選自異亮氨酸或丙氨酸。更優(yōu)選地，除了第26位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第27位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。除了第27位和第8位的取代，第30位的氨基酸也優(yōu)選被谷氨酸取代。除了第27位和第8位的取代，第37位的氨基酸也優(yōu)選被組氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，GLP-1類似物是GLP-1(7-37)OH，其中第33位的氨基酸是異亮氨酸。更優(yōu)選地，除了第33位的取代，第8位的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。甚至更優(yōu)選地，除了第33位和第8位的取代，第22位的氨基酸被谷氨酸取代。除了第33位和第8位的取代，第30位的氨基酸也優(yōu)選被谷氨酸取代。除了第33位和第8位的取代，第37位的氨基酸也優(yōu)選被組氨酸取代。
GLP-1化合物在以下一個(gè)或多個(gè)位置具有修飾8、12、16、18、19、20、22、25、27、30、33、和37。這些GLP-1化合物與GLP-1(7-37)OH相比效力增加，并且包含式IX(SEQ ID NO12)的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37式 IX(SEQ ID NO12)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是Phe，Trp，或Tyr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa18是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val；Xaa19是Tyr，Trp，或Phe；Xaa20是Leu，Phe，Tyr，或Trp；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa27是Glu，Ile，或Ala；Xaa30是Ala或Glu；Xaa33是Va1，或Ile；并且Xaa37是Gly，His，NH2，或不存在。
一些優(yōu)選的式IX的GLP-1化合物包括GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)-NH2，Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Tyr12-GLP-1(7-
37)OH，Val8-Tyr12-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr16-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Leu8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Ile8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Leu8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Ile8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Leu8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Ile8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Ser8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Thr8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Ser8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-Asp22-GLP-1(7-37)OH，Thr8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Ser8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Thr8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Glu22-GLP-1(7-37)OH，Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Asp22-GLP-1(7-37)OH，Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Lys22-GLP-1(7-37)OH，Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Leu8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Ile8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Ser8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Thr8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH，Val8-His37-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His37-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-His37-GLP-1(7-37)OH，Leu8-His37-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-His37-GLP-1(7-37)OH，Ile8-His37-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-His37-GLP-1(7-37)OH，Ser8-His37-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-His37-GLP-1(7-37)OH，Thr8-His37-GLP-1(7-36)NH2.
一些優(yōu)選的式IX的GLP-1化合物具有多個(gè)取代，包括GLP-1(7-37)OH，其中第8位是纈氨酸或甘氨酸，第22位是谷氨酸，第16位是酪氨酸，亮氨酸或色氨酸，第18位是酪氨酸，色氨酸，或異亮氨酸，第25位是纈氨酸，并且第33位是異亮氨酸。其它優(yōu)選的GLP-1化合物包括以下化合物Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Trp16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ile16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Trp18-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr18-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(7-37)OH，和Val8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)OH.
本發(fā)明的GLP-1化合物也包括Exendin化合物。Exendin-3和Exendin-4是首先從Helodermatidae蜥蜴毒液中分離的生物活性肽，并且證明其結(jié)合GLP-1受體并且在哺乳動(dòng)物體壁細(xì)胞中刺激cAMP-依賴性H+產(chǎn)生。Exendin-3和Exendin-4都是39個(gè)氨基酸的肽，大約53％同源于GLP-1。它們作為GLP-1活性的潛在激動(dòng)劑。引人注意的是，稱作Exendin(9-39個(gè)氨基酸)的Exendin的N端截短衍生物是Exendin-3，Exendin-4和GLP-1的抑制劑。
Exendin化合物通常包括具有Exendin-3，Exendin-4或其類似物或片段的氨基酸序列的多肽。Exendin-3和Exendin-4公開(kāi)于美國(guó)專利5,424,286。
Exendin-3具有SEQ ID NO9的氨基酸序列
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-40 41 42 43 44 45Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO9)Exendin-3具有SEQ ID NO10的氨基酸序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-40 41 42 43 44 45Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO10)GLP-1化合物也包括作為從Exendin或Exendin類似物的N末端和/或C末端截短一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的多肽的Exendin片段。此外，GLP-1化合物包括將一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加到Exendin或其片段的N末端和/或C末端得到的Exendin多肽。這種類型的Exendin化合物最多具有約45個(gè)氨基酸。
GLP-1化合物也稱作“Exendin類似物”。Exendin類似物與Exendin-4，Exendin-3或其片段具有足夠同源性，使得該類似物具有促胰島素活性。可以用例如EP 619,322和美國(guó)專利5,120,712中描述的體外測(cè)定方法評(píng)估Exendin片段和/或類似物的活性。
Exendin類似物優(yōu)選具有修飾的Exendin-4或其片段的氨基酸序列，使得1、2、3、4或5個(gè)氨基酸不同于Exendin-4或Exendin-4片段中相應(yīng)位置的氨基酸。在此處使用的命名系統(tǒng)中，取代氨基酸及其位置表示于母體結(jié)構(gòu)前。例如Val8-Exendin-4表示通常存在于Exendin-4第8位的甘氨酸被纈氨酸纈氨酸取代的Exendin化合物。
另一組優(yōu)選的GLP-1化合物由式VIII(SEQ ID NO11)的GLP-1/Exendin-4類似物組成。
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-R式 VIII(SEQ ID NO11)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，或Val；第16位的Xaa是Leu或Val；第18位的Xaa是Lys或Ser；第19位的Xaa是Gln或Tyr；第20位的Xaa是Met或Leu；第22位的Xaa是Glu或Gln；第23位的Xaa是Glu，或Gln；第25位的Xaa是Val或Ala；第26位的Xaa是Arg或Lys；第27位的Xaa是Leu或Glu；第30位的Xaa是Glu或Ala；第33位的Xaa是Val或Lys；第34位的Xaa是Asn或Lys；第36位的Xaa是Gly或Arg；并且第37位的R是Gly，Pro，Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，或不存在。該類中的18種不同的化合物見(jiàn)表6。
其它用于本發(fā)明的Exendin類似物描述于PCT專利申請(qǐng)WO99/25728(Beeleyetal.)，WO 99/25727 Beeley et al.)，WO 98/05351(Young et al.)，WO 99/40788(Young et al.)，WO 99/07404(Beeleyet al)，和WO 99/43708(Knudsen et al)。
本發(fā)明的GLP-1融合蛋白可以包含糖基化位點(diǎn)。糖基化是一種化學(xué)修飾，其中將糖部分添加到蛋白的特定位點(diǎn)。蛋白的糖基化在保證成熟蛋白的正確電荷、構(gòu)象和穩(wěn)定性以及將蛋白導(dǎo)向于細(xì)胞表面和蛋白的最終分泌中起作用。最重要的是，糖基化影響了許多蛋白的體內(nèi)清除速度。糖可以是O-連接的或N-連接的。一般地，O-連接的糖添加到絲氨酸和蘇氨酸的羥基氧，而N-連接的糖添加到天冬酰胺的酰胺氮。N糖基化的共有位點(diǎn)是Asn X1 X2其中X1是除Pro外的任何氨基酸，X2是Ser或Thr。
GLP-1化合物在體內(nèi)一般是不糖基化的；然而，令人感興趣的是，包含具有與Fc序列融合的C末端延伸片段的本發(fā)明的GLP-1化合物在C末端延伸片段的最后一個(gè)絲氨酸被糖基化(SSGAPPPS*)，并且在Fc的N末端區(qū)的第11位的蘇氨酸被糖基化(AEPKSCDKTHT*CPPC...)。
異源Fc融合蛋白此處描述的GLP-1化合物可以直接或通過(guò)肽接頭與免疫球蛋白的Fc部分融合。
免疫球蛋白是含有由二硫鍵連接在一起的多肽鏈的分子，一般具有兩條輕鏈和兩條重鏈。在每條鏈中，一個(gè)結(jié)構(gòu)域(V)具有依賴于分子的抗體特異性的可變氨基酸序列。另一結(jié)構(gòu)域(C)具有同一類分子所共有的恒定序列。
此處用到的免疫球蛋白的Fc部分具有免疫學(xué)領(lǐng)域術(shù)語(yǔ)的常用含義。具體地，該術(shù)語(yǔ)是指通過(guò)從抗體去除兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)(Fab片段)而得到的抗體片段。去除Fab片段的一種方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，F(xiàn)c部分是由兩條重鏈的恒定區(qū)的幾乎相等大小的片段形成的，這兩條鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)非共價(jià)相互作用和二硫鍵而締合。Fc部分可以包括鉸鏈區(qū)并且延伸通過(guò)CH2和CH3結(jié)構(gòu)域到達(dá)抗體C末端。人和小鼠免疫球蛋白的代表性鉸鏈區(qū)可以見(jiàn)Antibody Engineering，APractical Guide，Borrebaeck，C.A.K.，ed.，W.H.Freeman andCo.，1992，在此引入其教導(dǎo)作為參考。Fc部分可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。包含鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，以及第82位的一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的代表性Fc部分的氨基酸序列表示于圖1。
有5種具有不同作用和藥代動(dòng)力學(xué)特征的人免疫球蛋白Fc區(qū)IgG，IgA，IgM，IgD，和IgE。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白。IgG在所有免疫球蛋白中也是血清半衰期最長(zhǎng)的(23天)。與其它免疫球蛋白不同，IgG在與Fc受體結(jié)合后有效再循環(huán)。有四種IgG亞類G1，G2，G3，和G4，每一種都有不同的作用或功能。G1，G2和G3可以結(jié)合C1q并且固定補(bǔ)體，而G4則不能。盡管G3能夠比G1更有效地結(jié)合C1q，G1在介導(dǎo)補(bǔ)體導(dǎo)致的細(xì)胞裂解中最有效。IgG中的C1q結(jié)合位點(diǎn)位于CH2結(jié)構(gòu)域的羧基末端區(qū)。
所有的IgG亞類都能夠結(jié)合Fc受體(CD16，CD32，CD64)，G1和G3比G2和G4更有效。IgG的Fc受體結(jié)合區(qū)由位于CH2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)的殘基形成。
IgA可以以單體和由J鏈連接的二聚體形式存在。IgA是血清中其次多的Ig，但其半衰期只有6天。IgA具有三種作用或功能。它結(jié)合巨噬細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞上的IgA特異性受體，分別驅(qū)動(dòng)吞噬和脫顆粒。它也可通過(guò)未知的其它途徑固定補(bǔ)體。
IgM作為5聚體或6聚體表達(dá)，這兩者都由J鏈連接。IgM的血清半衰期為5天。它通過(guò)位于其CH3結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點(diǎn)與C1q微弱結(jié)合。IgD的血清半衰期為3天。還不清楚這種Ig的作用或功能。IgG是單體Ig，血清半衰期為2.5天。IgE與兩個(gè)Fc受體結(jié)合，驅(qū)動(dòng)脫顆粒并導(dǎo)致促炎劑的釋放。
根據(jù)需要的體內(nèi)作用，本發(fā)明的異源融合蛋白可以任何上述同種型或可以含有突變的Fc區(qū)，其中補(bǔ)體和/或Fc受體結(jié)合功能改變。這樣，本發(fā)明的異源融合蛋白可以含有與GLP-1化合物融合的免疫球蛋白的完整Fc部分、免疫球蛋白Fc部分的片段或其類似物。
本發(fā)明的融合蛋白可以由單鏈蛋白組成或作為多鏈多肽?？梢援a(chǎn)生兩個(gè)或多個(gè)Fc融合蛋白，使得它們通過(guò)在Fc區(qū)之間天然形成的二硫鍵而相互作用。這些多聚體對(duì)于GLP-1化合物來(lái)說(shuō)可以是同源的，或者它們可以含有不同的GLP-1化合物，所述化合物融合在融合蛋白的Fc部分N末端。
不論融合蛋白的最終結(jié)構(gòu)如何，F(xiàn)c或Fc樣區(qū)域必須延長(zhǎng)在N末端融合的GLP-1化合物的體內(nèi)血漿半衰期。此外，融合的GLP-1化合物必須保持一定的生物學(xué)活性?？梢杂脤?shí)施例7描述的方法證明半衰期的增加，其中比較了融合蛋白和單獨(dú)的GLP-1化合物的半衰期?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的體外和體內(nèi)方法確定生物學(xué)活性。代表性的生物測(cè)定描述于實(shí)施例6、8和9。
由于通過(guò)蛋白水解產(chǎn)生的IgG的Fc區(qū)與完整的IgG分子具有相同的體內(nèi)半衰期，并且Fab片段迅速降解，人們認(rèn)為延遲半衰期的相關(guān)序列存在于CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。此外，文獻(xiàn)中證明，不結(jié)合高親和性Fc受體或C1q的IgG變體的分解代謝速度與母體野生型抗體的清除速度相似，表明分解代謝位點(diǎn)不同于參與Fc受體或C1q結(jié)合的位點(diǎn)。[Wawrzynczak et al.，(1992)Molecular Immunology 29221]。采用鼠IgG1 Fc區(qū)進(jìn)行的定點(diǎn)誘變表明，控制分解代謝速度的IgG1 Fc區(qū)的位點(diǎn)位于CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的界面。
基于這些研究，可以在分解代謝位點(diǎn)修飾Fc區(qū)，以便優(yōu)化融合蛋白的半衰期。用于本發(fā)明的異源融合蛋白的Fc區(qū)優(yōu)選來(lái)源于IgG1或IgG4的Fc區(qū)。Fc區(qū)甚至更優(yōu)選是IgG4或來(lái)源于IgG4。IgG Fc區(qū)優(yōu)選含有CH2和CH3區(qū)，包括鉸鏈區(qū)。
異源白蛋白融合蛋白上述GLP-1化合物可以直接或通過(guò)肽接頭與白蛋白或其類似物、片段或衍生物融合。
構(gòu)成本發(fā)明的融合蛋白的一部分的白蛋白一般可以來(lái)源于從任何物種克隆的白蛋白。然而，人白蛋白及其片段和類似物優(yōu)選減少融合蛋白在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性的危險(xiǎn)。人血清白蛋白(HSA)由單個(gè)未糖基化的585個(gè)氨基酸的多肽鏈組成，式分子量為66,500。人HSA的氨基酸序列見(jiàn)圖2。[見(jiàn)Meloun，et al.(1975)FEBS Letters 58136；Behrens，et al.(1975)Fed.Proc.34591；Lawn，et al.(1981)Nucleic Acids Research 96102-6114；Minghetti，et al.(1986)J.Biol.Chem.2616747]。已經(jīng)描述了白蛋白的多種多形性變體以及類似物和片段。[見(jiàn)Weitkamp，et al.，(1973)Ann.Hum.Genet.37219]。例如，在EP 322,094中，發(fā)明人公開(kāi)了HSA的各種較短形式。這些片段中的一些包括HSA(1-373)，HSA(1-388)，HSA(1-389)，HSA(1-369)，和HSA(1-419)以及1-369和1-419之間的片段。EP 399,666公開(kāi)了包括HSA(1-177)和HSA(1-200)的片段以及HSA(1-177)和HSA(1-200)之間的片段。
可以理解，本發(fā)明的異源融合蛋白包含與任何白蛋白，包括其片段、類似物和衍生物偶聯(lián)的GLP-1化合物，其中該融合蛋白具有生物學(xué)活性并且比單獨(dú)的GLP-1化合物具有更長(zhǎng)的血漿半衰期。因此，融合蛋白的白蛋白部分不必須具有等于天然人白蛋白的血漿半衰期。半衰期比天然人白蛋白和感興趣的GLP-1化合物長(zhǎng)，或半衰期介于兩者之間的片段、類似物和衍生物是公知的，或可以產(chǎn)生。
本發(fā)明的異源融合蛋白包括在融合蛋白的GLP-1化合物和/或白蛋白部分中具有保守氨基酸取代的蛋白?！氨Ｊ厝〈笔侵咐昧硪粋€(gè)與被取代氨基酸具有相同凈電荷和具有大約相同大小和形狀的氨基酸來(lái)取代此氨基酸。當(dāng)它們側(cè)鏈上的碳原子和雜原子總數(shù)相差不超過(guò)4個(gè)時(shí)，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸側(cè)鏈的氨基酸大致上是大小相同的。當(dāng)它們側(cè)鏈上的分支數(shù)目相差不超過(guò)1個(gè)時(shí)，它們大致具有相同的形狀。側(cè)鏈上具有苯基或取代苯基的氨基酸可認(rèn)為是大小和形狀大約相同的。除非特別指明，保守取代優(yōu)選通過(guò)天然氨基酸來(lái)進(jìn)行。
然而，此處的“氨基酸”是在其最廣泛的含義中使用的，包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸，包括氨基酸類似物和衍生物。后者包括含氨基酸部分的分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，根據(jù)該廣義的定義，此處的氨基酸包括，例如天然存在的形成蛋白的L-氨基酸；D-氨基酸；化學(xué)修飾的氨基酸，例如氨基酸類似物和衍生物；天然存在的氨基酸不形成蛋白的氨基酸，例如正亮氨酸、β-丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、GABA等；以及具有本領(lǐng)域公知的氨基酸特征的化學(xué)合成的化合物。此處用到的術(shù)語(yǔ)“形成蛋白的”表示氨基酸可以通過(guò)代謝途徑摻入細(xì)胞中的肽、多肽或蛋白。
非天然氨基酸，包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸插入本發(fā)明的異源融合蛋白可以通過(guò)許多途徑帶來(lái)益處。含有D-氨基酸的肽等與含有L-氨基酸的對(duì)應(yīng)物相比，表現(xiàn)出體外或體內(nèi)穩(wěn)定性增加。因此，當(dāng)需要或要求更大的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性時(shí)，肽的構(gòu)建，例如摻入D-氨基酸是特別有用的。更具體地，D-肽等抗內(nèi)源性肽酶和蛋白酶活性，從而在需要時(shí)改進(jìn)分子的生物利用度和延長(zhǎng)體內(nèi)壽命。此外，D-肽等不能進(jìn)行有效加工以用于向T輔助細(xì)胞進(jìn)行II類主要組織相容性復(fù)合物限制的呈遞，因此，不容易在整個(gè)生物體內(nèi)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。
本發(fā)明除了包括各種多肽的結(jié)構(gòu)/功能分析，選擇用于取代的氨基酸還可以考慮許多因素，進(jìn)行這種改變的一個(gè)可以考慮的因素時(shí)氨基酸的親水指數(shù)。親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白上相互作用的生物功能方面的重要性由Kyte和Doolittle進(jìn)行了討論(1982，J.Mol.Biol.，157105-132)。已知氨基酸的相對(duì)親水特征是由于得到的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這隨后影響了蛋白與酶、底物、受體、配體、DNA、抗體、抗原等分子的相互作用。根據(jù)其疏水性和電荷特征，賦予每個(gè)氨基酸以下親水指數(shù)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
如本領(lǐng)域所公知，可以用具有相似親水指數(shù)或評(píng)分的其它氨基酸取代肽、多肽或蛋白中的某些氨基酸，以產(chǎn)生例如具有相似或甚至改進(jìn)的生物活性的肽。在進(jìn)行這種改變時(shí)，優(yōu)選用具有±2以內(nèi)的親水指數(shù)的氨基酸互相取代。更優(yōu)選的取代是其中的氨基酸具有±1以內(nèi)的親水指數(shù)。最優(yōu)選的取代是其中的氨基酸具有±0.5以內(nèi)的親水指數(shù)。
氨基酸也可以根據(jù)親水性進(jìn)行取代。美國(guó)專利4,554,101公開(kāi)了蛋白的最大局部平均親水性，這是由其鄰近的氨基酸的親水性決定的，并且與蛋白的生物特征相關(guān)。賦予氨基酸以下親水性值精氨酸/賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.01)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.51)；丙氨酸/組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。因此，可以用具有相似親水性評(píng)分的其它氨基酸取代肽、多肽或蛋白中的氨基酸，以產(chǎn)生例如具有相似的生物活性，即仍然保持正確的生物功能的肽。在進(jìn)行這種改變時(shí)，優(yōu)選用具有±2以內(nèi)的親水指數(shù)的氨基酸互相取代。更優(yōu)選±1以內(nèi)，最優(yōu)選±0.5以內(nèi)。
如前面所概括，本發(fā)明的融合蛋白中的氨基酸取代可以基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。此外，可以基于二級(jí)機(jī)構(gòu)特征進(jìn)行取代。例如，可以用保持螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸取代螺旋狀氨基酸。例如，考慮前面的特征以產(chǎn)生在肽中導(dǎo)致沉默改變的保守氨基酸改變的示例性的取代可以選自該天然存在的氨基酸所屬類中的其它成員。氨基酸可以分成以下四組(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。
制備本發(fā)明的異源融合蛋白的一般方法盡管可以用各種不同的方法制備本發(fā)明的異源融合蛋白，重組方法是優(yōu)選的。對(duì)于此處公開(kāi)和要求保護(hù)的本發(fā)明，如下定義了以下通用的分子生物學(xué)術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)。除非特別指定，本文中使用的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)具有其通常的含義。例如，“℃”表示攝氏度；＂mmol＂表示毫摩爾；＂mg＂表示毫克；＂μg＂表示微克；＂ml或mL＂表示毫升；＂μl或μL＂表示微升。氨基酸縮寫(xiě)闡述于37 C.F.R.ζ1.822(b)(2)(1994)。
