專利名稱：用于檢測rgs蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)物的方法和細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對信息素(pheromone)應答和表達報道基因的新的細胞，所述報道基因可操作地與信息素應答啟動子連接。在一些實施方式中，報道分子是海腎熒光素酶(Renilla luciferase)，蟲熒光素酶(Photinusluciferase)，綠色熒光蛋白質(zhì)，或綠色熒光蛋白質(zhì)的衍生物。在其它實施方式中，細胞也表達異源的G蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)物(“RGS蛋白質(zhì)”)。
在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及篩選調(diào)節(jié)RGS蛋白質(zhì)的化合物的方法，其中，該方法利用了本發(fā)明新的細胞。
背景技術(shù)：
G蛋白質(zhì)信號途徑是用于轉(zhuǎn)遞細胞外信號，如神經(jīng)遞質(zhì)，激素，有氣味的物體和光的最重要信號級聯(lián)放大之一。在各種生物體，包括酵母和哺乳動物中已經(jīng)鑒定了該途徑。通常，該系統(tǒng)由3個主要成分組成G蛋白質(zhì)偶聯(lián)的受體(GPCRs)，具有α，β和γ亞基的異源三聚體G蛋白質(zhì)和細胞內(nèi)效應物(Gilman，1987)。最近，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)RGS家族。RGS蛋白質(zhì)提供了細胞能精確調(diào)節(jié)通過G蛋白質(zhì)途徑產(chǎn)生的信號持續(xù)時間和大小的機理(Kehrl等，1999)。本發(fā)明涉及修飾的宿主系統(tǒng)，其能用于分離和表征調(diào)節(jié)RGS蛋白質(zhì)的新的因子。該因子顯示了控制和治療由不適當G蛋白質(zhì)信號途徑活性引起的疾病的巨大可能性。
一旦GPCR激活，G蛋白質(zhì)信號途徑就開始了，GPCR是以其7個跨膜結(jié)構(gòu)域為特征。當刺激GPCR時，它的細胞內(nèi)的環(huán)和C-末端尾與相關(guān)G蛋白質(zhì)相互作用(Wieland等，1999)。然后，G蛋白質(zhì)的Gα亞基釋放二磷酸鳥苷(GDP)，并且在其位置結(jié)合三磷酸鳥苷(GTP)。GTP的結(jié)合改變了Gα亞基的形狀或三維構(gòu)型，引起了異源三聚體解離為GTP-配體的Gα亞基和Gβγ二聚體。然后，釋放的亞基是游離的以誘導下游信號活動，最終介導生物化學反應，細胞生理學的改變，或其它細胞應答。當Gα亞基水解GTP，返回到GDP結(jié)合狀態(tài)時，信號終止，隨后與Gβγ亞基重新裝配以形成失活的異源三聚體(Kehrl，1998)。
為了誘導適合的細胞應答，必需嚴密地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號的強度。盡管該系統(tǒng)存在許多種類型的調(diào)節(jié)，如GPCRs磷酸化作用，受體結(jié)合蛋白質(zhì)，和Gβγ捕獲蛋白質(zhì)，但是許多研究人員致力于GTP酶活化蛋白質(zhì)(GAPs)(參見，Wieland等，1999)。GAPs加速Gα-GTP酶水解的速率，因此降低途徑中產(chǎn)生的信號和“脫敏”該系統(tǒng)(DeVries等，1999)。
RGS蛋白質(zhì)代表一類相對新的GAPs。該家族的第一個成員是從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)獲得(Dohlman等，1996；Weiland等，1999)。鑒定了單倍體突變體，其對信息素誘導的細胞周期停滯，一種GPCR途徑介導的應答，是超敏感的。研究表明突變的基因產(chǎn)物，Sst2作為GAP與G蛋白質(zhì)Gα亞基相互作用。因此，Sst2作為該系統(tǒng)負調(diào)節(jié)物起作用，控制酵母的成熟。隨后，在許多物種中，鑒定了更多的RGS家族成員，包括哺乳動物中的20多種不同成員(Zheng等，1999)。推測通過可選的剪接，大大增加了RGS蛋白質(zhì)的所有組成成員(Panetta等，1999)。
除了作為活化Gα亞基的GAPs作用外，也已經(jīng)報告了RGS蛋白質(zhì)刺激Gβγ介導途徑的作用。盡管RGS蛋白質(zhì)對Gα-GTP有顯著較高的親和性，但是RGS蛋白質(zhì)對Gα-GDP有較低的親和性。當RGS蛋白質(zhì)與Gα-GDP結(jié)合時，Gβγ蛋白質(zhì)保持游離以介導下游活動(參見Panetta等，1999)。因此，RGS蛋白質(zhì)以多于一個途徑來調(diào)節(jié)G蛋白質(zhì)信號途徑可能是至關(guān)重要的。
因為RGS家族的大小和RGS蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)G蛋白質(zhì)信號途徑中的決定性作用，科學家已經(jīng)開始研究個體RGS蛋白質(zhì)是如何達到它們的特異性的。一個水平的特異性是由不同RGS蛋白質(zhì)的表達模式引起的；一些RGS蛋白質(zhì)在特定組織表達，而一些則普遍表達(Zheng等，1999；Panetta等，1999)。推測不同RGS蛋白質(zhì)對個體Gα-亞基可能有不同特異性(Kehrl等，1998)。這將使一些RGS蛋白質(zhì)優(yōu)先于其它RGS蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)一些G蛋白質(zhì)信號途徑(Zheng等，1999)，或偏向于來源于單一GPCR的雙Gα應答。
通過RGS蛋白質(zhì)濃度或活性的調(diào)節(jié)也可以達到G蛋白質(zhì)信號途徑的控制。例如，通過生物化學反饋機理可以改變RGS蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄(參見Panetta等，1999)。已表明血小板活化因子觸發(fā)B細胞的RGSl表達，而碳酰膽堿誘導RGS16的表達。相反地，負調(diào)節(jié)RGS4表達以應答細胞內(nèi)cAMP水平。
通過報道基因的應用，許多基于細胞的研究平臺將目的基因或藥物的期望效果與細胞表現(xiàn)型的改變聯(lián)系起來。酵母系統(tǒng)中，例如，報道基因通常集中在用于選擇培養(yǎng)基上細胞生長的營養(yǎng)缺陷型基因，或用于比色端點檢測β-半乳糖苷酶活性測定的LacZ基因。編碼熒光素酶的基因，例如來源于海洋海腎(Renilla reniformis)和北美螢火蟲(Photinuspyralis)，作為報道基因在酵母中也是有用的。熒光素酶報道基因提供了檢測敏感性，速度，簡易，信噪比的增加，而且提供了基于酵母測定的高質(zhì)量的定量數(shù)據(jù)，用于無數(shù)的靶鑒定和藥物發(fā)現(xiàn)應用。在酵母中應用熒光素酶報道基因?qū)诮湍傅臏y定，如RGS蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)物的測定提供了明顯的改進。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實施方式中，本發(fā)明涉及鑒定能夠調(diào)節(jié)RGS蛋白質(zhì)的化合物的方法，例如，直接或間接與RGS蛋白質(zhì)本身相互作用的化合物。在文獻中可以發(fā)現(xiàn)該因子的線索。例如，RGS3和RGS12都有預測呈卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域；該結(jié)構(gòu)域常常介導與細胞的細胞骨架蛋白質(zhì)的相互作用(Kehr等，1998)。這可以允許RGS蛋白質(zhì)在與膜結(jié)合和胞質(zhì)庫中變動，因此改變了在特定時間RGS蛋白質(zhì)的可用性和/或影響了RGS蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的Gα-亞基類型(DeVries等，1999)。
本發(fā)明新的修飾細胞，和與這些細胞結(jié)合的新的方法提供了用于檢測影響RGS蛋白質(zhì)的物質(zhì)的重要進步。目前，沒有一個人研究出系統(tǒng)地檢測能調(diào)節(jié)RGS活性的化合物的有效和特異的篩選系統(tǒng)。該化合物有巨大治療價值，因為它們能潛在地調(diào)節(jié)一個或許多G蛋白質(zhì)途徑，該G蛋白質(zhì)途徑介導大量的生物過程，并且是多種疾病的基礎。此外，藥理學家估計目前所用所有藥物，其中達到60％通過G蛋白質(zhì)信號途徑發(fā)揮它們的作用(Roush，1996)。通過揭示調(diào)節(jié)這些系統(tǒng)的新的因子，可以評估與這些藥物中許多藥物有關(guān)的藥物耐藥性現(xiàn)象。
在一方面，本發(fā)明涉及對信息素應答的細胞，包括編碼適合報道分子，可操作地與信息素應答啟動子連接的異源核酸，其中報道分子是，例如海腎熒光素酶，蟲熒光素酶，綠色熒光蛋白質(zhì)，或綠色熒光蛋白質(zhì)的衍生物。細胞可以是哺乳動物細胞或酵母細胞。在特定實施方式中，酵母細胞是釀酒酵母，裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)，或巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)，優(yōu)選釀酒酵母。
編碼啟動子的異源核酸可以包含在載體，例如質(zhì)粒中。在可選的實施方式中，異源核酸整合進入細胞基因組。
在一些實施方式中，信息素應答啟動子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1，AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
在另一方面，本發(fā)明細胞可以進一步包含編碼RGS蛋白質(zhì)的異源核酸。RGS蛋白質(zhì)可以缺乏Gγ-樣(“GGL”)或散亂EGL-10血小板白細胞C激酶底物(“DEP”)結(jié)構(gòu)域。在可選實施方式中，細胞將進一步包含與異源RGS蛋白質(zhì)對應的編碼天然RGS蛋白質(zhì)的內(nèi)源核酸，其中突變該內(nèi)源核酸，這樣其不產(chǎn)生功能的天然RGS蛋白質(zhì)。突變是缺失、插入或置換中的一種。
任何RGS蛋白質(zhì)都適合用于本發(fā)明，包括RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、P115RhoGEF，和其同種型，或含有RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。其中蛋白質(zhì)含有RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域可以是PLCB或cGMP PDE的γ亞基。優(yōu)選地，RGS蛋白質(zhì)是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。在一些實施方式中，RGS蛋白質(zhì)缺少GGL或DEP結(jié)構(gòu)域。
在一些實施方式中，細胞將進一步包含編碼Gβ5的異源核酸。在特定實施方式中，Gβ5是人的。
在一些實施方式中，RGS蛋白質(zhì)是嵌合體。該嵌合體可以包含RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺失GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9，RGS4的N-末端和具有GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9，RGS4的N-末端和axin的RGS結(jié)構(gòu)域，或其部分。
在特定實施方式中，RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57，RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470，RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332，RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206，axin RGS結(jié)構(gòu)域包含axin的氨基酸199-345。
本發(fā)明包括含有編碼嵌合RGS蛋白質(zhì)異源核酸的細胞，如上述。該細胞可以是哺乳動物細胞或酵母細胞。在特定實施方式中，酵母細胞是釀酒酵母，裂殖酵母或巴斯德畢赤酵母，優(yōu)選釀酒酵母。
編碼嵌合RGS蛋白質(zhì)的異源核酸可以包含于載體，如質(zhì)粒中。在可選實施方式中，異源核酸整合進入細胞基因組。
本發(fā)明另一個方面涉及編碼嵌合蛋白質(zhì)的分離核酸。嵌合RGS蛋白質(zhì)可以是上述任何一種。分離的核酸可以插入載體，如質(zhì)?；虿《?。質(zhì)?？梢允堑涂截悢?shù)的質(zhì)粒。
在進一步的另一方面，本發(fā)明是檢測實驗樣品改變RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因表達能力的方法，該方法包括(a)提供至少一種對信息素應答的第一細胞，其中該第一細胞包含編碼報道分子的異源核酸，該異源核酸可操作地與信息素應答啟動子連接，其中異源核酸的表達產(chǎn)生可檢測的信號；(b)提供至少一種對信息素應答的第二細胞，其中該第二細胞包含編碼報道分子的異源核酸和編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸，所述編碼報道分子的異源核酸可操作地與信息素應答啟動子連接，并且該異源核酸的表達產(chǎn)生可檢測的信號；(b)在信息素存在的情況下和在適合檢測可檢測信號的條件下，將實驗樣品與第一或第二細胞一起溫育；(c)檢測編碼報道分子的異源核酸的表達水平；和(d)比較第一細胞和第二細胞中的表達水平，其中表達水平的差異表明實驗樣品改變了RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因的表達。
為了實施本發(fā)明的方法，可以利用本發(fā)明的任何適合的細胞，如上述的細胞。
在一個實施方式中，可以用單一濃度的實驗樣品實施本方法，或可選地，實驗樣品可以用于一個濃度范圍。
在實施本發(fā)明方法中，可以用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法完成報道基因表達水平的檢測。在一些實施方式中，用暈圈測定法(halo assay)完成報道基因的檢測。在可選的實施方式中，用分光光度計測量檢測報道基因的表達水平。檢測可以自動化，因此增加了本發(fā)明用于大規(guī)模篩選測試化合物的用途。
在另一不同方面，本發(fā)明是檢測實驗樣品改變RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因表達能力的方法，該方法包括(a)提供至少兩等量份對信息素應答的細胞，其中該細胞包含編碼報道分子的異源核酸和編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸，所述編碼報道分子的異源核酸可操作地與信息素應答啟動子連接，并且該異源核酸的表達產(chǎn)生可檢測的信號；(b)在信息素存在情況下和適合檢測可檢測信號的條件下，溫育所述等量份細胞，其中一份等量份含有實驗樣品；(c)檢測等量份中編碼報道分子的異源核酸的表達水平；和(d)比較兩等量份中報道分子的表達水平，其中兩等量份間表達水平的差異表明實驗樣品改變了RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因的表達。
為了實施本發(fā)明的方法，可以利用本發(fā)明的任何適合的細胞，如上述的細胞。
在一個實施方式中，可以用單一濃度的實驗樣品實施本方法，或可選地，可以在一個濃度范圍內(nèi)使用實驗樣品。
在實施本發(fā)明方法中，可以用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法完成報道基因表達水平的檢測。在一些實施方式中，用暈圈測定法完成報道基因的檢測。在可選的實施方式中，用分光光度計測量檢測報道基因的表達水平。檢測可以自動化，因此增加了本發(fā)明用于大規(guī)模篩選試驗化合物的用途。
附圖的簡要說明

圖1描述了用于具有包含RGS4構(gòu)建體質(zhì)粒的酵母的暈圈測定法。顯示了來源于KY103和KY113的株系的酵母。
圖2A表示具有RGS4和FUS1-lacZ構(gòu)建體的酵母與來源于KY103的株系中缺少RGS構(gòu)建體的對照株系相比，顯示了顯著的信息素誘導生長的弱化作用。
圖2B表示具有RGS4和FUS1-lacZ構(gòu)建體的酵母與來源于KY113的株系中缺少RGS構(gòu)建體的對照株系相比，顯示了顯著的信息素誘導生長的弱化作用。
圖3表示在α因子存在的情況下，具有RGS4和FUS1-熒光素酶構(gòu)建體的酵母株系(KY117)與缺少RGS4構(gòu)建體的對照株系相比，顯示了減弱的發(fā)光水平。
圖4A描述了在含有RGS4和FUS1-熒光素酶構(gòu)建體的細胞中和缺少RGS4構(gòu)建體的對照株系中，對α因子應答的發(fā)光劑量應答曲線。兩個株系都來源于KY103。
圖4B描述了在含有RGS4和FUS1-熒光素酶構(gòu)建體的細胞中和缺少RGS4構(gòu)建體的對照株系中，對α因子應答的發(fā)光劑量應答曲線。兩個株系都來源于KY113。
圖5描述了酵母基于信息素測定法的示意圖，該測定法用于篩選作為RGS阻斷劑的化合物。
圖6A-C表示用于96種化合物的單劑量測定法，用于干擾RGS4介導的發(fā)光減弱的化合物的篩選。圖6A表示在表達RGS4的酵母株系中化合物的作用。圖6B表示在具有缺少RGS4序列對照載體的酵母株系中化合物的作用。圖6C表示在表達RGS4和對照酵母株系間的倍數(shù)的差異。
圖7A-D分別表示檢測化合物SBQ7/D1、SBQ8/B1、CL485和CL744的劑量應答曲線。對于每個化合物，提供了顯示每秒的原始的計數(shù)，株系間倍數(shù)的差異，和株系內(nèi)倍數(shù)的差異圖。
圖8表示表達RGSZ1的酵母株系比表達空載體的對照酵母株系顯示了較小的暈圈和降低的發(fā)光，表明在酵母中sst2的互補。也示出了表達RGS2、RGS7和RGS9的酵母株系的暈圈測定法結(jié)果。