此處用到的“堿基對(duì)”或＂bp＂是指DNA或RNA。當(dāng)存在于DNA分子中時(shí)，縮寫(xiě)A，C，G和T分別對(duì)應(yīng)于脫氧核糖核苷(脫氧)腺苷、(脫氧)胞苷、(脫氧)鳥(niǎo)苷和胸苷的5′-單磷酸酯形式。當(dāng)存在于RNA分子中時(shí)，縮寫(xiě)U，C，G，和A分別對(duì)應(yīng)于核糖核苷尿苷、胞苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的5′-單磷酸酯形式。在雙鏈DNA中，堿基對(duì)可以指A與T或C與G的配對(duì)關(guān)系。在DNA/RNA中，異雙鏈體堿基對(duì)可以指A與U或C與G的配對(duì)關(guān)系。(見(jiàn)下文中“互補(bǔ)”的定義)。
DNA的“消化”或“限制”是指用僅僅作用于DNA中的某些序列的限制酶(“序列特異性內(nèi)切核酸酶”)對(duì)DNA進(jìn)行催化性裂解。此處用到的各種限制酶是可買(mǎi)到的，并且按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的內(nèi)容使用它們的反應(yīng)條件、輔因子和其它要求。用于特定限制酶的適當(dāng)緩沖液和底物量是由生產(chǎn)商規(guī)定的，或可以很容易在文獻(xiàn)中找到。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。除非特別指出，可以用DNA裂解酶，如T4 DNA裂解酶，采用已知的緩沖液和條件完成連接。
“質(zhì)?！笔侵溉旧w外(通常)自我復(fù)制的遺傳元件。質(zhì)粒一般由小寫(xiě)字母“p”和其后的字母和/或數(shù)字表示。此處的起始質(zhì)粒是購(gòu)買(mǎi)的、可以有限地公共獲得的，或者可根據(jù)公開(kāi)的程序用可得到的質(zhì)粒構(gòu)建。此外，與描述的質(zhì)粒等同的質(zhì)粒是公知的，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
此處用到的“重組DNA克隆載體”是指任何自主復(fù)制的因子，包括但不限于質(zhì)粒和噬菌體，包含可以或已經(jīng)添加的一個(gè)或多個(gè)額外的DNA片段的DNA分子。
此處用到的“重組DNA表達(dá)載體”是指任何DNA克隆載體，其中摻入了控制插入的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
“轉(zhuǎn)錄”是指一種使DNA的核苷酸序列中含有的信息轉(zhuǎn)移到互補(bǔ)的RNA序列的過(guò)程。
“轉(zhuǎn)染”是指用宿主細(xì)胞攝取表達(dá)載體，而不論實(shí)際上是否表達(dá)任何編碼序列。許多轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔。成功的轉(zhuǎn)染一般是當(dāng)指示該載體的操作在宿主細(xì)胞發(fā)生時(shí)被識(shí)別。
“轉(zhuǎn)化”是指將DNA導(dǎo)入生物體，使得DNA可以作為染色體外元件或通過(guò)染色體整合而復(fù)制。轉(zhuǎn)化細(xì)菌和真核宿主的方法是本領(lǐng)域公知的，例如核注射、原生質(zhì)體融合或用氯化鈣進(jìn)行鈣處理，這些方法概括于J.Sambrook，et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，(1989)。一般地，當(dāng)將DNA導(dǎo)入酵母時(shí)，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)化與術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)染的含義相反。
此處用到的“翻譯”是指用信使RNA(mRNA)的遺傳信息指定和指導(dǎo)多肽鏈合成的過(guò)程。
“載體”是指用于基因操作中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)化的核酸復(fù)合物，其攜帶對(duì)應(yīng)于適當(dāng)?shù)牡鞍追肿拥亩嗪塑账嵝蛄?，該序列適當(dāng)?shù)目刂菩蛄薪Y(jié)合時(shí)，則賦予被轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞特定的屬性。質(zhì)粒、病毒和噬菌體是適當(dāng)?shù)妮d體。通過(guò)使用限制酶和連接酶從不同來(lái)源切割和連接DNA分子而構(gòu)建人工載體。此處用到的術(shù)語(yǔ)“載體”包括重組DNA克隆載體和重組DNA表達(dá)載體。
此處用到的“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)”是指在雙鏈核酸中通過(guò)氫鍵締合的堿基對(duì)(嘌呤和嘧啶)。以下堿基對(duì)是互補(bǔ)的鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
這里用到的“雜交”是指一條核酸鏈通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈連接。兩條不相同但非常相似的互補(bǔ)核酸的雜交所使用的條件根據(jù)兩條鏈的互補(bǔ)程度和鏈長(zhǎng)而改變。這種技術(shù)和條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
“分離的氨基酸序列”是指任意的位置上不同于天然存在的氨基酸的構(gòu)建的或合成的氨基酸序列。
“分離的DNA復(fù)合物”是指任意的位置上不同于其在基因組中的天然位置的構(gòu)建的或合成的DNA序列。
“分離的核酸復(fù)合物”是指任意的位置上不同于其天然位置的構(gòu)建的或合成的RNA或DNA序列。
“引物”是指作為用于酶促或合成延伸的起始底物的核酸片段。
“啟動(dòng)子”是指直到從DNA轉(zhuǎn)錄為RNA的DNA序列。
“探針”是指與另一種核酸復(fù)合物雜交的核酸復(fù)合物或其片段。
雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格性”可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地判斷，并且一般是根據(jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度而進(jìn)行的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算值。一般地，較長(zhǎng)的探針需要較高的溫度進(jìn)行適當(dāng)退火，而短探針需要較低的溫度。雜交一般取決于互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)變性的DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列間需要的同源性程度越高，可以使用的相對(duì)溫度越高。因此，越高的相對(duì)溫度將使反應(yīng)更嚴(yán)格，而較低的溫度使嚴(yán)格性更低。對(duì)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見(jiàn)Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Intersciernce Publishers，1995。
此處定義的“嚴(yán)格條件”或“高嚴(yán)格性條件”可以通過(guò)以下條件鑒定(1)使用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，50℃；(2)在雜交中使用變性劑，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficol1/01％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5，750mM氯化鈉/75mM檸檬酸鈉，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5×SSC(750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5×Denhardt′s溶液，超聲波處理的鮭魚(yú)精子DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，42℃，在42℃，0.2×SSC(30mM氯化鈉/3mM檸檬酸鈉)，和55℃，50％甲酰胺中洗滌，然后在55℃用含EDTA的0.1×SSC進(jìn)行高嚴(yán)格性洗滌。
“中等嚴(yán)格條件”可以通過(guò)ambrook et al.[Molecular CloningA Laboratory Manual，New YorkCold Spring Harbor Press，(1989)]中的描述進(jìn)行鑒定，并且包括使用比上述嚴(yán)格性低的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是在37℃，在含有20％甲酰胺、5×SSC(750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉)，50mM pH7.6的磷酸鈉，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸右旋糖苷和20mg/mL變性的剪切的鮭魚(yú)精子DNA的溶液中孵育過(guò)夜，然后在37-50℃，在1×SSC中洗滌濾器。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等，以及必要時(shí)調(diào)節(jié)探針長(zhǎng)度等因子。
＂PCR＂是指公知的使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
“前導(dǎo)序列”是指可以酶促或化學(xué)去除以產(chǎn)生需要的感興趣多肽的氨基酸序列。
“分泌信號(hào)序列”是指一般存在于較大的多肽N末端區(qū)的氨基酸序列，其功能是起始該多肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞膜腔室的締合和該多肽通過(guò)漿膜的分泌。
構(gòu)建編碼本發(fā)明的異源融合蛋白的DNA可以從各種來(lái)源獲得野生型白蛋白和免疫球蛋白。例如，這些蛋白可以從由以可檢測(cè)水平表達(dá)感興趣的mRNA的組織或細(xì)胞制備的cDNA文庫(kù)獲得。可以用特定的感興趣蛋白的公開(kāi)DNA或蛋白序列設(shè)計(jì)探針，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。例如，免疫球蛋白輕鏈或重鏈恒定區(qū)描述于Adams，et al.(1980)Biochemistry 192711-2719；Goughet，et al.(1980)Biochemistry 192702-2710；Dolby，et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 776027-6031；Rice et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 797862-7862；Falkner，et al.(1982)Nature 298286-288；和Morrison，et al.(1984)Ann.Rev.Immunol.2239-256。一些參考文獻(xiàn)公開(kāi)了白蛋白的蛋白和DNA序列，包括Meloun，et al.(1975)FEBS Letters 58136；Behrens，et al.(1975)Fed.Proc.34591；Lawn，et al.(1981)Nucleic Acids Research96102-6114；和Minghetti，et al.(1986)J.Biol.Chem.2616747。
可以采用標(biāo)準(zhǔn)程序，用選擇的探針篩選cDNA或基因組文庫(kù)，例如描述于Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989)中的程序。分離編碼白蛋白或免疫球蛋白的基因的另一種方法是采用PCR方法[Sambrook et al.，supra；Dieffenbach et al.，PCR PrimerALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1995)]?？梢愿鶕?jù)公開(kāi)的序列設(shè)計(jì)PCR引物。
從特定物種克隆的全長(zhǎng)野生型序列一般可以作為模板，用于產(chǎn)生保留賦予作為融合蛋白的一部分的GLP-1化合物更長(zhǎng)的血漿半衰期的能力的類似物、片段和衍生物。本發(fā)明的異源融合蛋白的Fc和白蛋白部分優(yōu)選來(lái)源于天然人序列，以減少融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性危險(xiǎn)。
具體地，本發(fā)明包括的融合蛋白的免疫球蛋白部分優(yōu)選僅包含免疫球蛋白的Fc片段。根據(jù)融合蛋白的所需特定作用或功能以及結(jié)構(gòu)特征，F(xiàn)c片段可以含有鉸鏈區(qū)以及CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或一些其它組合。可以使用設(shè)計(jì)為與相應(yīng)于片段的所需末端的序列雜交的引物，采用PCR技術(shù)產(chǎn)生這些Fc片段。
可以通過(guò)各種不同的方法，包括上述克隆方法和化學(xué)合成DNA的方法制備編碼本發(fā)明的GLP-1化合物的DNA。如果所編碼的肽較短，則化學(xué)合成更好。GLP-1的氨基酸序列和前胰高血糖素原基因已經(jīng)公開(kāi)[Lopez，et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 805485-5489；Bell，et al.(1983)Nature，302716-718；Heinrich，G.，et al.(1984)Endocrinol，1152176-2181；Ghiglione，M.，et al.(1984)Diabetologia 27599-600]。因此，可以設(shè)計(jì)引物以便對(duì)天然GLP-1化合物及其片段進(jìn)行PCR。
然后可以通過(guò)框內(nèi)連接編碼GLP-1化合物的DNA與編碼白蛋白或Fc部分的DNA而構(gòu)建編碼融合蛋白的基因。也可以通過(guò)編碼接頭肽的基因框內(nèi)連接編碼GLP-1化合物的基因與編碼白蛋白或Fc部分的基因。
可以通過(guò)添加小肽接頭以防止?jié)撛诘牟幌Ｍ慕Y(jié)構(gòu)域相互作用而對(duì)本發(fā)明的異源融合蛋白的體內(nèi)功能和穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化。盡管這些接頭可以是任意長(zhǎng)度并且由任意氨基酸組合組成，其長(zhǎng)度優(yōu)選不超過(guò)防止不希望的結(jié)構(gòu)域相互作用和/或優(yōu)化生物功能和/或穩(wěn)定性所必須的長(zhǎng)度。一般地，接頭不應(yīng)該含有具有極大側(cè)鏈的氨基酸或容易誘導(dǎo)顯著的二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸。接頭優(yōu)選富含絲氨酸-甘氨酸，并且其長(zhǎng)度優(yōu)選不超過(guò)30個(gè)氨基酸。接頭的長(zhǎng)度更優(yōu)選不超過(guò)20個(gè)氨基酸。接頭的長(zhǎng)度甚至更優(yōu)選不超過(guò)15個(gè)氨基酸。優(yōu)選的接頭含有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的重復(fù)。優(yōu)選有2-6個(gè)該序列的重復(fù)。甚至更優(yōu)選有3-4個(gè)該序列的重復(fù)。
編碼野生型GLP-1、白蛋白及其Fc多肽和片段的DNA可以在連接之前或在編碼整個(gè)融合蛋白的cDNA的范圍內(nèi)進(jìn)行突變。多種誘變技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。例如，利用鏈重疊延伸以制備用于改變相應(yīng)蛋白中的特定氨基酸序列的特定堿基突變的誘變PCR方法。該P(yáng)CR誘變要求使用四種引物，兩個(gè)前向(引物A和C)和兩個(gè)反向(引物B和D)。在兩個(gè)不同階段中從野生型模板擴(kuò)增突變的基因。第一個(gè)反應(yīng)通過(guò)進(jìn)行A到B反應(yīng)和獨(dú)立的C到D反應(yīng)將基因分成兩半進(jìn)行擴(kuò)增，其中B和C引物定向于待突變的基因區(qū)域。當(dāng)將這些引物與靶區(qū)域比對(duì)時(shí)，它們含有被定向進(jìn)行改變的堿基的錯(cuò)配。一旦完成了A到B和C到D反應(yīng)，分離反應(yīng)產(chǎn)物并且進(jìn)行混合，用作A到D反應(yīng)的模板。該反應(yīng)然后產(chǎn)生完整的突變產(chǎn)物。
一旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的基因，它可以被克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。可以用于制備本發(fā)明的GLP-1融合蛋白的特定策略描述于實(shí)施例1。
用于重組表達(dá)本發(fā)明的異源融合蛋白的一般方法用此處描述的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，用于產(chǎn)生異源融合蛋白，并且在適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子的改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要過(guò)多實(shí)驗(yàn)就可以選擇培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH等。概言之，用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的原則、方案和實(shí)用技術(shù)可以參見(jiàn)MammalianCell BiotechnologyA Practical Approach，M.Butler，ed.(IRLPress，1991)和Sambrook，et al.，supra。轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如CaPO4和電穿孔。宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面描述于美國(guó)專利4,399,216。一般根據(jù)van Solingen et al.，J Bact.130(2)94 6-7(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(8)3829-33(1979)的方法轉(zhuǎn)化至酵母。然而，也可以使用其它用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法，例如核微量注射、電穿孔、與完整細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌原生質(zhì)體融合或多陽(yáng)離子，如polybrene或polyomithine。對(duì)于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)，參見(jiàn)Keown，et al.，Methods in Enzymology185527-37(1990)和Mansour，et al.，Nature 336(6197)348-52(1988)。
用于在此處的載體中克隆或表達(dá)核酸(如DNA)的適當(dāng)宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。適當(dāng)?shù)脑思?xì)胞包括，但不限于真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物，例如腸細(xì)菌，如大腸桿菌?？梢怨驳玫礁鞣N大腸桿菌株，例如大腸桿菌K12株MM294(ATCC 31.446)；大腸桿菌X1 776(ATCC 31.537)；大腸桿菌株W3 110(ATCC27.325)和K5772(ATCC 53.635)。其它適當(dāng)?shù)恼婧怂拗骷?xì)胞包括腸細(xì)菌，如埃希氏菌，如大腸桿菌，腸桿菌，歐文氏菌，克雷白氏菌，變形菌，沙門(mén)氏菌如傷寒沙門(mén)氏菌，沙雷氏菌如粘質(zhì)沙雷氏菌，和志賀氏菌，以及芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(如公開(kāi)于1989年4月12日發(fā)表的DD266，710的地衣芽孢桿菌41P)，假單孢菌如銅綠假單孢菌和鏈霉菌。這些例子是說(shuō)明性的，而不是限制性的。菌株W3110是特別優(yōu)選的宿主或親代宿主，因?yàn)樗怯糜谥亟MDNA產(chǎn)物發(fā)酵的常用宿主株。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以對(duì)菌株W3110進(jìn)行修飾以在編碼宿主的內(nèi)源蛋白的基因中實(shí)現(xiàn)基因突變，所述宿主的例子包括具有完整的基因型ronA的大腸桿菌W3110菌株1A2；具有完整的基因型ton4 ptr3的大腸桿菌W3110菌株9E4；具有完整的基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degPompT/can′的大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)；大腸桿菌W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP缺失突變的菌株37D6；以及具有1990年8月7日授權(quán)的美國(guó)專利4,946,783公開(kāi)的突變周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌株。或者，PCR或其它核酸聚合酶反應(yīng)等體內(nèi)克隆方法是適用的。
除原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母是融合蛋白載體的適當(dāng)克隆或表達(dá)宿主。啤酒糖酵母是常用的低等真核宿主微生物。其它包括粟酒裂殖糖酵母[Beach and Nurse，Nature 290140-3(1981)；EP 139,383 published 2 May 1995]；Muyveromyces宿主[美國(guó)專利4,943,529；Fleer，et al.，Biol Technology 9(10)968-75(1991)]，如克魯維氏酵母(MW98-8C，CBS683，CBS4574)[de Louvencourt etal.，J.Bacteriol.154(2)737-42(1983)]；脆壁克魯維氏酵母(ATCC 12，424)，保加利亞克魯維氏酵母(ATCC 16,045)，威克曼氏克魯維氏酵母(ATCC 24,178)，waltii克魯維氏酵母(ATCC 56,500)，果蠅克魯維氏酵母(ATCC 36.906)[Van den Berg et al.，BiolTechnology8(2)135-9(1990)]；thermotoierans克魯維氏酵母和馬克斯克魯維氏酵母；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德畢赤氏酵母(EP 183,070)[Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.28(4)265-78(1988)]；假絲酵母；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉[Case，et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 76(10)5259-63(1979)]；許旺氏酵母如西方許旺氏酵母(1990年10月31日公開(kāi)的EP 394,538)和絲狀真菌如鏈孢霉、青霉、Tolypocladium(1991年1月10日公開(kāi)的WO 91/00357)；和曲霉宿主如構(gòu)巢曲霉[Ballance et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.112(1)284-9(1983)]；Tilburn，et al.，Gene 26(2-3)205-21(1983)；Yelton，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(5)1470-4(1984)]和黑曲霉[Kelly and Hynes，EMBOJ.4(2)475-9(1985)]。嗜甲烷(Methylotropic)酵母選自以下屬漢遜氏酵母屬、假絲酵母屬、克氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、啤酒糖酵母屬、球擬酵母屬和紅酵母屬。這種類型的酵母的示例性具體物種的列表可以見(jiàn)C.Antony，The Biochemistry of Methylotrophs 269(1982)。
用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的適當(dāng)宿主細(xì)胞來(lái)源于多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎細(xì)胞的例子包括昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2和夜蛾，夜蛾high5和植物細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)和COS細(xì)胞。更具體的例子包括SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚腎細(xì)胞系[亞克隆的用于在懸浮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的293或293細(xì)胞，Graham，et al.，J.Gen Tirol.，36(1)59-74(1977)]；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR[CHO，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(7)4216-20(1980)]；小鼠支持細(xì)胞[TM4，Mather，Biol.Reprod.23(1)243-52(1980)]；人肺細(xì)胞(W138.ATCC CCL75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)和小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)。適當(dāng)宿主細(xì)胞的選擇被認(rèn)為在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的融合蛋白可以直接重組產(chǎn)生，或作為具有信號(hào)序列或其它序列的蛋白產(chǎn)生，所述序列在成熟融合蛋白的N末端產(chǎn)生特異性裂解位點(diǎn)。概言之，信號(hào)序列可以是載體的一種成分，或者它可以是插入載體的融合蛋白的編碼DNA的一部分。信號(hào)序列可以是從例如堿性磷酸酶、青霉素酶1pp，或耐熱腸毒素II前導(dǎo)序列中選擇的原核信號(hào)序列。對(duì)于酵母分泌，信號(hào)序列可以是，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，α因子前導(dǎo)序列(包括啤酒糖酵母和克魯維氏酵母cc因子前導(dǎo)序列，后者描述于美國(guó)專利5,010,182)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，C.albicans葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP 362,179)或描述于WO 90/13646中的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列指導(dǎo)蛋白分泌，例如來(lái)自于相同或相關(guān)物種的分泌多肽的信號(hào)序列和病毒的分泌性前導(dǎo)序列。