圖9A-D表示表達RGSZ1、RGS2、RGS7和RGS9的試驗酵母株系與表達空載體的對照酵母株系相比，對α因子變化濃度應答的劑量應答曲線。
圖10表示共表達RGS9和hGβ5的酵母株系的暈圈測定結(jié)果。
圖11表示共表達RGS7和hGβ5的酵母株系的暈圈測定結(jié)果。
圖12表示嵌合RGS4/RGS10、RGS4、RGS10、RGS7、RGS9、RGS6和RGS11的熒光素酶測定結(jié)果。
圖13表示RGS7、嵌合RGS7(ggl)/RGS4、嵌合RGS4/RGS7(ggl)4/RGS10、RGS4、RGS10、RGS7、RGS9、RGS6和RGS11的熒光素酶測定結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明修飾的細胞應用宿主細胞。用于本發(fā)明中有效的宿主細胞僅要求其被基因限定以基因工程改造與報道基因，可選地，與外源RGS蛋白質(zhì)連接的信息素應答啟動子的適合表達和任何其它期望基因操作。宿主細胞可以是任何細胞，如真核細胞或原核細胞，例如哺乳動物細胞，該細胞能夠?qū)π畔⑺鼗蚱渌餑PCR配體作用的化合物應答。細胞可以天然地對信息素或其它化合物應答，或基因工程改造以對它們應答。優(yōu)選地，宿主細胞是真菌細胞，例如曲霉屬(Aspergillus)或鏈孢霉屬(Neuropora)的成員。在更有效實施方式中，宿主細胞是酵母細胞。在可選的優(yōu)選實施方式中，酵母細胞是啤酒酵母，裂殖酵母，或巴斯德畢赤酵母。
本發(fā)明細胞利用至少一個含有編碼報道分子的異源核酸的構(gòu)建體，該異源核酸可操作地與信息素應答啟動子連接，其中異源核酸的表達產(chǎn)生可檢測的信號。優(yōu)選地，異源核酸包含在載體，如質(zhì)粒中。盡管，可選地，核酸可以整合進入細胞的染色體。
在一些實施方式中，宿主細胞進一步包含異源RGS蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實施方式中，突變宿主細胞中的內(nèi)源RGS蛋白質(zhì)。一旦用信息素處理，如α因子，就激活信息素敏感啟動子，引起報道基因的表達。功能RGS蛋白質(zhì)的表達抑制信息素敏感啟動子的激活，引起了報道基因表達的降低。抑制RGS蛋白質(zhì)活性化合物的存在引起了報道基因表達的增加。
在細胞中，異源核酸序列通過，例如表達載體或質(zhì)粒表達。表達載體或質(zhì)粒是能復制的DNA構(gòu)建體，其中異源核酸可操作地與一個或多個適合的控制序列連接，該控制序列能影響預定宿主細胞中異源核酸序列編碼的報道基因蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的表達。通常，控制序列包含轉(zhuǎn)錄啟動子，控制轉(zhuǎn)錄的可選的操縱基因序列，編碼適合mRNA核糖體結(jié)合位點的序列，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。
除了質(zhì)粒外，用于實施本發(fā)明的載體包括病毒，和能整合的DNA片段，如通過遺傳重組整合進入宿主基因組的插入片段和轉(zhuǎn)座子。適于用在本發(fā)明中的病毒載體包括腺病毒，腺相關(guān)病毒，皰疹單純病毒，羅斯(Rous)肉瘤病毒，慢病毒和辛德比斯(Sandbis)病毒。載體可以復制，獨立于宿主基因組起作用，如質(zhì)粒的情況下，或可以整合其自身進入基因組，如能整合的DNA片段情況下，例如插入序列或轉(zhuǎn)座子。適合的載體將含有來自與預定宿主細胞共存物種的復制和控制序列。例如，在宿主細胞中可操作啟動子是結(jié)合于那個細胞RNA聚合酶的啟動子。適合的復制和控制序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
當核酸與控制序列功能性相關(guān)時，核酸可操作地與控制序列連接。例如，如果啟動子控制核酸的轉(zhuǎn)錄，那么其可操作地與核酸連接。如果定位核糖體結(jié)合位點以允許翻譯，那么其可操作地與核酸連接。
只要信息素應答啟動子和所用配體的特異性相互作用是已知的，或能通過可用的科學方法推導出，那么信息素應答啟動子和所用配體就可以廣泛變化。可以使用各種天然存在的信息素應答啟動子，或合成的信息素應答元件，或其它含有信息素應答元件的基因中任何一種。優(yōu)選地，信息素應答啟動子來自于FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1、LUC1、BAR1或Ω元件。
盡管與交配過程相關(guān)的(如形態(tài)學上的變化，凝集作用(agglutiniation)，形態(tài)形成，細胞融合，核融合等)任何引發(fā)酵母細胞中變化的信息素或功能成分都適合用于本發(fā)明，但是優(yōu)選地，用在本發(fā)明的信息素是α因子，因子，或M信息素。
這里所用“異源”指來源于除了本發(fā)明細胞以外生物體的核酸，蛋白質(zhì)和其它物質(zhì)，或在本發(fā)明細胞中沒有天然發(fā)現(xiàn)的其聯(lián)合。這個術(shù)語也指與本發(fā)明細胞來源于相同生物體的核酸，但是與對應的內(nèi)源序列相比，已經(jīng)以任何方式修飾了該核酸。
任何G蛋白質(zhì)偶聯(lián)的受體系統(tǒng)都可以用于實施本發(fā)明。這種受體系統(tǒng)的例子包括但不限于與腺苷受體，促生長素抑制素受體，多巴胺受體，縮膽囊肽受體，毒蕈堿性膽堿能受體，α-腎上腺素能受體，β-腎上腺素能受體，鴉片受體，大麻素受體，組胺受體，生長激素釋放因子受體，胰高血糖素受體，血清素受體，加壓素受體，melanocortin受體和神經(jīng)降壓素受體相關(guān)的受體系統(tǒng)。
通常選擇報道基因以便于可以通過熟知和簡單的技術(shù)監(jiān)測配體與其GPCR的結(jié)合和信息素應答啟動子間的相互作用。優(yōu)選地，基于費用，檢測報道基因活性的容易性和低背景選擇報道基因。即，因為高信號對背景的比率和/或相對低或沒有無誘導的活性，所以在報道基因相對低水平的表達時可以檢測活性。報道分子可以是可以通過任何可用方法檢測其活性的任何報道分子?？梢杂迷诒景l(fā)明中的示例性報告基因是熒光素酶基因，綠色熒光蛋白質(zhì)基因，綠色熒光蛋白質(zhì)基因的衍生物，或CAT。優(yōu)選地，通過比色或熒光方法指示報道分子的活性。
在優(yōu)選實施方式中，報道基因是熒光素酶基因，例如來源于海洋海腎和北美螢火蟲的熒光素酶基因。來源于其它生物體的熒光素酶基因也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。應用熒光素酶報道基因的顯著優(yōu)點是它使快速液體測定法成為可能，因此允許實驗樣品高通過量的篩選。此外，熒光素酶報道基因在酵母中的應用提供了增加的測定敏感性，能實現(xiàn)定量數(shù)據(jù)的收集，允許測定自動化，特別是對于高通過量(384孔)的測定形式。短的測定時間避免了由于長溫育時間(48+小時)的化合物毒性作用，增加了在藥物篩選中應用的用途，而對于需要細胞生長以終點測定的標準營養(yǎng)缺陷型(HIS3，LYS2，URA3)報道分子或反選擇(CAN1，URA3，CNH2)報道分子，目前需要長溫育時間。
用在本發(fā)明的示例性RGS蛋白質(zhì)是包含RGS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，如RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同種型，或含有RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，例如PLCB，cGMP PDE的γ亞基。
可以構(gòu)建2微米(2micron)和低拷貝數(shù)(CEN)形式的信息素應答—啟動子—報道基因構(gòu)建體，以通過細胞內(nèi)報道基因拷貝數(shù)的控制能夠進一步控制報道基因功能或測定敏感性。
用標準方法，例如Ausubel等，1998所述的方法進行分子克隆技術(shù)。根據(jù)制造商的說明進行限制性消化。其中為了適合的克隆策略，根據(jù)標準技術(shù)用Klenow末端補平cDNA片段以產(chǎn)生平末端。根據(jù)制造商的說明(Boehringer Manheim or Amersham Life Science)，用蝦堿性磷酸酶(SAP)進行cDNA片段和/或載體的去磷酸化。用標準技術(shù)進行連接反應，轉(zhuǎn)化重組載體進入大腸桿菌(Echerichia coli)DH5α細胞，在含有適合抗生素的LB瓊脂平板上鋪板?；厥站洌肈NA midi prep試劑盒或自動DNA制劑(Qiagen)制備質(zhì)粒DNA。用Perkin Elmer的試劑和ABI的自動測序裝置證實質(zhì)粒的完整性和克隆策略。用乙酸鋰方法轉(zhuǎn)化酵母株系，在適合培養(yǎng)基上鋪板(Rose等，1990)。用標準方法制備所有酵母培養(yǎng)基和試劑。
在檢測化合物存在的情況下，本發(fā)明新的修飾細胞容易應用在各種用于檢測報道基因表達的篩選方法中。設計本發(fā)明的篩選方法以檢測與RGS蛋白質(zhì)修飾G蛋白質(zhì)應答途徑的能力相互作用的化合物，如同通過報道基因活性的改變所測定。檢測化合物可以是肽，優(yōu)選約2個氨基酸長度，或非肽的化合物。非肽檢測化合物包括化合物，復合物和鹽及天然產(chǎn)品樣品，如植物提取物，組織提取物和從發(fā)酵肉湯得到的物質(zhì)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，培育細胞，其中可以監(jiān)測RGS活性。在一個例子中，熒光素酶基因與信息素應答啟動子，F(xiàn)US1連接。在缺失內(nèi)源性RGS蛋白質(zhì)，Sst2的酵母細胞中表達該FUS1-熒光素酶報道基因，或在其中內(nèi)源性sst2基因含有突變的酵母株系中表達，所述突變使得它與sst2缺失的株系功能等同。在“實驗”細胞中，加入表達哺乳動物RGS4蛋白質(zhì)的質(zhì)粒，而用缺失RGS4基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染“對照”細胞。用α因子配體處理實驗和對照細胞，α因子配體與受體結(jié)合，刺激細胞級聯(lián)放大以驅(qū)動FUS1啟動子和熒光素酶報道基因的表達。在對照株系中，表達高水平的熒光素酶，在底物存在的情況下，引起強發(fā)光。相反地，含有RGS4的酵母株系，證實RGS4負調(diào)節(jié)信號級聯(lián)放大顯示大幅度降低的FUS1熒光素酶報道基因活性。這些發(fā)現(xiàn)與以前利用其它報道基因，如β-gal活性或營養(yǎng)缺陷型的標記的發(fā)現(xiàn)相互關(guān)聯(lián)。
可以通過許多方法利用這些酵母細胞以研究或發(fā)現(xiàn)與RGS蛋白質(zhì)相互作用的因子。例如，可以向表達RGS4蛋白質(zhì)載體的實驗株系中加入一個實驗化合物。如果因子與RGS蛋白質(zhì)相互作用，它將阻斷或增強RGS4蛋白質(zhì)功能，因此影響RGS蛋白質(zhì)負調(diào)節(jié)由α因子/受體相互作用誘導的信號的能力。然后α因子信號刺激(延長其能力)可以用來降低報道基因的表達，引起高水平的發(fā)光?？蛇x地，增強RGS功能的化合物將降低報道基因的表達。與對照株系相比，認為在實驗(表達RGS4)株系中顯示了增加的熒光素酶活性的化合物將是潛在的候選藥物?？梢栽趧┝繎饻y定中檢測與作為載體對照細胞相比，引起實驗株系中熒光素酶活性增加約50％(或一些其它適合測定的百分數(shù))的化合物。
這些類型的RGS測定法顯示了在藥物發(fā)現(xiàn)方面的巨大潛力。它們是非常靈敏的，有短的檢測時間，而且對用于大規(guī)模藥物發(fā)現(xiàn)的高通過量系統(tǒng)是理想的。此外，可以用熒光素酶RGS測定法鑒定孤獨G蛋白質(zhì)受體的配體，而且可以用于研究或篩選G蛋白質(zhì)途徑的其它成員，如激酶。
提供了下面的實施例以進一步示例本發(fā)明的各個方面。它們不應該解釋為限定本發(fā)明。
實施例1 FUS1-LacZ報道基因的RGS測定已充分表征和描繪了酵母中α因子的GPCR受體刺激(參見，Dohlman等，1996)。這個途徑的刺激通常引起酵母細胞周期停滯。該信號途徑受作為GPCR信號負調(diào)節(jié)物起作用的內(nèi)源RGS蛋白質(zhì)，Sst2控制。RGS蛋白質(zhì)起到加速Gα亞基內(nèi)源GTPVase活性的作用。因為在酵母中編碼Sst2基因的缺失損害了其關(guān)閉GPCR信號的能力，所以引起了酵母細胞對配體超敏感。哺乳動物的RGS蛋白質(zhì)，RGS4能功能互補酵母的Sst2。
在本實驗中，在存在或缺少哺乳動物RGS4蛋白質(zhì)的情況下，在缺失sst2的酵母株系中測定報道基因的活性。在這個測定中，我們實驗了是否RGS4蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)引起信息素應答基因活化的α因子誘導的信息素應答途徑。在信息素應答啟動子下游可操作地連接lacZ基因(FUS1-lacZ報道基因)，并且在能對信息素α因子應答的細胞，如MATa細胞中表達。
制備含有FUS-1啟動子和LacZ報道基因的質(zhì)粒(Kp27)。通過用xhoI和EagI消化質(zhì)粒pRS424(Stragagene)產(chǎn)生該質(zhì)粒。產(chǎn)生1.095kbEcoRI-SalI片段的FUS1啟動子區(qū)域(GenBank M16717)，并且產(chǎn)生3.0kbSalI-EagI片段的β-半乳糖苷酶基因(GenBank，CVU89671)。用標準方法，在制備的pRS424載體，F(xiàn)US1片段和β-半乳糖苷酶片段間進行三路直接連接以產(chǎn)生質(zhì)粒Kp27。轉(zhuǎn)化重組DNA進入大腸桿菌，通過標準方法制備選定轉(zhuǎn)化體的DNA。通過限制性消化和序列分析證實Kp27構(gòu)建體。
我們制備了編碼RGS4蛋白質(zhì)的質(zhì)粒構(gòu)建體。通過PCR，用質(zhì)粒pWE2RGS4作模板(Shuey等，1997)，應用下面的引物獲得編碼全長大鼠RGS4的cDNAKx13(正向)5’-GACGTCTCCCATGTGCAAAGGACTCG(SEQ ID NO1)，其含有內(nèi)含BsmBI位點和部分NcoI序列；及Kx41(反向)5’-CGGGATCCTTATTAGGCACACTGAGGGACTAGGGAAG(SEQ IDNO2)，其含有外部終止密碼子和內(nèi)含的BamHI位點。
為了構(gòu)建血凝素標記的(“HA”)RGS4，利用缺少終止密碼子，但含有內(nèi)含BamHI位點的不同的3’-引物Kx42(反向)5’-GAGGATCCGGCACACTGAGGGACTAGGGAAG(SEQ ID NO3)。
用BsmBI和BamHI消化PCR產(chǎn)物(約650bp)，分別連接到載體Kp46或Kp57用于無標記和HA標記的RGS4蛋白質(zhì)表達。轉(zhuǎn)化由此產(chǎn)生的質(zhì)粒Kpl18(RGS4-Kp46)和Kpl19(RGS4-Kp57)進入細菌細胞。制備重組DNA，用下面的引物通過序列分析證實重組DNA
KX435’-TTTTTACAGATCATCAAGGA(SEQ ID NO4)KX445’-TGCGTCTTCAGAGCGCTTTT(SEQ ID NO5)Kx395’-GAGCCAAGAAGAAGTCAAGAAAT(SEQ ID NO6)Kx405’-TGGGCTTCATCAAAACAGG(SEQ ID NO7)。
為了產(chǎn)生缺失內(nèi)源RGS蛋白質(zhì)，SST2的酵母株系，通過用XhoI和SacI消化，從LEU標記的質(zhì)粒pEK139/138獲得SST2::NEO構(gòu)建體。凝膠分離和純化由此產(chǎn)生的含有sst2-NEO-sst2盒子的4.0kb片段。共轉(zhuǎn)化該cDNA片段和URA標記的pRS416(stratagene)進入酵母株系CY770(MATaleu2-3，112 ura3-52 trpl-901 his-200 ade2-101 gal4 gal80 lys2::GALuas-HIS3 cyhR；Young，等，1995)以提高整合。轉(zhuǎn)化后，在YPD培養(yǎng)基上生長酵母細胞，在SC-ura培養(yǎng)基上鋪板。在YPD培養(yǎng)基上順序影印鋪板由此產(chǎn)生的URA+酵母菌落，該YPD培養(yǎng)基含有50ug/ml，隨后是100ug/ml的G418(遺傳霉素，來自BRL)。通過PCR分析檢驗sst2-NEO-sst2構(gòu)建體整合證實G418抗性CY770酵母菌落。用于PCR檢驗的引物如下Kx245’-TATCGAGTCAATGGGGCAGGC(SEQ ID NO8)Kx255’-CGAAACGTGGATTGGTGAAAG](SEQ ID NO9)Kx265’-ATTCGGCTATGACTGGGCACAAC(SEQ ID NO10)Kx275’-GTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAG(SEQ ID NO11)。
對于證實的敲除株系，期望是來源于Kx24和Kx25引物的4.2kb的PCR片段，而對于野生型(沒有敲除)的酵母株系，期望是4.9kb的PCR產(chǎn)物。對于證實的敲除株系，期望是來源于Kx24和Kx27引物的2.6kb的PCR產(chǎn)物，而期望來源于野生型(沒有敲除)株系無PCR產(chǎn)物。對于證實的敲除株系，期望是來源于Kx25和Kx26引物的2.4kb的PCR產(chǎn)物，而期望來源于野生型(沒有敲除)株系無PCR產(chǎn)物。
PCR檢驗后，在SC-ura平板上鋪板候選酵母菌落以證實所用有助于整合的pPS416質(zhì)粒的丟失。為了檢測與Sst2蛋白質(zhì)丟失互補的RGS4蛋白質(zhì)的能力，用信息素應答暈圈測定法檢測G418抗性的缺少ura(ura-minus)菌落對α因子刺激的應答(Dohlman等，1996)。在圖1，2A和2B中描述了結(jié)果，該結(jié)果分別表示在兩個酵母背景中的暈圈測定和劑量曲線。測試和證實的CY770Δsst(敲除的)酵母菌落之一命名為KY103(MATaleu2-3.112 ura3-52 trpl-901 his-200 ade2-101 gal4 gal80Lys2::GALuas-HIS3 cyhR，sst2，G418R)。類似地，酵母株系YPH499(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，Manassas，VA)缺失sst2基因，命名為KY113(MATa ura3-52 lys2-801a ade2-101o trpl-D63 his3-D200 leu2-Dl，sst2)。