表達(dá)和克隆載體都含有使載體能夠在一個(gè)或多個(gè)選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。這種序列在多種細(xì)菌、酵母和病毒中都是公知的。來(lái)自于質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2u質(zhì)粒起點(diǎn)適于酵母，各種病毒(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)起點(diǎn)適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。
表達(dá)和克隆載體一般含有選擇基因，也稱作可選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼具有以下特征的蛋白(a)賦予抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素抗性，(b)補(bǔ)充自養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)補(bǔ)充復(fù)合培養(yǎng)基所不能得到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)，如編碼芽孢桿菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的適當(dāng)可選擇標(biāo)記的例子是使得能夠鑒定可以攝取融合蛋白的編碼核酸的細(xì)胞的標(biāo)記，如DHFR或胸苷激酶。使用野生型DHFR時(shí)的適當(dāng)宿主細(xì)胞是缺乏DHFR活性的CHO細(xì)胞系，其制備和增殖方法如[Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(7)4216-20(1980)]的描述。用于酵母的適當(dāng)選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb，et al.，Nature 282(5734)39-43(1979)；Kingsman，et al.，Gene 7(2)141-52(1979)；Tschumper，et al.，Gene 10(2)157-66(1980)]。trp1基因提供了用于缺乏在色氨酸中生長(zhǎng)的能力的突變酵母株，例如ATCC No.44076或PEPC1[Jones，Genetics 8523-33(1977)]的選擇標(biāo)記。
表達(dá)和克隆載體通常含有與編碼融合蛋白的核酸序列可操作性連接的啟動(dòng)子，以指導(dǎo)mRNA合成。通過(guò)各種可能的宿主細(xì)胞識(shí)別啟動(dòng)子是公知的。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)[Chang，et al.，Nature 275(5681)617-24(1978)；Goeddel，et al.，Nature 281(5732)544-8(1979)]，堿性磷酸酶，色氨酸(上游)啟動(dòng)子系統(tǒng)[Goeddel，Nucleic Acids Res.8(18)4057-74(1980)；1981年9月30日公開(kāi)的EP 36,776]，以及雜交啟動(dòng)子如tat啟動(dòng)子[deBoer，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1)21-5(1983)]。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子也將包含與編碼融合蛋白的DNA可操作性連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于酵母宿主的適當(dāng)啟動(dòng)子序列的例子包括3-磷酸甘油酯激酶的啟動(dòng)子[Hitzeman，et al.，J.Biol.Chem.255(24)12073-80(1980)]或其它糖裂解酶[Hess et al.，J.Adv.Enzyme Reg.7149(1968)；Holland，Biochemistry 17(23)49007(1978)]，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酯變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其它具有由生長(zhǎng)條件控制的額外轉(zhuǎn)錄優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。用于酵母表達(dá)的適當(dāng)載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步描述于EP73,657?？梢酝ㄟ^(guò)從多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥(niǎo)類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)等病毒基因組獲得的啟動(dòng)子、異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子和熱激啟動(dòng)子控制從哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的載體轉(zhuǎn)錄編碼融合蛋白的mRNA，前提是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
可以通過(guò)在載體中插入增強(qiáng)子序列增加高等真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄編碼融合蛋白的多核苷酸。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10-300bp，作用于啟動(dòng)子以增加其轉(zhuǎn)錄。已知許多來(lái)自于哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-酮蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。然而，一般地，將使用來(lái)自于真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。其例子包括復(fù)制起點(diǎn)近側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，復(fù)制起點(diǎn)近側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以剪切為位于融合蛋白編碼序列5’或3’的載體中，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子5’方向的位點(diǎn)。
用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體也將含有轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必須的序列。這些序列通常可以從真核細(xì)胞或病毒DNAs或cDNAs的5’區(qū)和偶然從其3’非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)在編碼融合蛋白的mRNA的非翻譯部分中含有轉(zhuǎn)錄為聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
可以從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解物中回收各種形式的融合蛋白。如果是膜包圍的，可以使用適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┤芤?例如Triton-X 100)或通過(guò)酶裂解而從膜中釋放。在融合蛋白的表達(dá)中使用的細(xì)胞可以通過(guò)各種物理或化學(xué)方法破壞，例如凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞或細(xì)胞裂解劑。
純化本發(fā)明的異源融合蛋白一旦本發(fā)明的異源融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，可以分離和純化類似物。以下程序是示例性的適當(dāng)純化程序在羧甲基纖維素上分級(jí)；凝膠過(guò)濾如Sephadex G-75；陰離子交換樹(shù)脂，如DEAE或Mono-Q；陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如CM或Mono-S；去除IgG等污染物的蛋白A瓊脂糖；用金屬螯合柱結(jié)合表位標(biāo)記形式的多肽；反相HPLC；層析聚焦；硅膠；乙醇沉淀；和硫酸銨沉淀。
可以使用蛋白純化的各種方法，并且這些方法是本領(lǐng)域公知的，并且描述于例如，Deutscher，Methods in Enzymology 18283-9(1990)和Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-Verlag，NY(1982)。所選擇的純化步驟將取決于使用的生產(chǎn)過(guò)程的性質(zhì)和產(chǎn)生的特定融合蛋白。例如，可以用蛋白A或蛋白G親和基質(zhì)有效純化包含F(xiàn)c片段的融合蛋白?？梢允褂玫突蚋遬H緩沖液從親和基質(zhì)上洗脫融合蛋白。溫和的洗脫條件將有助于防止融合蛋白的不可逆變性。也可以使用含咪唑的緩沖液。實(shí)施例3描述了用于本發(fā)明的融合蛋白的一些成功的純化方案。
本發(fā)明的融合蛋白的表征
可以用許多方法表征本發(fā)明的融合蛋白。這些方法中的一些包括與蛋白染色方法偶聯(lián)的SDS-PAGE或使用抗IgG或抗HSA抗體的免疫印跡。其它方法包括基質(zhì)輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜(MALDI-MS)、液相色譜/質(zhì)譜、等電聚焦、分析性陰離子交換、層析聚焦和圓二色散。一些代表性的異源融合蛋白是用免疫印跡偶聯(lián)的SDS-PAGE以及質(zhì)譜表征的(見(jiàn)實(shí)施例4和5以及圖3和4)。
例如表3(見(jiàn)實(shí)施例5)說(shuō)明了代表性的融合蛋白的計(jì)算分子量和由質(zhì)譜儀測(cè)定的質(zhì)量。此外，圖3和4說(shuō)明了由SDS PAGE測(cè)定的代表性的融合蛋白的分子量。所有檢測(cè)的異源融合蛋白都是瞬時(shí)表達(dá)并且分泌的。此外，切除了Igκ信號(hào)序列以產(chǎn)生具有正確N端的蛋白。
此外，表3說(shuō)明，在一些情況下，由質(zhì)譜測(cè)定的質(zhì)量高于所預(yù)期的。這是因?yàn)镕c部分的糖基化和C末端延伸片段。用酶消化融合蛋白，然后通過(guò)反相HPLC和質(zhì)譜可以表征含有糖部分的肽級(jí)分。可以對(duì)這些級(jí)分進(jìn)行N末端氨基酸測(cè)序，以鑒定潛在的糖基化位點(diǎn)。例如，Exendin-4-Fc(SEQ ID NO29)的表征表明，第39位的絲氨酸和第50位的蘇氨酸是O-連接糖基化的，第122位的天冬酰胺是N-連接糖基化的。
也檢測(cè)了代表性的GLP-1融合蛋白的活性，可以用許多方法體外和體內(nèi)檢測(cè)GLP-1活性(見(jiàn)，例如實(shí)施例6，7，8和9)。表4(實(shí)施例6)說(shuō)明，GLP-1受體活性與一些GLP-1融合相關(guān)。其數(shù)目是相對(duì)于與Val8-GLP-1(7-37)OH相關(guān)的活性。所有檢測(cè)的融合蛋白具有GLP-1受體活性。低水平的體外活性不一定表示體外作用弱。由于這些融合蛋白半衰期的很大增加，體外活性弱一般不是體內(nèi)活性弱的指標(biāo)。圖7和實(shí)施例說(shuō)明，延長(zhǎng)的半衰期與本發(fā)明的融合蛋白相關(guān)。例如，Val8-GLP-1-Fc在猴中的半衰期為大約45小時(shí)，Val8-GLP-1-HSA在猴中的半衰期為大約87小時(shí)，Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-接頭-IgG1在狗中靜脈給藥后的半衰期為大約55小時(shí)，Gly8-Glu2 2-GLP-1-CEx-接頭-IgG1在狗中皮下給藥后的半衰期為大約38小時(shí)。
本發(fā)明的組合物物理穩(wěn)定性也是治療性蛋白制劑的關(guān)鍵特征。GLP-1化合物特別難以制造和制劑化，因?yàn)樵诩庸ぶ写嬖诮Y(jié)構(gòu)改變。例如，一些GLP-1化合物具有聚集的傾向。此外，已經(jīng)證明一些GLP-1化合物從可溶的和活性α螺旋形式轉(zhuǎn)化為不溶的和潛在無(wú)活性的β折疊形式。GLP-1化合物與大的蛋白如IgG的Fc區(qū)或白蛋白的融合不僅增加GLP-1化合物的半衰期，也有助于GLP-1化合物的物理和構(gòu)象穩(wěn)定性。例如，Val8-GLP-1-接頭-HSA在PBS中可以在37℃穩(wěn)定約30天。
本發(fā)明的異源融合蛋白可以與一種或多種賦形劑進(jìn)行制劑化。本發(fā)明的活性融合蛋白可以與可藥用緩沖液組合，并且調(diào)節(jié)pH以提供可接受的穩(wěn)定性和適于腸胃外給藥等給藥的pH。
可以添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。間甲酚和苯酚是優(yōu)選的可藥用抗微生物劑?？梢约尤胍环N或多種可藥用鹽以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度或滲透壓。可以加入一種或多種賦形劑以進(jìn)一步調(diào)節(jié)制劑的等滲性。甘油是調(diào)節(jié)等滲性的賦形劑的一個(gè)例子。適于人或其它動(dòng)物給藥的可藥用手段不含毒性元素或不需要的污染物，并且不干擾其活性化合物的活性。
本發(fā)明的異源融合蛋白的可藥用鹽形式可以用于本發(fā)明。通常用于形成酸加成鹽的酸是無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等，和有機(jī)酸如對(duì)甲苯磺酸、甲烷磺酸、草酸、對(duì)溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。優(yōu)選的酸加成鹽是與無(wú)機(jī)酸如鹽酸和氫溴酸形成的鹽。
堿加成鹽包括來(lái)源于無(wú)機(jī)堿，如銨或堿或堿土金屬羥化物的鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽等。因此用于制備本發(fā)明的鹽的這些堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。
組合物的給藥可以通過(guò)醫(yī)生和普通技術(shù)人員公知的有效途徑進(jìn)行給藥。外周腸胃外給藥是這樣的一種方法。醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中通常將腸胃外給藥理解為用注射器或一些其它的機(jī)械設(shè)備如輸注泵將劑型注射到體內(nèi)。外周腸胃外給藥可以包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥途徑。
本發(fā)明的異源融合蛋白也可以用于通過(guò)口服、直腸、鼻內(nèi)、下呼吸道途徑給藥，這些都是非腸胃外途徑。在這些非腸胃外途徑中，優(yōu)選呼吸道途徑和口服途徑。
本發(fā)明的融合蛋白可用于治療多種疾病和狀況。本發(fā)明的融合蛋白主要通過(guò)作用于稱為“GLP-1受體”的受體來(lái)發(fā)揮它們的生物學(xué)作用。因此，可利用本發(fā)明中的GLP-1化合物來(lái)治療患有可對(duì)GLP-1受體刺激和/或?qū)LP-1化合物給藥作出有益應(yīng)答的疾病或狀況的患者。這些患者被稱作“需要利用GLP-1化合物進(jìn)行治療”或“需要GLP-1受體刺激”。這樣的患者包括患有胰島素非依賴型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病、卒中(見(jiàn)WO 00/16979)、心肌梗塞(見(jiàn)WO 98/08531)、肥胖癥(見(jiàn)WO 98/19698)、手術(shù)后分解代謝改變(見(jiàn)美國(guó)專利.NO 6,006,753)、功能性消化不良和腸激惹綜合征(見(jiàn)WO 99/64060)的患者。也包括需要利用GLP-1化合物進(jìn)行預(yù)防性處理的患者，如具有發(fā)生胰島素非依賴型糖尿病危險(xiǎn)性的患者(見(jiàn)WO 00/07617)。葡萄糖耐受異常或空腹葡萄糖異常的受試者、體重超出相對(duì)于患者身高和體格來(lái)講的正常體重25％的受試者、進(jìn)行了部分胰切除手術(shù)的受試者、雙親中有一或多個(gè)患有胰島素非依賴型糖尿病的受試者、患有妊娠期糖尿病的受試者及患有急或慢性胰腺炎的受試者具有患胰島素非依賴型糖尿病的危險(xiǎn)性。
GLP-1化合物的“有效量”是指對(duì)需要GLP-1受體刺激的患者給藥時(shí)，在不造成不需要的副作用的條件下，能夠產(chǎn)生所需治療和/或預(yù)防效果的量?！八璧闹委熜Ч卑ㄏ铝械囊换蚨鄠€(gè)方面1)與疾病和狀況相關(guān)的癥狀的改善；2)延緩與疾病或狀況相關(guān)的癥狀的出現(xiàn)；3)與沒(méi)有進(jìn)行治療的情況相比壽命增加；以及4)相對(duì)于沒(méi)有進(jìn)行治療的情況具有更高的生活質(zhì)量。例如，用于治療糖尿病的GLP-1化合物的“有效量”指與沒(méi)有進(jìn)行治療的情況相比，能對(duì)血糖濃度進(jìn)行更大程度上的控制，從而延緩糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病或腎病出現(xiàn)的量。用于預(yù)防糖尿病的GLP-1化合物的“有效量”指與沒(méi)有進(jìn)行治療的情況相比，能延緩升高的血糖水平出現(xiàn)的量，而血糖水平升高是需要用抗高血糖藥物如磺脲類、噻唑烷二酮、胰島素和/或氯苯呱哌嗪來(lái)進(jìn)行治療的。
有效使患者的血糖正?；娜诤系鞍椎膭┝繉⑷Q于許多因素，其中包括但不限于受試者的性別、體重和年齡、不能調(diào)節(jié)血糖的嚴(yán)重性、給藥途徑和生物利用度、融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)曲線、效力和制劑。
本發(fā)明包括具有通過(guò)與白蛋白、白蛋白片段、白蛋白類似物Fc部分、Fc片段或Fc類似物融合而具有改進(jìn)的生化和生物物理特征的GLP-1化合物。這些異源蛋白可以在宿主細(xì)胞中成功表達(dá)，保留與GLP-1受體的激活相關(guān)的信號(hào)傳遞活性，并且具有延長(zhǎng)的半衰期。
提供了以下實(shí)施例，以便進(jìn)一步描述本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不是僅僅由以下實(shí)施例組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，此處描述的特定試劑、設(shè)備和程序僅僅是說(shuō)明性的，并沒(méi)有以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1構(gòu)建編碼異源融合蛋白的DNA實(shí)施例1a構(gòu)建編碼Val8-GLP-1(7-37)-Fc的DNA從cDNA文庫(kù)分離人IgG1的Fc部分，并且含有完整的鉸鏈區(qū)和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。將含有人IgG1的該Fc部分的696個(gè)堿基對(duì)的片段亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pJB02的NheI和Eco47III位點(diǎn)，以產(chǎn)生pJB02/Fc(見(jiàn)圖5)。通過(guò)4個(gè)重疊和互補(bǔ)的寡核苷酸的體外雜交產(chǎn)生編碼與Val8-GLP-1(7-37)融合的Igκ分泌信號(hào)的DNA5′-CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCAGTG-3′[SEQ ID NO12]5′-GAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGAGGGCCAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGAAGAGGC-3′[SEQ ID NO13]5′-TGAAGGTGCCCTCCACGTGGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGG-3′[SEQ IDNO14]5′-GCCTCTTCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCCTGGCCCTCCAGATAGGAGGACACGTCGGAGG-3′[SEQ ID NO15]采用等量的每種寡核苷酸(每種寡核苷酸的終濃度為1pm/μl)進(jìn)行雜交反應(yīng)。將寡核苷酸的化合物在連接緩沖液中100℃下加熱5分鐘(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，25μg/ml牛血清白蛋白)，然后經(jīng)至少2小時(shí)冷卻到30℃。
得到的雜交產(chǎn)物與用NheI和Eco47III消化的pJB02/Fc載體主鏈在室溫下連接2小時(shí)或在16℃連接過(guò)夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的XL-1 Blue細(xì)胞(Stratagene)。通過(guò)用NcoI消化克隆篩選重組質(zhì)粒中編碼肽的插入序列的存在(編碼Kozak序列和信號(hào)肽的第一個(gè)Met)并且測(cè)序。得到的用于轉(zhuǎn)染測(cè)定的表達(dá)質(zhì)粒稱作pJB02-V8-GLP-1-Fc(圖5)。
實(shí)施例1b構(gòu)建編碼Val8-GLP-1(7-37)-HSA的DNA質(zhì)粒HSA/pcDNA3.1GS購(gòu)自Invitrogen(目錄號(hào)H-M12523M-pcDNA3.1/GS)并且作為模板分離編碼人血清白蛋白(HSA)的cDNA。用PCR制備HSA cDNA，其中從5’末端去除編碼前導(dǎo)序列和6個(gè)氨基酸的前肽的DNA。此外，在HSA編碼序列的3’末端直接添加終止密碼子。最后，將限制酶位點(diǎn)工程化在5’和3’末端以促進(jìn)克隆。與天然人序列相比，存在于購(gòu)自Invitrogen的原始載體中的HSA DNA序列在基因的3’區(qū)(第667位)含有單堿基改變。該改變將產(chǎn)生Asn，而不是Asp的密碼子。因此，使用上述鏈重疊PCR誘變方法，將密碼子改變?yōu)樵诖宋恢镁幋aAsp。將得到的HSA編碼DNA克隆到pJB02的NheI和HindIII位點(diǎn)以產(chǎn)生pJB02-HSA(圖6)。
按實(shí)施例1a的討論產(chǎn)生與Val8-GLP-1(7-37)序列融合的Igκ前導(dǎo)序列。將該DNA連接到pJB02-HSA的NheI和FspI位點(diǎn)以產(chǎn)生pJB02-Val8-GLP-1-HSA。
實(shí)施例1c構(gòu)建編碼Val8-GLP-1(7-37)-接頭-HSA的DNA按實(shí)施例1b的描述制備載體pJB02-HSA。將編碼接頭序列[GGGGS]3的DNA框內(nèi)連接于HAS的編碼DNA的5’末端以產(chǎn)生pJB02-接頭-HSA(圖7)，按實(shí)施例1a的描述制備編碼融合于Val8-GLP-1(7-37)序列和接頭序列的5’部分的IgGκ前導(dǎo)序列的DNA。將該DNA連接于pJB02的NheI和BspEI位點(diǎn)以產(chǎn)生pJB02-Val8-GLP-1-接頭-HSA。
實(shí)施例1d構(gòu)建編碼Exendin-4-Fc的DNA按實(shí)施例1a的描述制備質(zhì)粒pJB02/Fc。通過(guò)以下重疊和互補(bǔ)寡核苷酸的體外雜交產(chǎn)生編碼融合于Exendin-4的Igκ信號(hào)序列的DNA5′-CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGTCAC-3′[SEQ ID NO16]5′-GGAGAGGGAACCTTCACCAGCGACCTGAGCAAGCAGATGGAGGAGGAGGCCGTGAGACTG-3′[SEQ ID NO17 ]
5′-TTCATCGAGTGGCTGAAGAACGGAGGACCAAGCAGCGGAGCCCCTCCTCCTAGC-3′[SEQ ID NO18]5′-GAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGG-3′[SEQ ID NO19]5′-CTCCTCCTCCATCTGCTTGCTCAGGTCGCTGGTGAAGGTTCCCTCTCCGTGACCGGTG-3′[SEQ ID NO20]5′-GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTTGGTCCTCCGTTCTTCAGCCACTCGATGAACAGTCTCACGGC-3′[SEQ ID NO21]按實(shí)施例1a的描述進(jìn)行雜交反應(yīng)。將雜交的產(chǎn)物連接于用NheI和Eco47III消化的pJB02載體，以產(chǎn)生pJB02-Exendin-4-Fc。
實(shí)施例le構(gòu)建編碼Exendin-4-HSA的DNA按實(shí)施例1b的描述制備質(zhì)粒pJB02-HSA。通過(guò)描述于實(shí)施例1d中的重疊和互補(bǔ)寡核苷酸的體外雜交產(chǎn)生編碼融合于Exendin-4的Igκ信號(hào)序列的DNA。也按上述內(nèi)容進(jìn)行雜交反應(yīng)。將DNA克隆至pJB02-HSA中的獨(dú)特NheI和FspI位點(diǎn)，以產(chǎn)生pJB02-Exendin-4-HSA。
實(shí)施例1f構(gòu)建編碼Exendin-4-接頭-HSA的DNA按實(shí)施例1c的描述制備質(zhì)粒pJB02-接頭-HSA。按實(shí)施例1d的描述制備編碼融合于Exendin-4和接頭序列的5’部分的IgGκ前導(dǎo)序列的DNA。將該DNA克隆至pJB02-接頭-HSA中的獨(dú)特NheI和BspEI位點(diǎn)，以產(chǎn)生pJB02-Exendin-4-接頭-HSA。
實(shí)施例1g構(gòu)建編碼Val8-GLP-1/C-Ex-Fc的DNA按實(shí)施例1d的描述制備質(zhì)粒pJB02-Exendin-4-Fc。用AgeI和Eco47III從載體切除Exendin-4的編碼DNA。通過(guò)以下重疊和互補(bǔ)寡核苷酸的體外雜交產(chǎn)生編碼Val8-GLP-1/C-Ex的DNA
5′-CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGAGGGCCAGGCCGCCA-3′[SEQ ID NO22]5′-AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGGAGCCCCTCCTCCTAGC-3′[SEQ ID NO23]5′-CTCCAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCTCCACGTGA-3′[SEQ ID NO24]5′-GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAATTCCTTGGCGGCCTGGCC-3′[SEQ ID NO25]按實(shí)施例1a的描述進(jìn)行雜交反應(yīng)。將雜交的產(chǎn)物代替Exendin-4連接于pJB02-Exendin-4-Fc表達(dá)載體，以產(chǎn)生pJB02-Val8-GLP-1/C-Ex-Fc。
實(shí)施例1h構(gòu)建編碼Val8-Glu22-GLP-1-Fc的DNA按實(shí)施例1d的描述制備質(zhì)粒pJB02-Exendin-4-Fc。用AgeI和Eco47III從載體切除Exendin-4的編碼DNA。通過(guò)以下重疊和互補(bǔ)寡核苷酸的體外雜交產(chǎn)生編碼Val8-Glu22-GLP-1的DNA5′-CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGAGGAGCAGGCCGCCA-3′[SEQ ID NO26]5′-AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC-3′[SEQ ID NO27]5′-GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCCTGCTC-3′[SEQ ID NO28]5′-CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCTCCACGTGA-3′[SEQ ID NO29]按實(shí)施例1a的描述進(jìn)行雜交反應(yīng)。將雜交的產(chǎn)物代替Exendin-4連接于pJB02-Exendin-4-Fc表達(dá)載體，以產(chǎn)生pJB02-Val8-Glu22-GLP-1-Fc。