用乙酸鋰方法產(chǎn)生信息素應答酵母實驗株系(Rose，等，1990)，并在質(zhì)粒保留培養(yǎng)基上鋪板。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒Kp118(RGS表達質(zhì)粒)和Kp27(FUS1-lacZ報道基因質(zhì)粒)進入KY103中。
通過共轉(zhuǎn)化缺少RGS編碼序列的空表達質(zhì)粒Kp46和報道基因質(zhì)粒Kp131進入株系KY103中以產(chǎn)生酵母株系Ky116，和進入株系KY113中以產(chǎn)生株系KY118來制備對照酵母株系。
為了觀察是否RGS4蛋白質(zhì)干擾信息素誘導的β-半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄，用α因子(25nM)處理具有RGS4構(gòu)建體的酵母和具有空載體的對照酵母。RGS4在株系KY117中的表達脫敏信息素誘導的LacZ信號(未示出數(shù)據(jù))。RGS4的表達也拯救了信息素誘導的生長停滯。
實施例2 FUS1-熒光素酶報道基因的RGS測定實施例1證實用期望骨架和與LacZ基因上游可操作連接的信息素應答FUS1啟動子產(chǎn)生的質(zhì)粒能用于研究RGS蛋白質(zhì)的活性。在這個實驗中，連接熒光素酶基因到FUS1啟動子，而不是LacZ基因的下游。該熒光素酶系統(tǒng)比用LacZ報道基因的系統(tǒng)有一些優(yōu)點，最明顯的是增加的速度和監(jiān)測基因表達的簡易。
構(gòu)建含有熒光素酶基因的FUS-1報道基因質(zhì)粒(Kp120)。通過質(zhì)粒pGL(Promega)的NcoI-XbaI消化以分離含有螢火蟲熒光素酶基因的1.7kb片段，來構(gòu)建FUS1-熒光素酶報道基因盒子。平末端化和純化該片段。Kp27載體作為基礎載體，其通過用BamHI-NotI消化(以除去LacZ基因)，去磷酸化，平末端處理和純化該載體制備。連接制備的載體和熒光素酶片段以產(chǎn)生質(zhì)粒Kp120。該克隆方案產(chǎn)生了來源于原始Kp27載體的預期的4個額外氨基酸殘基(甲硫氨酸，丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸)，這些氨基酸融合在框架中熒光素酶ORF的N末端。保留BamHI和NotI限制位點。用下面的引物，通過DNA測序證實質(zhì)粒Kp120構(gòu)建體Kx455’-ATATAAGCCATCAAGTTTCTG(SEQ ID NO12)；和Kx465’-CTCACTAAAGGGAACAAAAG(SEQ ID NO13)如實施例1所述制備編碼RGS4蛋白質(zhì)的質(zhì)粒構(gòu)建體和缺失內(nèi)源RGS蛋白質(zhì)(SST2)的酵母株系。
用乙酸鋰方法產(chǎn)生信息素應答酵母實驗株系(Rose，等，1990)，并在質(zhì)粒保留培養(yǎng)基上鋪板。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒Kp118(RGS表達質(zhì)粒)和Kp131(FUS1-luc報道基因質(zhì)粒)進入酵母株系KY103中產(chǎn)生酵母株系KY115。Kp131來源于Kp120。簡而言之，用KpnI和SacI限制酶從Kp120切割下FUS1熒光素酶報道基因盒子。凝膠純化2.8kb片段，平末端處理并連接進入pRS416以產(chǎn)生Kp131。共轉(zhuǎn)化Kp118和Kp131進入KY113以產(chǎn)生酵母株系KY117。
通過共轉(zhuǎn)化空表達質(zhì)粒Kp46和報道分子質(zhì)粒Kp131進入KY103以產(chǎn)生酵母株系Ky116，和進入株系KY113以產(chǎn)生株系KY118，來制備對照酵母株系。
為了檢測是否RGS4蛋白質(zhì)干擾了信息素誘導的熒光素酶蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，用α因子(25nM)處理具有RGS4構(gòu)建體的酵母和具有空載體的對照酵母。圖3表示用基于KY113株系的KY117(RGS4)和KY118(對照)的結(jié)果。該圖表示RGS4蛋白質(zhì)可能與酵母Gα亞基(Gpalp)相互作用，引起了α因子誘導的熒光素酶信號降低。在缺少RGS4蛋白質(zhì)的對照株系中觀察到了強發(fā)光。相反，在表達RGS4蛋白質(zhì)的酵母株系中觀察到了弱發(fā)光。在從基礎酵母株系KY103和KY113產(chǎn)生的酵母株系中觀察到了信息素應答熒光素酶的活性。然而，基于KY113的酵母株系的應答稍微強一些(未示出數(shù)據(jù))，因此這些株系更敏感。
這些發(fā)現(xiàn)與實施例1所闡述的發(fā)現(xiàn)相關(guān)聯(lián)，其中在實施例1中我們監(jiān)測了β-gal活性。在圖4A和4B中示出了熒光素酶系統(tǒng)的劑量應答曲線，表明熒光素酶作為報道基因象lacZ一樣起作用。此外，因為倍數(shù)的增加更高(未示出數(shù)據(jù))，所以熒光素酶報道基因比β-半乳糖苷酶更敏感。
實施例3 FUS1熒光素酶報道分子的低拷貝形式作為前述FUS1熒光素酶報道基因構(gòu)建體的2μm可選擇形式，制備實施例2的低拷貝數(shù)(CEN)形式的熒光素酶構(gòu)建體。通過用KpnI和SacIEN消化質(zhì)粒Kp120以分離2.8kb含有FUS1啟動子和熒光素酶基因報道分子盒子的片段，來產(chǎn)生信息素途徑應答FUS1熒光素酶報道基因的CEN形式。分別用KpnI和SacI消化質(zhì)粒pRS414和pRS416(Stragagene)，凝膠純化。進行標準連接以產(chǎn)生兩個另外的FUS1熒光素酶重組質(zhì)粒；Kp133(TRP1標記的)和Kp135/Kp131*(URA3標記的)。通過標準方法進行細菌轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生質(zhì)粒DNAs。通過DNA測序證實質(zhì)粒。質(zhì)粒Kp131*代表Kp135的類似構(gòu)建體，但是其是用不同的克隆策略獨立產(chǎn)生的。
在信息素應答測定中檢測報道基因的CEN形式。發(fā)現(xiàn)這些形式在信息素應答測定中起作用，而且提供了適合的信噪比(未示出數(shù)據(jù))。
實施例4引入可選的報道基因可以在該系統(tǒng)應用各種報道基因?？梢杂迷诒景l(fā)明中的示例性報道基因是報道基因，如來源于除了螢火蟲以外物種的熒光素酶基因，綠色熒光蛋白質(zhì)基因，或CAT。例如海腎熒光素酶基因的報道分子可以用做螢火蟲熒光素酶報道分子的替代。為了構(gòu)建它們，克隆編碼海腎熒光素酶的開放可讀框架進入實施例1或2所述的信息素應答報道分子質(zhì)粒以產(chǎn)生FUS1-RenLuc。通過與所述螢火蟲報道基因類似的方法產(chǎn)生高(2微米)和低(CEN)拷貝數(shù)質(zhì)粒。
實施例5 RGS測定單點藥物篩選上述證實的株系用于小分子的鑒定，所述小分子調(diào)節(jié)共表達的哺乳動物RGS蛋白質(zhì)的活性。圖5表示篩選示意圖。用具有RGS表達質(zhì)粒的酵母株系和對照株系檢測調(diào)節(jié)RGS4功能的小分子，引起了熒光素酶活性的增加。以分子模型化為基礎，在單點測定中檢測實驗化學試劑庫中子集分子。在實驗(RGS4)株系中顯示了比在對照株系中增加的熒光素酶活性的化合物是“陽性”，而且認為是用于進一步研究的感興趣的候選物。
具體地，接種含有RGS表達質(zhì)粒(KY117)或?qū)φ展羌茌d體(株系KY118)的酵母株系到適合培養(yǎng)基中(SC-leu-trp)，在30℃，溫育過夜。通過OD600測定這些新鮮酵母培養(yǎng)物的細胞密度，在適合的生長培養(yǎng)基(SC-leu-trp)中稀釋細胞到OD600為0.05。接種150μl細胞懸浮液到96孔微滴定板的孔中，利用復制器轉(zhuǎn)移約1μl貯存實驗化合物(10mg/ml)到每個孔中。
在30℃，溫育實驗化合物與細胞3小時。然后用配體刺激細胞(10μl終濃度20nM的α因子(200nM的10X母液))刺激細胞。短暫地振蕩平板，在30℃溫育2小時。向每個孔加入100μl LucLite底物(Packard)，密封板，室溫，黑暗中振蕩1小時。用Top Count(Packard)測定發(fā)光2秒。
圖6表示的是96種化合物的單劑量測定結(jié)果。向兩個酵母株系RGS4株系(圖6A)和對照載體株系(圖6B)加入每種化合物。計算發(fā)光差異(倍數(shù))為每秒計數(shù)(RGS)/每秒計數(shù)(載體)(圖6C)。認為發(fā)光比平均值倍增的化合物是作為RGS阻斷劑的候選物。
實施例6潛在藥物的RGS測定劑量的應答測定然后在劑量應答測定中，檢測引起實驗株系中熒光素酶活性比單點測定法中對照株系所觀察的熒光素酶活性增加約50％的化合物。
在適合培養(yǎng)基(SC-leu-trp)中接種含有RGS表達質(zhì)粒(KY117)的酵母株系和含有骨架載體(KY118)的對照酵母株系，在30℃溫育過夜。通過OD600測定新鮮酵母培養(yǎng)物的細胞密度，在適合的生長培養(yǎng)基(SC-LT)中稀釋細胞到OD600為0.05。分配等量份的150μl懸浮細胞到96孔微滴定板的A排。加DMSO到剩余酵母細胞至終濃度為3％，接種100μl細胞到96孔板的剩余孔中。向A排中細胞加實驗化合物(4.5μl)，產(chǎn)生900μM的終濃度，混合，從A排移出50μl到B排中，混合孔。隨后從B排移出50μl到C排中等等直到G排，以在96孔板一列內(nèi)產(chǎn)生系列稀釋。這樣，用含有3％DMSO的所有孔設置了8點劑量應答曲線。