實(shí)施例li構(gòu)建編碼Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex-Fc的DNA按實(shí)施例1d的描述制備質(zhì)粒pJB02-Exendin-4-Fc。用AgeI和Eco47III從載體切除Exendin-4的編碼DNA。通過(guò)以下重疊和互補(bǔ)寡核苷酸的體外雜交產(chǎn)生編碼Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex的DNA5′-CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGAGGAGCAGGCCGCCA-3′[SEQ ID NO30]5′-AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGGAGCCCCTCCTCCTAGC-3′[SEQ ID NO31]5′-CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCTCCACGTGA-3′[SEQ ID NO32]5′-GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAATTCCTTGGCGGCCTGCTC-3′[SEQ ID NO33]按實(shí)施例1a的描述進(jìn)行雜交反應(yīng)。將雜交的產(chǎn)物代替Exendin-4連接于pJB02-Exendin-4-Fc表達(dá)載體，以產(chǎn)生pJB02-Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex-Fc。
實(shí)施例1j構(gòu)建編碼Gly8-GLP-1-Fc的DNA按實(shí)施例1d的描述制備質(zhì)粒pJB02-Exendin-4-Fc。用AgeI和Eco47III從載體切除Exendin-4的編碼DNA。通過(guò)以下重疊和互補(bǔ)寡核苷酸的體外雜交產(chǎn)生編碼Gly8-GLP-1的DNA5′-CCGGTCACGGCGAGGGCACCTTCACTAGTGACGTGTCCTCCTATCTGGAGGGCCAGGCCGCCA-3′[SEQ ID NO34]5′-AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC-3′[SEQ ID NO35]5′-CTCCAGATAGGAGGACACGTCACTAGTGAAGGTGCCCTCGCCGTGA-3′[SEQ ID NO36]5′-GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCCTGGCC-3′[SEQ ID NO37 ]
按實(shí)施例1a的描述進(jìn)行雜交反應(yīng)。將雜交的產(chǎn)物代替Exendin-4連接于pJB02-Exendin-4-Pc表達(dá)載體，以產(chǎn)生pJB02-Gly8-GLP-1-Fc。
實(shí)施例2表達(dá)異源融合蛋白通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 29 3EBNA細(xì)胞(貼壁的和懸浮的)表達(dá)實(shí)施例1中的DNA構(gòu)建體編碼的融合蛋白。在轉(zhuǎn)染前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和種植。通過(guò)將FuGeneTM6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Biochemicals，目錄號(hào)1814443)與OptiMEM(Gibco/BRL)混合而制備轉(zhuǎn)染混合物，并且在室溫下孵育5分鐘，此時(shí)加入DNA，將混合物再孵育15分鐘。轉(zhuǎn)染前，向平板中加入新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。表1和2提供了進(jìn)一步的轉(zhuǎn)染細(xì)節(jié)。
表1HEK 293EBNA細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中使用的試劑
表2培養(yǎng)基組成
對(duì)于小規(guī)模轉(zhuǎn)染(35mm-10mm容器)，用PBS沖洗細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)轉(zhuǎn)移到收獲培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)基并且每24小時(shí)更換一次，持續(xù)幾天。對(duì)于大規(guī)模轉(zhuǎn)染(700cm2滾瓶)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用PBS沖洗滾瓶并且改變?yōu)槭斋@培養(yǎng)基。在至少連續(xù)10天中收集培養(yǎng)基并且每24小時(shí)更換。一般地，只有10次的收獲物用于其后的蛋白純化。
實(shí)施例3異源融合蛋白的純化實(shí)施例3a Val8-GLP-1-Fc的純化用CUNO過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)來(lái)自于大規(guī)模轉(zhuǎn)染物的約4.5升條件培養(yǎng)基(融合蛋白表達(dá)水平為大約20μg/ml)進(jìn)行過(guò)濾，并且使用具有10K濾膜的ProFlux切向流動(dòng)式過(guò)濾系統(tǒng)濃縮至250ml。用HiTrap蛋白A柱，采用pH7.4的1×PBS，以2ml/min的流速捕獲Val8-GLP-1-Fc，并且用pH3.3的50mM檸檬酸洗脫。將級(jí)分(1ml)收集在含4ml 1×PBS和1000μl 1M Tris pH8的試管中。
將通過(guò)SDS-PAGE和Zorbax C8上的反相HPLC確定的含有融合蛋白的級(jí)分進(jìn)行合并，并且加入Superdex 75 60/60柱，1×PBS pH 7.4中，流速為10ml/min。收集陽(yáng)性級(jí)分(20ml/管)并且合并。然后將合并的級(jí)分在0.1％TFA水中以3ml/min的流速進(jìn)行C4反相層析。在70分鐘內(nèi)用5％B(溶于乙腈的0.1％TFA)-100％B的梯度洗脫Val8-GLP-1-Fc。收集洗脫的級(jí)分(3ml/管)。通過(guò)真空干燥去除乙腈，并且加入1ml H2O。用4升1×PBS pH7.4透析純化樣品(大約32ml)兩次。
然后用MILLEX-GV 0.22μm過(guò)濾單位過(guò)濾透析過(guò)的樣品，用280nm處的吸光度確定濃度。
實(shí)施例3b Val8-GLP-1-HSA或Val8-GLP-1-接頭-HSA的純化用CUNO過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)約6.5升條件培養(yǎng)基(融合蛋白表達(dá)水平為大約10μg/ml)進(jìn)行過(guò)濾，并且使用具有10K濾膜的ProFlux切向流動(dòng)式過(guò)濾系統(tǒng)濃縮至380ml。
用50ml Fast Flow Q柱(Pharmacia)，在流速為5ml/min的20mMTris pH7.4中捕獲融合蛋白。采用以下梯度洗脫蛋白0％-50％20mMTris pH7.4，10 CV中的1M NaCl，然后2 CV中的100％B。
合并含融合蛋白的級(jí)分，在0.1％TFA水中以5ml/min的流速進(jìn)行C4反相層析。在120分鐘內(nèi)用20％B(溶于乙腈的0.1％TFA)-90％B的梯度洗脫融合蛋白。收集洗脫的級(jí)分(3.5ml/管)。通過(guò)真空干燥去除乙腈。
用1×PBS將大約9ml合并的樣品稀釋至40ml并且用4升1×PBSpH7.4透析過(guò)夜。然后過(guò)濾樣品，用280nm處的吸光度確定濃度。
實(shí)施例3c Exendin-4-Fc的純化用CUNO過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)約4升條件培養(yǎng)基(融合蛋白表達(dá)水平為大約8μg/ml)進(jìn)行過(guò)濾，并且使用具有30K濾膜的ProFlux切向流動(dòng)式過(guò)濾系統(tǒng)濃縮至250ml。
用5ml HiTrap蛋白A柱，在流速為2ml/min的1×PBS，pH7.4中捕獲Exendin-4-Fc，并且用pH3.3的50mM檸檬酸洗脫。合并含融合蛋白的級(jí)分，過(guò)濾，并且用4升1×PBS pH7.4透析過(guò)夜。然后將透析過(guò)的樣品加入Superdex 75 60/60柱，1×PBS pH7.4，0.5M Nacl中，流速為10ml/min。收集含融合蛋白的級(jí)分(20ml/管)，合并，并且濃縮至大約1mg/ml。然后用MILLEX-GV 0.22um濾器過(guò)濾濃縮后的樣品。
實(shí)施例3d純化Exendin-4-HSA和Exendin-4-接頭-HSA用CUNO過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)約1.1升條件培養(yǎng)基(融合蛋白表達(dá)水平為大約6μg/ml)進(jìn)行過(guò)濾，并且使用具有30K濾膜的ProFlux切向流動(dòng)式過(guò)濾系統(tǒng)濃縮至175ml。
然后用50ml HiTrap Q-瓊脂糖柱(Pharmacia)，在流速為2ml/min的20mM Tris pH7.4中捕獲融合蛋白。采用以下梯度洗脫蛋白0％-50％20mM Tris pH7.4，12 CV中的1M NaCl，然后4 CV中的100％B。
合并含融合蛋白的級(jí)分，在0.1％TFA水中以5ml/min的流速進(jìn)行C4反相層析。在70分鐘內(nèi)用10％B(溶于乙腈的0.1％TFA)-100％B的梯度洗脫融合蛋白。收集洗脫的級(jí)分(10ml/管)。通過(guò)真空干燥去除乙腈。
用4升1×PBS pH7.4透析大約8ml合并的樣品過(guò)夜。然后過(guò)濾樣品，用280nm處的吸光度確定濃度。然后將透析過(guò)的樣品加入Superdex 200 26/60柱，×PBS pH7.4，0.5M NaCl中，流速為2ml/min。收集、合并、濃縮和過(guò)濾含融合蛋白的級(jí)分(3ml/管)。
實(shí)施例4通過(guò)SDS PAGE表征融合蛋白使用SDS-PAGE和其后的免疫印跡分析來(lái)自于用各種融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的純化融合蛋白和條件培養(yǎng)基。用Novex 16％Tris-甘氨酸Precast凝膠(EC6498)、電泳緩沖液(10x，LC2675)和樣品緩沖液(L2676)在Novex Powerease 500系統(tǒng)上進(jìn)行SDS-PAGE。用50mM DTT還原樣品，加樣前在95℃加熱3-5分鐘。
進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，用水和轉(zhuǎn)移緩沖液(1X Tris-甘氨酸Seprabuff(Owl Scientific目錄號(hào)ER26-S)，含20％甲醇)從凝膠上沖洗SDS。使用具有PVDF(BioRad，目錄號(hào)162-0174)和硝酸纖維素膜(BioRad，目錄號(hào)1703965或1703932)的Novex轉(zhuǎn)移裝置。在室溫下30-35V轉(zhuǎn)移90min。用含有0.1％Tween-20(Sigma，目錄號(hào)P7949)和5％乳汁(BioRad，目錄號(hào)170-6404)的1×PBS將膜在4℃封閉1-12小時(shí)。將抗體稀釋至1×PBS+5％乳汁中并且在這些溶液中4℃孵育印跡1-2小時(shí)。在孵育之間，用1×PBS和0.2％Tween-20在室溫下洗滌印跡5分鐘，共4次。在25℃用GIBCO 10×PBS(目錄號(hào)70011)制備PBS以得到1mM磷酸二氫鉀、3mM氫二鈉、153mM氯化鈉，pH7.4的最終組分，或用Sigma的PBS袋(目錄號(hào)10003)制備PBS以得到120mM NaCl，2.7mM KCl和10mM磷酸鹽，pH7.4。
第一抗體為單克隆山羊抗IgG1或兔抗HSA。第二抗體為抗山羊IgGHRP或抗兔IgG HRP。對(duì)第二抗體進(jìn)行1∶5000稀釋。用ECL系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech，目錄號(hào)RN2108和目錄號(hào)RPN1674H)對(duì)印跡進(jìn)行顯影。
圖3A比較了純化Fc蛋白與來(lái)自pJB02-Val8-GLP-1-Fc和pJB02-Exendin-4-Fc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。遷移率的減少與由于融合蛋白的GLP-1部分導(dǎo)致的大小增加相一致。圖3B相似地比較了純化HSA和來(lái)自于pJB02-Val8-GLP-2-HSA，pJB02-Val8-GLP-1-接頭-HSA，pJB02-Exendin-4-HSA，或pJB02-Exendin-4-接頭-HSA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。圖4鑒定了純化的融合蛋白制劑。
實(shí)施例5用質(zhì)譜法表征融合蛋白所有實(shí)驗(yàn)都是在裝備有延時(shí)聚焦電子設(shè)備、Reflectron(用于分析0-8000 Da的肽范圍)、線性檢測(cè)器(用于高質(zhì)量/良好信號(hào)分析)、和后加速檢測(cè)器(或P.A.D.，用于高質(zhì)量/極低信號(hào)分析)的MicromassTofSpec-2E質(zhì)譜儀上進(jìn)行的。線性模式中儀器的有效徑長(zhǎng)是1.2米，反射(Reflectron)模式中是2.3米。固定兩個(gè)雙微通道板檢測(cè)器用于線性和反式模式檢測(cè)。使用的激光是Laser Science Inc.VSL-337i氮激光，在337nm下，每秒5次激光發(fā)射。用2GHz，8比特內(nèi)部數(shù)字化儀獲得所有數(shù)據(jù)，每個(gè)譜平均最多50次激光發(fā)射。
以線性方式操作儀器，用于分析所考慮的GLP-1融合蛋白。線性檢測(cè)器是檢測(cè)沿MALDI-ToF-MS儀器的飛行管向下運(yùn)行的離子的設(shè)備。它檢測(cè)隨時(shí)間的離子豐度，并且相數(shù)字化儀發(fā)送信號(hào)用于轉(zhuǎn)換。數(shù)字化儀是一種模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器，允許質(zhì)譜儀的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到計(jì)算機(jī)，在其中重建為可用的m/z譜。
用重結(jié)晶的飽和芥子酸溶液(在50/50 Acn/H2O和0.1％TFA中稀釋)作為離子化基質(zhì)。芥子酸是大于約10Kda的蛋白的適當(dāng)基質(zhì)。將適當(dāng)?shù)膮⒖嫉鞍鬃鳛閮?nèi)部和外部校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，以獲得所分析的樣品的準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定值。采用樣品與基質(zhì)稀釋液1∶2的比例分析樣品。起初在以下的線性檢測(cè)器條件下設(shè)定線性檢測(cè)器條件源電壓20.0keV脈沖電壓3.0keV萃取電壓20.0keV 粗激光50聚焦電壓16.0keV 細(xì)激光50線性檢測(cè)器3.7keVP.A.D.(離線)(根據(jù)需要)對(duì)這些設(shè)置進(jìn)行調(diào)整，以得到最佳信/噪比和最高的分辨率。表3提供了不同GLP-1融合蛋白的表征。
表3
Cex稱作C末端延伸片段，包含序列Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。接頭是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
實(shí)施例6異源融合蛋白的活性用分別描述于Gelfand等的EP 619,322和美國(guó)專利5,120,712中的方法等體外測(cè)定方法評(píng)估本發(fā)明的融合蛋白激活GLP-1受體的能力。相對(duì)于Val8-GLP-1(7-37)OH活性的這些化合物的活性報(bào)道于表4。圖8表示Val8-GLP-1和Exendin-4融合蛋白的體外劑量反應(yīng)曲線。此外，表5a和5b提供了可以與Fc或白蛋白融合以制備生物活性融合蛋白的一大組GLP-1類似物的體外活性。這些活性是與GLP-1(7-37)OH相比的結(jié)果。
表4GLP-1融合蛋白的體外活性
Cex稱作C末端延伸片段，包含序列Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。接頭是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
C2是Ser-Ser-Gly-Alα-Ser-Ser-Gly-Ala。
描述于表3和4的融合蛋白的氨基酸序列表示于SED ID NO13至SEQ ID NO31。
Val8-GLP-1-人血清白蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO13表示。
1 HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GDAHKSEVAH RFKDLGEENF KALVLIAFAQ61 YLQQCPFEDH VKLVNEVTEF AKTCVADESA ENCDKSLHTL FGDKLCTVAT LRETYGEMAD121 CCAKQEPERN ECFLQHKDDN PNLPRLVRPE VDVMCTAFHD NEETFLKKYL YEIARRHPYF181 YAPELLFFAK RYKAAFTECC QAADKAACLL PKLDELRDEG KASSAKQRLK CASLQKFGER241 AFKAWAVARL SQRFPKAEFA EVSKLVTDLT KVHTECCHGD LLECADDRAD LAKYICENQD301 SISSKLKECC EKPLLEKSHC IAEVENDEMP ADLPSLAADF VESKDVCKNY AEAKDVFLGM361 FLYEYARRHP DYSVVLLLRL AKTYETTLEK CCAAADPHEC YAKVFDEFKP LVEEPQNLIK421 QNCELFEQLG EYKFQNALLV RYTKKVPQVS TPTLVEVSRN LGKVGSKCCK HPEAKRMPCA481 EDYLSVVLNQ LCVLHEKTPV SDRVTKCCTE SLVNRRPCFS ALEVDETYVP KEFNAETFTF541 HADICTLSEK ERQIKKQTAL VELVKHKPKA TKEQLKAVMD DFAAFVEKCC KADDKETCFA601 EEGKKLVAAS QAALGL [SEQ ID NO13]Val8-GLP-1-接頭-人血清白蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO14表示。
1 HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSDAHK SEVAHRFKDL61 GEENFKALVL IAFAQYLQQC PFEDHVKLVN EVTEFAKTCV ADESAENCDK SLHTLFGDKL121 CTVATLRETY GEMADCCAKQ EPERNECFLQ NKDDNPNLPR LVRPEVDVMC TAFHDNEETF181 LKKYLYEIAR RHPYFYAPEL LFFAKRYKAA FTECCQAADK AACLLPKLDE LRDEGKASSA241 KQRLKCASLQ KFGERAFKAW AVARLSQRFP KAEFAEVSKL VTDLTKVHTE CCHGDLLECA301 DDRADLAKYI CENQDSISSK LKECCEKPLL EKSHCIAEVE NDEMPADLPS LAADFVESKD361 VCKNYAEAKD VFLGMFLYEY ARRHPDYSVV LLLRLAKTYE TTLEKCCAAA DPHECYAKVF421 DEFKPLVEEP QNLIKQNCEL FEQLGEYKFQ NALLVRYTKK VPQVSTPTLV EVSRNLGKVG481 SKCCKHPEAK RMPCAEDYLS VVLNQLCVLH EKTPVSDRVT KCCTESLVNR RPCFSALEVD541 ETYVPKEFNA ETFTFHADIC TLSEKERQIK KQTALVELVK HKPKATKEQL KAVMDDFAAF601 VEKCCKADDK ETCFAEEGKK LVAASQAALG L[SEQ ID NO14]Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-接頭-人血清白蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO15表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGGSGGGGS GGGGSDAHKS61 EVAHRFKDLG EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA DESAENCDKS121 LHTLFGDKLC TVATLRETYG EMADCCAKQE PERNECFLQH KDDNPNLPRL VRPEVDVMCT181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA ACLLPKLDEL241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV TDLTKVHTEC301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN DEMPADLPSL361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSVVL LLRLAKTYET TLEKCCAAAD421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NLIKQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV PQVSTPTLVE481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK CCTESLVNRR541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLK601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL [SEQ ID NO15]
Exendin-4-人血清白蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO16表示。
1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSD AHKSEVAHRF KDLGEENFKA61 LVLIAFAQYL QQCPFEDHVK LVNEVTEFAK TCVADESAEN CDKSLHTLFG DKLCTVATLR121 ETYGEMADCC AKQEPERNEC FLQHKDDNPN LPRLVRPEVD VMCTAFHDNE ETFLKKYLYE181 IARRHPYFYA PELLFFAKRY KAAFTECCQA ADKAACLLPK LDELRDEGKA SSAKQRLKCA241 SLQKFGERAF KAWAVARLSQ RFPKAEFAEV SKLVTDLTKV HTECCHGDLL ECADDRADLA301 KYICENQDSI SSKLKECCEK PLLEKSHCIA EVENDEMPAD LPSLAADFVE SKDVCKNYAE361 AKDVFLGMFL YEYARRHPDY SVVLLLRLAK TYETTLEKCC AAADPHECYA KVFDEFKPLV421 EEPQNLIKQN CELFEQLGEY KFQNALLVRY TKKVPQVSTP TLVEVSRNLG KVGSKCCKHP481 EAKRMPCAED YLSVVLNQLC VLHEKTPVSD RVTKCCTESL VNRRPCFSAL EVDETYVPKE541 FNAETFTFHA DICTLSEKER QIKKQTALVE LVKHKPKATK EQLKAVMDDF AAFVEKCCKA601 DDKETCFAEE GKKLVAASQA ALGL[SEQ ID NO16]Exendin-4-接頭-人血清白蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO17表示。
1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGGSGGGGS GGGGSDAHKS61 EVAHRFKDLG EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA DESAENCDKS121 LHTLFGDKLC TVATLRETYG EMADCCAAKE PERNECFLQH KDDNPNLPRL VRPEVDVMCT181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA ACLLPKLDEL241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV TDLTKVHTEC301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN DEMPADLPSL361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSVVL LLRLAKTYET TLEKCCAAAD421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NLIKQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV PQVSTPTLVE481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK CCTESLVNRR541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLK601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL[SEQ ID NO17]Val8-GLP-1-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO18表示。
1 HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF61 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF241 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO18]Val8-GLP-1-Cex-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO19表示。
1 HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL61 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO19]Val8-Glu22GLP-1-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO20表示。
1 HVEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF61 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF241 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO20]Val8-Glu22GLP-1-CEx-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO21表示。