在30℃，溫育細胞和實驗化合物4小時，然后加10μl配體(α因子，200nM的10X母液)到20nM的終濃度。短暫地振蕩平板，在30℃溫育2小時。向每個孔加入100μl LucLite底物，密封板，室溫，黑暗中振蕩1小時。用Top Count(Packard)測定發(fā)光2秒。圖7A-D表示4種實驗化合物的結(jié)果。證明了化合物SBQ8/B1具有很大地影響RGS4功能的能力。
實施例7通過添加哺乳動物RGS蛋白質(zhì)的功能互補以前，證實哺乳動物RGS4能互補SST2p，以使釀酒酵母從不引起生產(chǎn)性交配的α因子刺激恢復。RGS蛋白質(zhì)加速了酵母Gα蛋白質(zhì)，Gpal的內(nèi)源GTPase活性。以前的數(shù)據(jù)僅僅支持RGS4具有功能上置換SST2的能力。為了研究利用信息素應答途徑檢測哺乳動物RGS蛋白質(zhì)功能的全面用途，在含有前述信息素應答熒光素酶報道基因(FUS1-luc)的sst2敲出株系中也表達RGSZ1和RGSZ2。
總的克隆亞克隆編碼各種哺乳動物RGSZ1和RGSZ2蛋白質(zhì)的cDNA到載體p426-TEF(ATCC#87669)中。該載體[6359 bp，URA3，2mu-ori，TEFp-CYC1t，REP3，AmpR]含有釀酒酵母延伸因子1-α啟動子(該序列參見Genbank的YSCEF1AB)，表明該啟動子比ADH啟動子強5倍(Mumberg等，Gene，156119)。用聚合酶鏈式反應，限制性消化，連接和轉(zhuǎn)化進入DH5α大腸桿菌細胞的標準方法產(chǎn)生指定cDNA插入物。用Qiagen制劑制備DNA，通過限制消化和DNA測序證實DNA。由此產(chǎn)生的構(gòu)建體在5’-末端接頭位點測序。測序引物是Kx655’-TCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTAT(SEQ.ID.NO14)該引物與TEF啟動子區(qū)域雜交。
人RGSZ1用26bp含有內(nèi)含BAM HI限制位點的5’正向寡核苷酸引物5’-GCggatccATGGGATCAGAGCGGATG(SEQ.ID.NO15)和27bp含有內(nèi)含ClaI限制位點和終止密碼子的3’反向寡核苷酸引物
5’-CGatcgattaCTATGCTTCAATAGATT(SEQ.ID.NO16)制備RGSZ1的cDNA。
用前述RGSZ1-pACT重組載體作為模板，在標準PCR反應中利用這些引物。獲得編碼全長RGSZ1(Genbank AF079479)的650bp片段，其含有內(nèi)源起始和終止密碼子。凝膠純化PCR產(chǎn)物，用BamHI和ClaI限制酶消化，連接到制備的p426TEF的BamHI和ClaI位點。用單獨HincII，單獨SphI，或SalI+SphI限制消化分析，證實cDNA插入的方向。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒，pTEF426-RGSZ1命名為Kp140(作為pKHY55也是已知的)和Kp141(作為pKHY56也是已知的)。
人RGS2用21bp具有內(nèi)含NotI位點的正向5’寡核苷酸引物5’-CCAGCGGGAGAACGATAATGC(SEQ.ID.NO17)和19bp具有內(nèi)含BamHI位點的3’反向寡核苷酸引物5’-CCCCTCAGGAAAAGAATG(SEQ.ID.NO18)通過從人整個大腦文庫中PCR擴增獲得人RGS2 cDNA(Genbank NM002923)。
在pCRII載體(Invitrogen)中連接705bp的PCR產(chǎn)物，以產(chǎn)生pKHY146(hRGS2-pCRII)。根據(jù)銷售商說明，轉(zhuǎn)化pKHY146進入細菌細胞，制備質(zhì)粒DNA和證實序列。用NotI和BamHI從pKHY146切割hRGS2 cDNA，亞克隆到制備的pcDNA3.1(Invitrogen)的NotI和BamHI位點。由此得到的重組質(zhì)粒(hRGS2-pcDNA3.1)命名為pKHY150。用PmeI消化pKHY150，并且分離650bp的片段，凝膠純化，用平末端連接到制備的p426TEF的SamI位點，以產(chǎn)生重組質(zhì)粒hRGS2-pTEF426和兩個由此產(chǎn)生的(同胞)重組質(zhì)粒，命名為Kp138(作為pKHY53也是已知的)和Kp139(作為pKHY54也是已知的)。用PstI或HindIII，通過限制消化分析檢測hRGS2 cDNA插入的方向。
株系的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化這些RGS構(gòu)建體到酵母KY113中；也共轉(zhuǎn)化FUS1-熒光素酶報道分子(Kp120)到KY113中。由此產(chǎn)生的酵母株系命名如下
表1

從每個酵母轉(zhuǎn)化中挑選3個菌落，并在SC-Ura-Trp平板上劃線。在信息素應答測定中檢測3個菌落中的2個(如前述)以測定熒光素酶報道基因的活性。簡而言之，在30℃，用濃度為25或225ng的α因子刺激100μl 0.1 OD600的過夜培養(yǎng)物2小時。也對相同的培養(yǎng)物進行信息素應答的暈圈測定(如前述)。用每個斑點25或250ng濃度的α因子刺激SC-Ura-Trp瓊脂平板上的細胞坪苔(cell lawn，制備于0.3 OD600培養(yǎng)物)。在30℃，溫育平板約40個小時，然后觀察暈圈形成。
結(jié)果圖8描繪了暈圈測定的結(jié)果，圖9A和9B描繪了熒光素酶報道分子測定的結(jié)果。表達RGSZ1的酵母株系比表達空載體的酵母株系證明顯示小的暈圈和降低的發(fā)光，因此表明酵母中sst的互補。對這些株系進行了其它劑量應答曲線和更詳細的暈圈測定(每個斑點α因子濃度為431、48、5.3或0.6ng，或每個斑點α因子濃度為431、144、48或16ng)。RGSZ1表達株系的應答沒有前面觀察到的表達RGS4株系的應答強。這表明RGSZ1顯示了用RGS4觀察到應答的33％(當與其對照載體比較時，1/8對1/27倍)。
表達RGS2的酵母株系顯示了比僅表達載體株系所觀察到暈圈稍微小的暈圈。然而，表達RGS2的株系與對照株系相比，顯示了降低的發(fā)光(尤其在62nM時)，這表明了sst2的功能互補。
人RGS7用20個堿基具有內(nèi)含NotI位點的正向寡核苷酸引物，5’-CTTGGCGGAGGAGGGCACAC(SEQ ID NO19)和具有內(nèi)含BamHI位點的反向22個堿基寡核苷酸引物
5’-TGGAGGCATTGAGACGGAAGA(SEQ ID NO20)從人大腦cDNA文庫(Clontech)，通過PCR擴增獲得全長人RGS7(Genbank AF090116)。
用適合的酶限制消化由此產(chǎn)生的1698bp的PCR產(chǎn)物，并連接到pcDNA3.1的NotI和BamHI位點。由此產(chǎn)生的重組載體(hRGS7-pcDNA3.1)命名為pKHY126，通過限制消化和序列分析證實。用PmeI消化pKHY126，并且分離1.5kb的片段，凝膠純化，用平末端連接到p426TEF的SamI位點。用XbaI，HindIII，或ClaI和SacI，通過限制消化檢測hRGS7 cDNA插入的方向。證實的hRGS7-pTEF426質(zhì)粒的兩個同胞分離物命名為Kp144(作為pKHY59是已知的)和Kp145(作為pKHY60是已知的)。
產(chǎn)生了編碼Gγ樣(“GGL”)結(jié)構(gòu)域到蛋白質(zhì)末端的第二個hRGS7克隆。用含有內(nèi)含BamHI位點和起始密碼子的27個堿基正向寡核苷酸引物5’-GCGGATCCATGAAACCTCCAACAGAAG(SEQ ID NO21)和含有內(nèi)含ClaI位點和外源終止子的26個堿基反向寡核苷酸引物5’-CGATCGATTATTAGTAAGACTGAGCA(SEQ ID NO22)及pKHY126作模板，通過PCR產(chǎn)生該GGL-hRGS7 cDNA。由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物660bp，編碼氨基酸序列KPPT到末端氨基酸。用適合的酶消化650bp的PCR產(chǎn)物，分離，凝膠純化和定向連接到制備的p426TEF載體(ATCC)的BamHI和ClaI位點。通過用NcoI和XhoI，單獨XbaI，或ClaI和NcoI限制消化證實重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒(GGL-hRGS7-p426TEF)的兩個同胞分離物命名為Kp142(作為pKHY57也是已知的)和Kp143(作為pKHY58也是已知的)。
人RGS9用40個堿基具有內(nèi)含HindIII位點的正向寡核苷酸引物，5’-GCAAGCTTCCACCATGACAATCCGACACCAAGGCCAGCAG(SEQ ID NO23)和具有內(nèi)含XbaI位點的39個堿基反向寡核苷酸引物5’-GCTCTAGATTACAGGCTCTCCCAGGGGCAGATGACC(SEQ ID NO24)從人大腦cDNA文庫(Clontech)，通過PCR擴增獲得全長人RGS9(Genbank AF071476)。