1 HVEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL61 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK[SEQ ID NO21]Gly8-Glu22GLP-1-C2-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO22表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGASSGAA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL61 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPFNNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK[SEQ ID NO22]Gly8-Glu22GLP-1-CEx-接頭-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO23表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC61 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO23]
Gly8-Glu22GLP-1-CEx-接頭-IgG4氨基酸序列由SEQ ID NO24表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAESKYG61 PPCPSCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE121 VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP181 REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS241 FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK [SEQ ID NO24]Gly8-Glu22GLP-1-CEx-2接頭-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO25表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG61 GGGSGGGGSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD121 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN181 KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG241 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP301 GK[SEQ ID NO25]Gly8-Glu22GLP-1-2接頭-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO26表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG61 SAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV121 KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE181 KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT241 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK[SEQ ID NO26]Gly8-Glu22GLP-1-2CEx-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO27表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSS SGAPPPSAEP KSCDKTHTCP61 PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA121 KTKPREEQYN STYRWWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ181 VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY241 SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK [SEQ ID NO27]Gly8-Glu22-Val25-Ile33GLP-1-CEx-接頭-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO28表示。
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAVK EFIAWLIKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC61 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO28]Exendin-4-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO29表示。
1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL61 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO29]Exendin-4-C2-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO30表示。
1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGASSGAA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL61 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO30]Exendin-4-接頭-IgG1氨基酸序列由SEQ ID NO31表示。
1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC61 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO31]
表5aGLP-1類似物的體外活性GLP-1 受體GLP-1 化合物激活GLP-1(7-37)OH 1.0Val8-GLP-1(7-37)OH 0.47(n＝6)Gly8-His11-GLP-1(7-37)OH0.282Val8-Ala11-GLP-1(7-37)OH0.021Val8-Lys11-GLP-1(7-37)OH0.001Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH0.81Val8-Glu16-GLp-1(7-37)OH0.047
Val8-Ala16-GLP-1(7-37)OH0.112Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH1.175Val8-Lys20-GLP-1(7-37)OH0.33Gln22-GLP-1(7-37)OH 0.42Val8-Ala22-GLP-1(7-37)OH0.56Val8-Ser22-GLP-1(7-37)OH0.50Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH0.40Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH1.29Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH0.58Val8-Pro22-GLP-1(7-37)OH0.01Val8-His22-GLP-1(7-37)OH0.14Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH20.53Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH21.0Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH1.07Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH0.18Val8-His24-GLP-1(7-37)OH0.007
Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH0.02Val8-His26-GLP-1(7-37)OH1.6Val8-Glu26-GLp-1(7-37)OH1.5Val8-His27-GLP-1(7-37)OH0.37Val8-Ala27-GLp-1(7-37)OH0.47Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH0.29Val8-Glu30-GLp-1(7-37)OH0.29Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH0.15Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH0.19Val8-His30-GLP-1(7-37)OH0.19Val8-Glu33-GLP-1(7-37)OH0.039Val8-Ala33-GLP-1(7-37)OH0.1Val8-Gly33-GLP-1(7-37)OH0.01Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH0.17Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH0.094Val8-His35-GLP-1(7-37)OH0.41Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH0.15
Val8-Glu36-GLP-1(7-37)OH 0.11Val8-His36-GLP-1(7-37)OH 0.22Val8-His37-GLP-1(7-37)OH 0.33Val8-Leu16-Glu26-GLP-1(7-37)OH 0.23Val8-Lys22-Glu30-GLP-1(7-37)OH 0.37Val8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH 0.35Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH 1.02Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH 1.43Val8-Lys33-Val34-GLP-1(7-37)OH 0.08Val8-Lys33-Asn34-GLP-1(7-37)OH 0.09Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH 0.34Val8-Gly36-Pro37-GLP-1(7-37)NH20.53
表5bGLP-1類似物的體外活性
表6GLP-1/Exendin類似物的體外活性
實(shí)施例7Val8-GLP-1-IgG1和Val8-GLP-1-HSA的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)在cynomologus猴中進(jìn)行Val8-GLP-1-IgG1和Val8-GLP-1-HSA的藥代動(dòng)力學(xué)研究。給予猴5.6nmol/kg的Val8-GLP-1-IgG1或Val8-GLP-1-HSA。通過(guò)靜脈內(nèi)給藥而給予化合物。在給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、1、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168和216小時(shí)采集血液至含EDTA的試管。用放射免疫測(cè)定進(jìn)行具有免疫反應(yīng)性的Val8-GLP-1的血漿濃度測(cè)定，該測(cè)定使用主要的特異性是針對(duì)Val8-GLP-1(7-37)的N末端(7-16)區(qū)的多克隆抗血清。圖9描述了對(duì)兩只cynomologus猴進(jìn)行單次靜脈內(nèi)給藥后Val8-GLP-1-Fc和Val8-GLP-1-接頭-HSA的血漿濃度。Fc融合蛋白的半衰期大約為45小時(shí)，白蛋白融合體的半衰期大約為87小時(shí)。
實(shí)施例8Exendin-4-IgG1的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)在禁食過(guò)夜后研究?jī)芍婚L(zhǎng)期插入導(dǎo)管的正常雄性獵犬。通過(guò)動(dòng)脈和靜脈血管入口，將導(dǎo)管皮下插入頭靜脈并且縫合。將動(dòng)物置于籠子中，將其導(dǎo)管與旋轉(zhuǎn)/束縛系統(tǒng)連接。通過(guò)頭靜脈導(dǎo)管靜脈內(nèi)注射含融合蛋白Exendin-4-IgG1(11.8WM)的溶液(1.0nmol/kg)。然后用10ml鹽水清洗導(dǎo)管。2小時(shí)后，啟動(dòng)高血糖(150mg/dl)夾，持續(xù)3小時(shí)。在此5小時(shí)的時(shí)間段中取出動(dòng)脈血樣品，用于測(cè)定融合蛋白、葡萄糖和胰島素的血漿濃度。
比較此研究的結(jié)果和以前的相似研究的結(jié)果，在以前的研究中兩只動(dòng)物接受鹽水皮下注射，3小時(shí)后用3小時(shí)高血糖(150mg/dl)夾進(jìn)行研究。
在兩個(gè)系列的研究中，使用Beckman血糖分析儀測(cè)定血漿葡萄糖濃度。由Linco Research公司的雇員采用他們的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的RIA試劑盒測(cè)定血漿胰島素濃度。數(shù)據(jù)表示于圖10和11。
實(shí)施例9Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-接頭-IgG1的體內(nèi)藥代動(dòng)通過(guò)皮下(SC)或靜脈內(nèi)(IV)給藥使兩組各三只正常雄性獵犬接受0.1mg/kg Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-接頭-IgG1。在IV和SC組中，通過(guò)免疫測(cè)定在給藥前30分鐘至給藥后216小時(shí)中采集的樣品中測(cè)定Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-接頭-IgG1的血漿濃度。然后用這些濃度確定報(bào)道的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。IV給予Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-接頭-IgG1的平均清除半衰期為大約55小時(shí)，總清除速度是1.5mL/h/kg。SC給予Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-接頭-IgG1的平均清除半衰期為大約38小時(shí)。
序列表序列表<110>伊萊利利公司<120>GLP-1融合蛋白<130>X-13991<150>US 60/251,954<151>2000-06-12<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>2<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(5)..(5)<223>第5位的Xaa是Thr，Ala，Gly，Ser，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(8)..(8)<223>第8位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Val，Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Tyr，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(11)..(11)<223>第11位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(12)..(12)<223>第12位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，Lys，Trp或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(13)..(13)<223>第13位的Xaa是Tyr，Phe，Trp，Glu，Asp，Gln，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(14)..(14)<223>第14位的Xaa是Leu，Ala，Gly，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，Met，Lys，Trp或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(15)..(15)<223>第15位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，Trp或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是Gln，Asn，Arg，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Arg，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Lys，Arg，Gln，Glu，Asp，或His；<220><221>MISC_特征<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Leu，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(25)..(25)<223>第25位的Xaa是Trp，Phe，Tyr，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(26)..(26)<223>第26位的Xaa是Leu，Gly，Ala，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><22>MISC_特征<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa是Val，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是Asn，Lys，Arg，Glu，Asp，或His；<220><221>MISC_特征<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是Gly，Arg，Lys，Glu，Asp，或His；<220><221>MISC_特征<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Pro，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(32)..(32)<223>第32位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(33)..(33)<223>第33位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(34)..(34)<223>第34位的Xaa是Gly，Asp，Glu，或Lys，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(35)..(35)<223>第35位的Xaa是Ala，Phe，Trp，Tyr，Glu，Asp，或Lys，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(36)..(36)<223>第36位的Xaa是Ser，Pro，Lys，Glu，或Asp，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(37)..(37)<223>第37位的Xaa是Ser，Pro，Glu，Asp，或Lys，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(38)..(38)<223>第38位的Xaa是Gly，Pro，Glu，Asp，或Lys，或去除；<220><221>MISC_特征<222>(39)..(39)<223>第39位的Xaa是Ala，Ser，Val，Glu，Asp，或Lys，或去除；<400>2His Xaa Xaa Gly Xaa Phe Thr Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35<210>3<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>MISC_特征<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是Thr，Ser，Arg，Lys，Trp，Phe，Tyr，Glu，或His；<220><221>MISC_特征<222>(5)..(5)<223>第5位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；<220><221>MISC_特征<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Tyr，Glu，或Ala；<220><221>MISC_特征<222>(12)..(12)<223>第12位的Xaa是His，Pro，Asp，Glu，Arg，Ser，Ala，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(13)..(13)<223>第13位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>MISC_特征<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，Gln，或Arg；<220><221>MISC_特征<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是Glu，Arg，Ala，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Trp，Tyr，Phe，Asp，Lys，Glu，或His；<220><221>MISC_特征<221>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>MISC_特征<222>(25)..(25)<223>第25位的Xaa是Asp，Glu，Ser，Thr，Arg，Trp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(27)..C27)<223>第27位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；<220><221>MISC_特征<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；<220><221>MISC_特征<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；<220><221>MISC_特征<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是Thr，Ser，Asp，Trp，Tyr，Phe，Arg，Glu，或His；<220><221>MISC_特征<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(32)..(32)<223>第31位的Xaa是Pro或去除。<400>3Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Leu Glu Gly1 5 10 15Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Phe Ile Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30<210>4<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>MISC_特征<222>(5)..(5)<223>第5位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；<220><221>MISC_特征<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；<220><221>MISC_特征<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>MISC_特征<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>MISC_特征<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是Glu，His，Ala，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；<220><221>MISC_特征<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>MISC_特征<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；<220><221>MISC_特征<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；<220><221>MISC_特征<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；<220><221>MISC_特征<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是Arg，Glu，或His；<220><221>MISC_特征<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(32)..(32)<223>第32位的Xaa是Pro，或去除。<400>4Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30<210>5<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Met，或Thr；<220><221>MISC_特征<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；<220><221>MISC_特征<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，ASn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>MISC_特征<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>MISC_特征<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；<220><221>MISC_特征<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>MISC_特征<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；<220><221>MISC_特征<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(32)..(32)<223>第32位的Xaa是Pro或去除。<400>5Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Xaa Arg Xaa Xaa20 25 30<210>6<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>MISC_特征<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>MISC_特征<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>MISC_特征<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>MISC_特征<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(32)..(32)<223>第32位的Xaa是Pro或去除。<400>6Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Ala Lys Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa Xaa20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Ala，Gly，Val，Thr，Ile，和α-甲基-Ala；<220><221>MISC_特征<222>(15)..(15)<223>第15位的Xaa是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，和Gly；<220><221>MISC_特征<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，和Gly；<400>7Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>8<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa是Lys或Arg；<220><221>MOD_RES<222>(27)..(27)<223>乙?；?amp;lt;220><221>MISC_特征<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是Gly；<220><221>MOD_RES<222>(30)..(30)<223>酰胺化<400>8Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln1 5 10 15Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210>9<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>9His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>10<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>10His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>11<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，或Val；<220><221>MISC_特征<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu或Val；<220><221>MISC_特征<222>(12)..(12)<223>第12位的Xaa是Lys或Ser；<220><221>MISC_特征<222>(13)..(13)<223>第13位的Xaa是Gln或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(14)..(14)<223>第14位的Xaa是Met或Leu；<220><221>MISC_特征<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Glu或Gln；<220><221>MISC_特征<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是Glu或Gln；<220><221>MISC_特征<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa是Val或Ala；<220><221>MISC_特征<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Arg或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Leu或Glu；<220><221>MISC_特征<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Glu或Ala；<220><221>MISC_特征<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa是Val或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是Asn或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是Gly或Arg；和<220><221>MISC_特征<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Gly，或Pro；<220><221>MISC_特征<222>(32)..(32)<223>第31位的Xaa是Ser，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(33)..(33)<223>第33位的Xaa是Ser，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(34)..(34)<223>第34位的Xaa是Gly，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(35)..(35)<223>第35位的Xaa是Ala，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(36)..(36)<223>第36位的Xaa是Pro，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(37)..(37)<223>第37位的Xaa是Pro，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(38)..(38)<223>第38位的Xaa是Pro，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(39)..(39)<223>第39位的Xaa是Pro，或缺乏。<220><221>MISC_特征<222>(39)..(39)<223>第38位的Xaa是Ser，或缺乏。<400>11Xaa Xaa Glu Glu Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35<210>12<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或去除。<220><221>MISC_特征<222>(2)..(2)<223>Xaa at position 2 is Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，or Thr；<220><221>MISC_特征<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是Phe，Trp，或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；<220><221>MISC_特征<222>(12)..(12)<223>第12位的Xaa是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val；<220><221>MISC_特征<222>(13)..(13)<223>第13位的Xaa是Tyr，Trp，或Phe；<220><221>MISC_特征<222>(14)..(14)<223>第14位的Xaa是Leu，Phe，Tyr，或Trp；<220><221>MISC_特征<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Glu，Asp，或Lys；<220><221>MISC_特征<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa是Ala，Val，Ile，或Leu；<220><221>MISL_特征<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Glu，Ile，或Ala；<220><221>MISC_特征<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala或Glu；<220><221>MISC_特征<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa是Val或Ile；和<220><221>MOD_RES<222>(30)..(30)<223>酰胺化<220><221>MISC_特征<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Gly，His或缺乏。<400>12Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210>13<211>616<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>13His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Asp20 25 30Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu35 40 45Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln50 55 60Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe65 70 75 80Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser85 90 95Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg100 105 110Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu115120 125Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro130 135 140Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp145 150 155 160Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg165 170 175His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr180 185 190Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys195 200 205Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser210 215 220Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg225 230 235 240Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys245 250 255Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val260 265 270His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg275 280 285Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser290 295 300Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys305 310 315 320Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu325 330 335Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu340345 350Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg355 360 365His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr370 375 380Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys385 390 395400Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln405 410 415Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr420 425 430Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln435 440 445Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val450 455 460Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala465 470 475 480Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu485 490 495Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu500 505 510Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr515 520 525Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile530 535 540Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu545 550 555 560Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys565 570 575Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala580 585 590Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala595 600 605Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu610 615<210>14<211>631<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>14His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly20 25 30Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala35 40 45His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn50 55 60Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys65 70 75 80Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala85 90 95Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu100 105 110His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu115 120 125Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg130 135 140Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg145 150 155 160Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn165 170 175Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His180 185 190Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys195 200 205Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu210 215 220Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala225 230 235 240Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala245 250 255Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala260 265 270Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His275 280 285Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala290 295 300Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys305 310 315 320Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile325 330 335Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala340 345 350Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala355 360 365Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His370 375 380Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu385 390 395 400Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr405 410 415Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn420 425 430Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys435 440 445Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val450 455 460Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly465 470 475 480Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu485 490 495Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys500 505 510Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val515 520 525Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val530 535 540Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys545 550 555 560Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lvs Lys Gln Thr Ala Leu Val565 570 575Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala580 585 590Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp595 600 605Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala610 615 620Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu625 630<210>15<211>640<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>15His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly35 40 45Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His50 55 60Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile65 70 75 80Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys85 90 95Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu100 105 110Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys115 120 125Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp130 135 140Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His145 150 155 160Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp165 170 175Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys180 185 190Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu195 200 205Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys210 215 220Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu225 230 235 240Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala245 250 255Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala260 265 270Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys275 280 285Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp290 295 300Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Tle Cys305 310 315 320Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys325 330 335Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu340 345 350Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys355 360 365Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met370 375 380Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu385 390 395 400Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys405 410 415Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe420 425 430Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu435 440 445Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val450 455 460Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu465 470 475 480Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro485 490 495Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu500 505 510Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val515 520 525Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Ary Pro Cys Phe Ser530 535 540Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu545 550 555 560Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg565 570 575Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro580 585 590Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala595 600 605Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala610 615 620Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu625 630 635 640<210>16<211>624<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>16His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His35 40 45Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile50 55 60Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys65 70 75 80Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu85 90 95Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys100 105110Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp115 120 125Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His130 135140Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp145 150 155 160Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys165 170 175Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu180 185 190Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys195 200 205Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu210 215 220Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala225 230 235 240Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala245 