用適合的酶限制消化由此產(chǎn)生的2.0kb的PCR產(chǎn)物，連接到pWE3的HindIII和XbaI位點，以產(chǎn)生重組載體hRGS9-pWE3。通過限制消化和序列分析證實構(gòu)建體。用標準PCR方法，用hRGS9-pWE3作模板和含有內(nèi)含BamHI位點的正向寡核苷酸引物5’-CCGGATCCAGATGACAATCCGACACCAAGGCCAGC(SEQ ID NO25)和含有內(nèi)含XhoI位點的反向寡核苷酸引物5’-CGCTCGAGTTACAGGCTCTCCCAGGGGCAGATGACC(SEQ ID NO26)以產(chǎn)生2.0kb的片段。用BamHI和XhoI消化hRGS9 PCR產(chǎn)物，純化和定向連接到制備的pACT2的BamHI和XhoI位點以產(chǎn)生質(zhì)粒pACT-hRGS9，通過序列分析證實。用BamHI和XhoI限制酶，從pACT-hRGS9切割編碼含有內(nèi)源起始和終止密碼子的全長hRGS9的cDNA以獲得2.0kb片段。分離2.0kb的片段，凝膠純化，定向連接到制備的載體p426TEF的BamHI和XhoI位點。通過用BamHI和SphI限制消化證實由此產(chǎn)生的重組質(zhì)粒(hRGS9-TEF426)，命名為Kp148(作為pKHY63也是已知的)和Kp149(作為pKHY62也是已知的)。
產(chǎn)生了編碼Gγ樣(GGL)結(jié)構(gòu)域到蛋白質(zhì)末端的第二個hRGS9克隆。用含有內(nèi)含BamHI位點和起始密碼子的28個堿基正向寡核苷酸引物5’-GCGGATCCATGAAGAAACAAACAGTCGT(SEQ ID NO27)和含有內(nèi)含ClaI位點和外源終止子的26個堿基反向寡核苷酸引物5’-CGATCGAATTATTACAGGCTCTCCCAG(SEQ ID NO28)及Kp148作模板，通過PCR產(chǎn)生該GGL-hRGS9 cDNA。
由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物是1.4kb片段?？寺〔呗酝糜贕GL-RGS7所述的類似，因此用適合的酶消化1400bp的PCR產(chǎn)物，分離，凝膠純化和定向連接到制備的p426TEF載體(ATCC)的BamHI和ClaI位點。通過用單獨SacI，單獨EcoRI，單獨SalI，或BamHI和SphI限制消化證實方向而證實重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒(GGL-hRGS9-p426TEF)的兩個同胞分離物命名為Kp146(作為pKHY61也是已知的)和Kp147(作為pKHY62也是已知的)。
株系的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化上面的RGS構(gòu)建體到酵母KY113中；也共轉(zhuǎn)化FUS1-熒光素酶報道分子(Kp120)到該酵母株系中。由此產(chǎn)生的酵母株系命名如下表2

從每個酵母轉(zhuǎn)化中挑選3個菌落，在SC-Ura-Trp平板上劃線。檢測3個菌落中的2個的信息素應答測定(如前述)以測定熒光素酶報道基因的活性。簡而言之，在30℃，用濃度為25或225ng的α因子刺激100μl 0.1OD600的過夜培養(yǎng)物2小時。也對相同的培養(yǎng)物進行信息素應答的暈圈測定(如前述)。用每個斑點50或250ng濃度的α因子刺激SC-Ura-Trp平板上的細胞坪苔(制備于0.3 OD600培養(yǎng)物)。在30℃，溫育平板約40個小時，然后觀察暈圈形成。
結(jié)果圖9A-D描繪了熒光素酶報道基因測定的結(jié)果。圖8描繪了暈圈測定結(jié)果。表達RGSZ1的酵母株系比表達空載體的酵母株系證明顯示小的暈圈和降低的發(fā)光，表明酵母中sst2的互補。對這些株系進行了其它劑量應答曲線和更詳細的暈圈測定(每個斑點α因子濃度為431，48，5.3或0.6ng，或每個斑點α因子濃度為431，144，48，或16ng)。RGSZ1表達株系的應答沒有前面觀察到的表達RGS4株系的應答強。這表明RGSZ1顯示了用RGS4觀察到應答的33％(當與其對照載體比較時，1/8對1/27倍)。
表達RGS2的酵母株系顯示了比僅表達載體株系所觀察到暈圈稍微小的暈圈。然而，表達RGS2的株系與對照株系相比，顯示了降低的發(fā)光(尤其在62nM時)，這表明了sst的功能互補。表達RGS7全長或GGL+RGS C-末端的酵母株系顯示了與陰性對照株系相似的暈圈和發(fā)光，表明這種形式RGS不容易提供sst2的功能互補。表達RGS9全長或GGL+RGS C-末端的酵母株系顯示了與陰性對照株系相似的暈圈。然而，表達全長RGS9株系與陰性對照株系相比，存在一些降低發(fā)光的跡象。
實施例8人Gβ5的共表達RGS7和RGS9是較長的RGS蛋白質(zhì)，分別是469和673個氨基酸，而且與RGS6和RGS11一起屬于RGS蛋白質(zhì)家族的一個亞類，其包含DEP結(jié)構(gòu)域，和結(jié)合Gβ5的高度保守的GGL結(jié)構(gòu)域(Snow等，1999)。RGS7和RGS9在GGL結(jié)構(gòu)域內(nèi)顯示了高水平的同源性。RGS6和RGS7在DEP結(jié)構(gòu)域中有80％的同源性，而RGS7和RGS9僅有50％同源性。在RGS領(lǐng)域目前的研究表明該含有GGL-結(jié)構(gòu)域的RGS蛋白質(zhì)亞類起功能上類似作用。然而，我們的發(fā)現(xiàn)表明這些和其它亞類RGS蛋白質(zhì)的潛在成員可以不顯示相同的功能性。已證明GGL結(jié)構(gòu)域結(jié)合異源三聚體G蛋白質(zhì)的Gβ5，表明GGL-RGS/Gβ5相互作用可能對于兩種蛋白質(zhì)的正確折疊是重要的，而且是功能相關(guān)的。Gβ5是Gβ蛋白質(zhì)最明顯的同種型，在大腦中高度表達。在Gβ5和酵母Gβ(STE4)間的同源性＜40％。因此，我們在酵母中共表達了人Gβ5和RGS7或RGS9(或RGS4作為對照)，以檢測是否人Gβ5將能實現(xiàn)含有GGL-結(jié)構(gòu)域的RGS蛋白質(zhì)對sst2的功能互補。
用39個堿基含有內(nèi)含HindIII位點的正向寡核苷酸引物5’-GCCCAAGCTTCCGCCAGCCATGGCAACCGAGGGGCTGCA(SEQ ID NO29)和24個堿基含有內(nèi)含XhoI位點的反向寡核苷酸引物5’-CCGCTCGAGTTAGGCCCAGACTCT(SEQ ID NO30)及hGβ5重組載體作模板，通過PCR，獲得編碼人Gβ5的cDNA(Liang等，2000)。用HindIII和XhoI消化hGβ5的PCR產(chǎn)物，凝膠純化，及連接到HindIII和XhoI消化的p425TEF。通過序列分析證實由此得到的重組載體，命名為hGβ5-p425TEF。共轉(zhuǎn)化該載體與FUS1-熒光素酶報道分子質(zhì)粒(Kp120)，和前述編碼RGS2、RGS4、RGS7、RGS9和RGSZ1的重組質(zhì)粒或空質(zhì)粒載體進入酵母株系KY113中。在下表中概括了由此產(chǎn)生的含有質(zhì)粒聯(lián)合的酵母株系。
表3

如前述，在信息素應答暈圈測定和熒光素報道分子測定中檢測這些株系。圖10描繪了暈圈測定的RGS7的結(jié)果，圖11是RGS9的結(jié)果。作為對照，我們檢測hGβ5對RGS4互補sst2能力的影響。RGS4是206個氨基酸的短RGS蛋白質(zhì)，不含有GGL結(jié)構(gòu)域。共表達hGβ5和RGS4株系與表達RGS4和空對照載體.0結(jié)構(gòu)域，所以能夠預測Gβ5共表達將類似地影響這些RGS蛋白質(zhì)。然而，hGβ5和RGS9的共表達對RGS7沒有影響，因為暈圈與載體對照株系類似。然而，hGβ5的共表達與載體對照株系相比，引起了暈圈大小的增加(而不是通過RGS表達出現(xiàn)的降低)。hGβ5單獨的表達沒有影響，與僅有對照的載體類似。這是意外的結(jié)果，表明盡管RGS7和RGS9結(jié)構(gòu)域的相似性，但實際上兩個RGS蛋白質(zhì)可以是功能不相同。
實施例9嵌合RGS蛋白質(zhì)為了進一步研究測定的用途，檢測了多個嵌合RGS蛋白質(zhì)。具體的RGS嵌合蛋白質(zhì)如下所述，但是總的說來，我們研究了N-末端和C-末端RGS蛋白質(zhì)聯(lián)合，或已證明互補sst2敲除的RGS蛋白質(zhì)(例如RGS4)N-末端區(qū)域的添加對不同但全長RGS蛋白質(zhì)的作用。