250 255Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys260 265 270Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp275 280 285Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys290 295 300Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys305 310 315 320Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu325 330 335Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys340 345 350Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met355 360 365Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu370 375 380Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys385 390 395 400Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe405 410 415Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu420 425 430Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val435 440 445Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu450 455 460Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro465 470 475 480Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu485 490 495Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val500 505 510Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser515 520 525Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu530 535 540Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg545 550 555 560Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro565 570 575Lys Ala Thr Lys Gly Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala580 585 590Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala595 600 605Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu610 615 620<210>17<211>640<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>17His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly 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270<210>30<211>272<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>30His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ala Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr35 40 45His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser50 55 60Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg65 70 75 80Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro85 90 95Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala100 105 110Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val115 120 125Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr130 135 140Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr145 150 155 160Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu165 170 175Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys180 185 190Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 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Arg Val Val Ser130 135 140Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys145 150 155 160Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile165 170 175Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro180 185 190Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu195 200 205Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn210 215 220Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser225 230 235 240Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg245 250 255Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu260 265 270His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys275 280 285<210>32<211>232<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>32Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10 15Ala Pro Glu Lys Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Lys Met Tle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230<210>33<211>703<212>DNA<213>人(Homo sariens)<400>33gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg120acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc180aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag240tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat300ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc360atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg420gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc480gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct540cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc600aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac660tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgat agt 703<210>34<211>585<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>34Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65 70 75 80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg325 330 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr340 345 350Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu355 360 365Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro370 375 380Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu385 390 395 400Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro405 410 415Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys420 425 430Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys435 440 445Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His450 455 460Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser465 470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr485 490 495Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp500 505 510Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala515 520 525Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu530 535 540Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys545550 555 560Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val565 570 575Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu580 585<210>35<211>1762<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>35gatgcgcaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta120aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa180aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt240cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa300tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt360gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat420gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg480tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca540aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt600gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat1020tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc1080tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt1140gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag1200tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact1260ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat1320cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta1380tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc1440ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa1500gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag1560agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca1620aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag1680gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa1740gctgccttag gcttataatg ac 176權(quán)利要求
1.一種異源融合蛋白，包含第一個(gè)多肽，該多肽具有N末端和與具有N末端和C末端的第二個(gè)多肽融合的C末端，其中第一個(gè)多肽是GLP-1化合物，并且第二個(gè)多肽選自a)人白蛋白；b)人白蛋白類似物；和c)人白蛋白的片段，并且其中第一個(gè)多肽的C末端與第二個(gè)多肽的N末端融合。
2.一種異源融合蛋白，包含第一個(gè)多肽，該多肽具有N末端和與具有N末端和C末端的第二個(gè)多肽融合的C末端，其中第一個(gè)多肽是GLP-1化合物，并且第二個(gè)多肽選自a)人白蛋白；b)人白蛋白類似物；和c)人白蛋白的片段，并且其中第一個(gè)多肽的C末端通過(guò)肽接頭與第二個(gè)多肽的N末端融合。
3.權(quán)利要求2的異源融合蛋白，其中肽接頭選自a)富含甘氨酸的肽；b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1，2，3，4，5或6；和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
4.權(quán)利要求1、2或3的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式I[SEQ ID NO2]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-40 41 42 43 44 45Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa式I(SEQ ID NO2)其中第8位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第9位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；第11位的Xaa是Thr，Ala，Gly，Ser，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第14位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第16位的Xaa是Val，Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Tyr，Glu，Asp，Trp，或Lys；第17位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第18位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，Trp，Tyr，或Lys；第19位的Xaa是Tyr，Phe，Trp，Glu，Asp，Gln，或Lys；第20位的Xaa是Leu，Ala，Gly，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，Met，Trp，Tyr，或Lys；第21位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；第22位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第23位的Xaa是Gln，Asn，Arg，Glu，Asp，或Lys；第24位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Arg，Glu，Asp，或Lys；第25位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第26位的Xaa是Lys，Arg，Gln，Glu，Asp，或His；第27位的Xaa是Leu，Glu，Asp，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第31位的Xaa是Trp，Phe，Tyr，Glu，Asp，或Lys；第32位的Xaa是Leu，Gly，Ala，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第33位的Xaa是Val，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Glu，Asp，或Lys；第34位的Xaa是Asn，Lys，Arg，Glu，Asp，或His；第35位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第36位的Xaa是Gly，Arg，Lys，Glu，Asp，或His；第37位的Xaa是Pro，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第38位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或被去除；第39位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或被去除；第40位的Xaa是Gly，Asp，Glu，或Lys，或被去除；第41位的Xaa是Ala，Phe，Trp，Tyr，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第42位的Xaa是Ser，Pro，Lys，Glu，或Asp，或被去除；第43位的Xaa是Ser，Pro，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第44位的Xaa是Gly，Pro，Glu，Asp，或Lys，或被去除；并且第45位的Xaa是Ala，Ser，Val，Glu，Asp，或Lys，或被去除；前提是當(dāng)?shù)?7，38，39，40，41，42，43或44位的氨基酸被去除時(shí)，該氨基酸下游的每個(gè)氨基酸也被去除。
5.權(quán)利要求1、2或3的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式II[SEQ ID NO3]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa式 II(SEQ ID NO3)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第9位的Xaa是Thr，Ser，Arg，Lys，Trp，Phe，Tyr，Glu，或His；第11位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Tyr，Glu，或Ala；第18位的Xaa是His，Pro，Asp，Glu，Arg，Ser，Ala，或Lys；第19位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，Gln，或Arg；第24位的Xaa是Glu，Ar g，Ala，或Lys；第26位的Xaa是Trp，Tyr，Phe，Asp，Lys，Glu，或His；第27位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第31位的Xaa是Asp，Glu，Ser，Thr，Arg，Trp，或Lys；第33位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；第34位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第36位的Xaa是Thr，Ser，Asp，Trp，Tyr，Phe，Arg，Glu，或His；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
6.權(quán)利要求1、2或3的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式III[SEQ ID NO4]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Ala-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa式 III(SEQ ID NO4)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第11位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第24位的Xaa是Glu，His，Ala，或Lys；第25位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；第27位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第33位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；第34位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第36位的Xaa是Arg，Glu，或His；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
7.權(quán)利要求1、2或3的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式IV[SEQ ID NO5]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-Xaa式 IV(SEQ ID NO5)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第26位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被去除。
8.權(quán)利要求1、2或3的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式V[SEQ ID NO6]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Lys-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa式 V(SEQ ID NO6)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第24位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
9.權(quán)利要求1、2或3的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式VIII[SEQ ID NO11]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa式 VIII(SEQ ID NO11)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，或Val；第16位的Xaa是Leu或Val；第18位的Xaa是Lys或Ser；第19位的Xaa是Gln或Tyr；第20位的Xaa是Met或Leu；第22位的Xaa是Glu或Gln；第23位的Xaa是Glu，或Gln；第25位的Xaa是Val或Ala；第26位的Xaa是Arg或Lys；第27位的Xaa是Leu或Glu；第30位的Xaa是Glu或Ala；第33位的Xaa是Val或Lys；第34位的Xaa是Asn或Lys；第36位的Xaa是Gly或Arg；并且第37位的Xaa是Gly，Pro，Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，或不存在。
10.權(quán)利要求1-9的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)6個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
11.權(quán)利要求10的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)5個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
12.權(quán)利要求11的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)4個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
13.權(quán)利要求12的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)3個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
14.權(quán)利要求13的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
15.權(quán)利要求1-14的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中第8位的Xaa是甘氨酸或纈氨酸。
16.權(quán)利要求8的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸，并且第8位的Xaa是甘氨酸或纈氨酸，并且第30位的Xaa是丙氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，絲氨酸，或組氨酸。
17.權(quán)利要求16的異源融合蛋白，其中第30位的Xaa是谷氨酸。
18.權(quán)利要求8的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸，并且第8位的Xaa是甘氨酸或纈氨酸，并且第37位的Xaa是組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，精氨酸，或賴氨酸。
19.權(quán)利要求18的異源融合蛋白，其中第37位的Xaa是組氨酸。
20.權(quán)利要求8的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸，并且第8位的Xaa是甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸，并且第22位的Xaa是天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或組氨酸。
21.權(quán)利要求20的異源融合蛋白，其中第22位的Xaa是賴氨酸或谷氨酸。
22.權(quán)利要求8的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物是Val8-GLP-1(7-37)。
23.權(quán)利要求8的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物是Gly8-GLP-1(7-37)。
24.權(quán)利要求1-23的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是人白蛋白。
25.權(quán)利要求24的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽具有SEQ ID NO34的序列。
26.權(quán)利要求1-23的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是白蛋白的N末端片段。
27.一種異源融合蛋白，包含第一個(gè)多肽，該多肽具有N末端和與具有N末端和C末端的第二個(gè)多肽融合的C末端，其中第一個(gè)多肽是GLP-1化合物，并且第二個(gè)多肽選自a)免疫球蛋白的Fc部分；b)免疫球蛋白的Fc部分的類似物；和c)免疫球蛋白的Fc部分的片段，并且其中第一個(gè)多肽的C末端與第二個(gè)多肽的N末端融合。
28.一種異源融合蛋白，包含第一個(gè)多肽，該多肽具有N末端和與具有N末端和C末端的第二個(gè)多肽融合的C末端，其中第一個(gè)多肽是GLP-1化合物，并且第二個(gè)多肽選自a)免疫球蛋白的Fc部分；b)免疫球蛋白的Fc部分的類似物；和c)免疫球蛋白的Fc部分的片段，并且其中第一個(gè)多肽的C末端通過(guò)肽接頭與第二個(gè)多肽的N末端融合。
29.權(quán)利要求28的異源融合蛋白，其中肽接頭選自a)富含甘氨酸的肽；b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1，2，3，4，5或6；和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
30.權(quán)利要求27、28或29的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式I[SEQ ID NO2]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-40 41 42 43 44 45Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa式 I(SEQ ID NO2)其中第8位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第9位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；第11位的Xaa是Thr，Ala，Gly，Ser，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第14位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第16位的Xaa是Val，Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Tyr，Glu，Asp，Trp，或Lys；第17位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第18位的Xaa是Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，Trp，Tyr，或Lys；第19位的Xaa是Tyr，Phe，Trp，Glu，Asp，Gln，或Lys；第20位的Xaa是Leu，Ala，Gly，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，Met，Trp，Tyr，或Lys；第21位的Xaa是Glu，Asp，或Lys；第22位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第23位的Xaa是Gln，Asn，Arg，Glu，Asp，或Lys；第24位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Arg，Glu，Asp，或Lys；第25位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第26位的Xaa是Lys，Arg，Gln，Glu，Asp，或His；第27位的Xaa是Leu，Glu，Asp，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第31位的Xaa是Trp，Phe，Tyr，Glu，Asp，或Lys；第32位的Xaa是Leu，Gly，Ala，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第33位的Xaa是Val，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Glu，Asp，或Lys；第34位的Xaa是Asn，Lys，Arg，Glu，Asp，或His；第35位的Xaa是Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；第36位的Xaa是Gly，Arg，Lys，Glu，Asp，或His；第37位的Xaa是Pro，Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第38位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或被去除；第39位的Xaa是Ser，Arg，Lys，Glu，Asp，或His，或被去除；第40位的Xaa是Gly，Asp，Glu，或Lys，或被去除；第41位的Xaa是Ala，Phe，Trp，Tyr，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第42位的Xaa是Ser，Pro，Lys，Glu，或Asp，或被去除；第43位的Xaa是Ser，Pro，Glu，Asp，或Lys，或被去除；第44位的Xaa是Gly，Pro，Glu，Asp，或Lys，或被去除；并且第45位的Xaa是Ala，Ser，Val，Glu，Asp，或Lys，或被去除；前提是當(dāng)?shù)?7，38，39，40，41，42，43或44位的氨基酸被去除時(shí)，該氨基酸下游的每個(gè)氨基酸也被去除。
31.權(quán)利要求27、28或29的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式II[SEQ ID NO3]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa式 II(SEQ ID NO3)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第9位的Xaa是Thr，Ser，Arg，Lys，Trp，Phe，Tyr，Glu，或His；第11位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Tyr，Glu，或Ala；第18位的Xaa是His，Pro，Asp，Glu，Arg，Ser，Ala，或Lys；第19位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，Gln，或Arg；第24位的Xaa是Glu，Arg，Ala，或Lys；第26位的Xaa是Trp，Tyr，Phe，Asp，Lys，Glu，或His；第27位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第31位的Xaa是Asp，Glu，Ser，Thr，Arg，Trp，或Lys；第33位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；第34位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第36位的Xaa是Thr，Ser，Asp，Trp，Tyr，Phe，Arg，Glu，或His；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
32.權(quán)利要求27、28或29的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式III[SEQ ID NO4]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Ala-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R式 III(SEQ ID NO4)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第11位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第24位的Xaa是Glu，His，Ala，或Lys；第25位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；第27位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第33位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；第34位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第36位的Xaa是Arg，Glu，或His；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
33.權(quán)利要求27、28或29的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式IV[SEQ ID NO5]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-Xaa式 IV(SEQ ID NO5)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第12位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；第16位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第26位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第35位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被去除。
34.權(quán)利要求27、28或29的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式V[SEQ ID NO6]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Lys-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa式 V(SEQ ID NO6)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；第22位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；第23位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；第24位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；第30位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；第37位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，Gly，Gly-Pro，或被去除。
35.權(quán)利要求27、28或29的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式VIII[SEQ ID NO11]的序列7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-R式 VIII(SEQ ID NO11)其中第7位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；第8位的Xaa是Gly，Ala，或Val；第16位的Xaa是Leu或Val；第18位的Xaa是Lys或Ser；第19位的Xaa是Gln或Tyr；第20位的Xaa是Met或Leu；第22位的Xaa是Glu或Gln；第23位的Xaa是Glu，或Gln；第25位的Xaa是Val或Ala；第26位的Xaa是Arg或Lys；第27位的Xaa是Leu或Glu；第30位的Xaa是Glu或Ala；第33位的Xaa是Val或Lys；第34位的Xaa是Asn或Lys；第36位的Xaa是Gly或Arg；并且第37位的Xaa是Gly，Pro，Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，或不存在。
36.權(quán)利要求27-35的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)6個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
37.權(quán)利要求36的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)5個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
38.權(quán)利要求37的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)4個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
39.權(quán)利要求38的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)3個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
40.權(quán)利要求39的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)OH或Exendin-4中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸。
41.權(quán)利要求27-40的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中第8位的Xaa是甘氨酸或纈氨酸。
42.權(quán)利要求34的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸，并且第8位的Xaa是甘氨酸或纈氨酸，并且第30位的Xaa是丙氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，絲氨酸，或組氨酸。
43.權(quán)利要求42的異源融合蛋白，其中第30位的Xaa是谷氨酸。
44.權(quán)利要求34的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸，并且第8位的Xaa是甘氨酸或纈氨酸，并且第37位的Xaa是組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，精氨酸，或賴氨酸。
45.權(quán)利要求44的異源融合蛋白，其中第37位的Xaa是組氨酸。
46.權(quán)利要求34的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超過(guò)2個(gè)不同于GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)OH中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸，并且第8位的Xaa是甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸，并且第22位的Xaa是天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或組氨酸。
47.權(quán)利要求46的異源融合蛋白，其中第22位的Xaa是賴氨酸或谷氨酸。
48.權(quán)利要求34的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物是Val8-GLP-1(7-37)。
49.權(quán)利要求34的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物是Gly8-GLP-1(7-37)。
50.權(quán)利要求27-49的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是選自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgE，IgA，IgD，或IgM的Ig的Fc部分。
51.權(quán)利要求27-50的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是選自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的Ig的Fc部分。
52.權(quán)利要求51的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是IgG1免疫球蛋白的Fc部分。
53.權(quán)利要求51的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是IgG4免疫球蛋白的Fc部分。
54.權(quán)利要求50-53的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中IgG是人IgG。
55.權(quán)利要求27-54的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中Fc部分包括鉸鏈區(qū)，CH2，和CH3結(jié)構(gòu)域。
56.權(quán)利要求52的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽具有SEQ ID NO32的序列。
57.編碼權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白的多核苷酸。
58.包含權(quán)利要求57的多核苷酸的載體。
59.包含權(quán)利要求58的載體的宿主細(xì)胞。
60.表達(dá)至少一種權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白的宿主細(xì)胞。
61.權(quán)利要求60的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
62.一種產(chǎn)生異源融合蛋白的方法，包括在以可檢測(cè)量表達(dá)異源融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯權(quán)利要求57的多核苷酸的步驟。
63.一種使有需要的哺乳動(dòng)物中的血糖水平正常化的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白。
64.一種治療非胰島素依賴型糖尿病患者的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白。
65.一種治療肥胖的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白。
66.權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白在制備用于治療非胰島素依賴型糖尿病患者的藥物中的用途。
67.權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白在制備用于治療肥胖患者的藥物中的用途。
68.一種適用于治療非胰島素依賴型糖尿病患者的藥物制劑，包含權(quán)利要求1-56的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白。
69.權(quán)利要求1、2或3的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式IX[SEQ ID NO12]的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37式 IX(SEQ ID NO12)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是Phe，Trp，或Tyr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa18是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val；Xaa19是Tyr，Trp，或Phe；Xaa20是Leu，Phe，Tyr，或Trp；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa27是Glu，Ile，或Ala；Xaa30是Ala或Glu；Xaa33是Val，或Ile；并且Xaa37是Gly，His，NH2，或不存在。
70.權(quán)利要求69的異源融合蛋白，其中其中第二個(gè)多肽是人白蛋白。
71.權(quán)利要求70的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽具有SEQ ID NO34的序列。
72.權(quán)利要求69的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是白蛋白的N末端片段。
73.權(quán)利要求27、28或29的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物包含式IX[SEQ ID NO12]的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37式 IX(SEQ ID NO12)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是Phe，Trp，或Tyr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa18是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val；Xaa19是Tyr，Trp，或Phe；Xaa20是Leu，Phe，Tyr，或Trp；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa27是Glu，Ile，或Ala；Xaa30是Ala或Glu；Xaa33是Val，或Ile；并且Xaa37是Gly，His，NH2，或不存在。
74.權(quán)利要求73的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是選自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgE，IgA，IgD，或IgM的Ig的Fc部分。
75.權(quán)利要求73或74的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是選自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的Ig的Fc部分。
76.權(quán)利要求75的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是IgG1免疫球蛋白的Fc部分。
77.權(quán)利要求75的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽是IgG4免疫球蛋白的Fc部分。
78.權(quán)利要求73的異源融合蛋白，其中IgG是人IgG。
79.權(quán)利要求75的異源融合蛋白，其中第二個(gè)多肽具有SEQ ID NO32的序列。
80.權(quán)利要求69-79的任意一項(xiàng)的異源融合蛋白，其中GLP-1化合物選自Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr12-GLP-1(7-36)，Val8-Trp12-GLP-1(7-37)，Val8-Leu16-GLP-1(7-37)，Val8-Val16-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)，Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Leu25-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr12-Tyr16-GLP-l(7-37)，Val8-Trp12-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Trp16-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Ile16-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Trp18-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr18-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Lys18-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Trp19-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Phe19-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Phe20-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-Leu25-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-Ile25-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-Val25-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-Ile27-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-Ile33-GLP-1(7-37)，Val8-Asp9-Ile11-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Tyr16-Trp19-Glu22-GLP-1(7-37)，Val8-Trp16-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7-37)，Val8-Trpp16-Glu22-Ile33-GLP-1(7-37)，Val8-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7-37)，Val8-Trp16-Glu22-Val25-GLP-1(7-37)，和Val8-Cys16-Lys26-GLP-1(7-37)。
全文摘要
本發(fā)明涉及與一些蛋白融合的胰高血糖素樣－1化合物，所述蛋白具有延長(zhǎng)胰高血糖素樣－1化合物的體內(nèi)半衰期的作用。這些融合蛋白可以用于治療非胰島素依賴型糖尿病和各種狀況。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1483041SQ01820232
公開(kāi)日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2001年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月7日
發(fā)明者W·格萊斯納, R·米卡諾維克, 張盛虹, W 格萊斯納, ㄅ滴 申請(qǐng)人:伊萊利利公司