用在嵌合基因構(gòu)建中的克隆策略1.RGS4N/RGS7C用大鼠RGS4的cDNA作模板，通過PCR獲得編碼RGS4氨基酸1-57的171bp RGS4 N-末端區(qū)。正向引物含有內(nèi)含BamHI位點chiRgs4 Nterm 5’-CGCGGATCCATGTGCAAAGGGCTTGCA(SEQ ID NO31)而反向引物含有內(nèi)含SmaI位點chiRgs4r Nterm 5’-TCCCCCGGGCTTGACTTCCTCTTGGCT(SEQ ID NO32)RGS7 C-末端區(qū)域起始于全長人RGS7的GGL結(jié)構(gòu)域直到最后一個氨基酸，對其進行擴增以產(chǎn)生編碼RGS7氨基酸255-470的645bp產(chǎn)物。正向引物含有內(nèi)含SamI位點chiRgs7 Cterm 5’-TCCCCCGGGGATGAGTTACAACAACAG(SEQ ID NO33)反向引物含有內(nèi)含ClaI位點chiRgs7r Cterm 5’-CCCATCGATTTAGTAAGACTGAGC(SEQ ID NO34)凝膠純化兩個PCR產(chǎn)物，用SmaI切割，連接。然后用連接混合物作為模板以產(chǎn)生816bp的全長嵌合PCR產(chǎn)物。用在PCR反應中的正向引物是chiRgs4 Nterm(SEQ ID NO31)和反向引物chiRgs7r Cterm(SEQ ID NO34)。凝膠純化得到的嵌合基因，再次擴增，用適合的限制性酶切割，克隆進入載體p426TEF的BamHI和ClaI位點，其編碼N-末端HA標簽。
2.RGS7N/RGS4CRGS7的N-末端區(qū)域包含RGS7的GGL結(jié)構(gòu)域，用人RGS7 cDNA作模板，擴增以產(chǎn)生996bp編碼1-332氨基酸的PCR產(chǎn)物。正向引物含有內(nèi)含BamHI位點chiRgs7 Nterm 5’-CGCGGATCCATGGCCCAGGGGAAT(SEQ ID NO35)而反向引物含有內(nèi)含SmaI位點chiRgs7r Nterm 5’-TCCCCCGGGAAAACCCCATCGTTT(SEQ ID NO36)RGS4C區(qū)域僅含有RGS4核心結(jié)構(gòu)域，用RGS4 cDNA作為模板，擴增以產(chǎn)生447bp編碼58-206氨基酸的PCR產(chǎn)物。正向引物含有內(nèi)含SmaI位點chiRgs4 Cterm 5’-TCCCCCGGGAAATGGGCTGAATCACTG(SEQ ID No37)
反向引物含有內(nèi)含ClaI位點chiRgs4r Cterm 5’-CCCATCGATTTAGGCACACTGAGGGAC(SEQ ID NO38)凝膠純化兩個PCR產(chǎn)物，用SmaI切割，連接。然后用連接混合物作為模板用于1443bp嵌合基因產(chǎn)物的PCR擴增。所用引物如上所述。正向引物是chiRgs7 Nterm(SEQ ID NO35)，而反向引物是chiRgs4r Cterm(SEQ ID NO38)。凝膠純化得到的嵌合基因，再次擴增，用適合的限制性酶切割，克隆進入載體p426TEF的BamHI和ClaI位點，其編碼N-末端HA標簽。
3.RGS4N/RGS10(全長)RGS4區(qū)域與上述RGS4N/RGS7C嵌合體所述RGS4區(qū)域相同。
用SmaI和XhoI，通過限制消化從p426-RGS10獲得用于該嵌合體的RGS10(全長)。用人RGS10的cDNA(Genbank no.XM_049797)作模板，通過PCR擴增構(gòu)建質(zhì)粒p426-RGS10。正向引物含有內(nèi)含HindIII位點RGS10 fwd 5’-CCCAAGCTTATGGAACACATCCACGACAGC(SEQ ID NO39)反向引物含有內(nèi)含XhoI位點RGS10 rev5’-CCGCTCGAGTCATGTGTTATAAATTCTGGA(SEQ ID NO40)凝膠純化504bp編碼全長RGS10的PCR產(chǎn)物，并克隆進入p426TEF的HindIII和XhoI位點。
如上所述，用SmaI切割上述RGS4 N-末端區(qū)域PGR產(chǎn)物，與凝膠純化的RGS10的SmaI和XhoI限制性片段連接。用連接混合物作為PCR模板以獲得嵌合RGS4/RGS10。所用正向引物是chiRgs4r Nterm(SEQ ID NO32)，而反向引物是RGS10 rev(SEQ ID NO40)，兩者如上所述。凝膠純化得到的嵌合基因，再次擴增，克隆進入載體p426TEF的BamHI和XhoI位點，其編碼N-末端HA標簽。
4.RGS4N/RGS7全長如上所述，獲得RGS4的N-末端區(qū)域。用克隆的人RGS7作模板擴增全長RGS7的cDNA以產(chǎn)生1410bp編碼1-470氨基酸的PCR產(chǎn)物。正向引物含有內(nèi)含SmaI位點RGS7N fwd 5’-TCCCCCGGGATGGCCCAGGGGAAT(SEQ ID NO41)
反向引物含有內(nèi)含ClaI位點Rgs7r Cterm 5’-CCCATCGATTTAGTAAGACTGAGC(SEQ ID NO42)凝膠純化兩個PCR產(chǎn)物，用SmaI切割，連接。然后用連接混合物作為PCR模板以獲得RGS4N/RGS7全長嵌合基因。正向引物是chiRgs4 Nterm(SEQ ID NO31)，反向引物是Rgs7r Cterm(SEQ ID NO42))。凝膠純化得到的嵌合基因，再次擴增和克隆進入載體p426TEF的BamHI和ClaI位點，其編碼N-末端HA標簽。
5.RGS4N/RGS9C構(gòu)建兩個不同RGS4N/RGS9C嵌合體，其中一個在RGS9的C-末端區(qū)域含有GGL結(jié)構(gòu)域，而另一個在RGS9的C-末端區(qū)域內(nèi)不含有GGL結(jié)構(gòu)域。
5a.RGS4N/RGS9C(減去GGL結(jié)構(gòu)域)如前述，通過PCR擴增RGS4的N-末端區(qū)域，用BamHI和HindIII消化，凝膠純化。
用人RGS9的cDNA作模板擴增RGS9的C-末端區(qū)域(減去GGL結(jié)構(gòu)域)，以獲得1125bp編碼302-675氨基酸的產(chǎn)物。正向引物含有內(nèi)含HindIII位點RGS9RGS fwd(減去GGL結(jié)構(gòu)域)5’-CCCAAGCTTATGAACTTCAGCGAA(SEQID NO43)反向引物含有內(nèi)含的XhoI位點RGS9RGS rev 5’-CCGCTCGAGTTACAGGCTCTCCCA(SEQ ID NO44)純化RGS9C(減去GGL結(jié)構(gòu)域)的PCR產(chǎn)物，用HindIII和XhoI切割，并克隆進入載體p426TEF的HindIII和XhoI位點。用BamHI和HindIII消化得到的質(zhì)粒，用BamHI和HindIII連接RGS4的N-末端片段以產(chǎn)生減去GGL結(jié)構(gòu)域的RGS4N/RGS9C嵌合質(zhì)粒。
5b.RGS4N/RGS9C(加上GGL結(jié)構(gòu)域)用RGS9的cDNA作模板，擴增包含GGL結(jié)構(gòu)域片段的RGS9的C-末端區(qū)域，以產(chǎn)生1356bp編碼人RGS9的223-675氨基酸的PCR產(chǎn)物。正向引物，RGS9chi Cterm HindIII fwd(加上GGL結(jié)構(gòu)域)含有內(nèi)含的HindII位點
5’-CCCAAGCTTGCTGTCAAAAAAGAGATC(SEQ ID NO45)反向引物含有內(nèi)含的XhoI位點RGS9RGS rev 5’-CCGCTCGAGTTACAGGCTCTCCCA(SEQ ID NO46)。
用HindII和XhoI切割RGS4N/RGS9C(減去GGL結(jié)構(gòu)域)嵌合質(zhì)粒(上述)，凝膠純化含有RGS4N的載體的cDNA帶。然后連接載體-RGS4N cDNA到HindIII和XhoI RGS9C(加上GGL)制備的PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生RGS4N/RGS9C加上GGL結(jié)構(gòu)域的嵌合質(zhì)粒。
6.RGS4N/axinPCR擴增存在于人axin中的RGS結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生441bp編碼199-345氨基酸的片段。正向引物，AxinSmaI fwd，含有內(nèi)含SmaI位點5’-TCCCCCGGGGGCAGTGCCTCCCCCACCCCACCAT(SEQ ID NO47)反向引物，AxinXhoI rev，含有內(nèi)含XhoI位點5’-CCGCTCGAGTTAGACTTTGGGGCTCTCCGA(SEQ ID NO48)用SmaI和XhoI切割含有RGS4N/RGS7C嵌合體的p426TEF質(zhì)粒以除去RGS7C片段，然后凝膠純化。然后載體-RGS4 DNA與編碼axin基因RGS結(jié)構(gòu)域的SmaI和XhoI片段連接以產(chǎn)生RGS4N/Axin嵌合質(zhì)粒。
7.RGS11用cDNA(GenBank no.NM_003834)作模板，擴增人RGS11以產(chǎn)生1341bp編碼1-447氨基酸的PCR產(chǎn)物。正向引物包含內(nèi)含EcoRI位點RGS11 fwd 5’-CCGGAATTCATGGCCGCCGGCCCCGCGCCG(SEQ ID NO49)反向引物包含內(nèi)含的HindIII位點RGS11 rev 5’-CCCAAGCTTCTAGGCCACCCCATCTCCACC(SEQ ID NO50)用EcoRI和HindIII消化得到的PCR產(chǎn)物，亞克隆進入p426TEF載體的類似位點。
8.RGS6從cDNA(GenBank no.AF156932)擴增人RGS6，以獲得1419bp編碼1-473氨基酸全長蛋白質(zhì)的PCR產(chǎn)物。正向引物含有內(nèi)含HindIII位點RGS6 fwd 5’-CCCAAGCTTATGGCTCAAGGATCCGGGGAT(SEQ ID NO51)反向引物包含內(nèi)含XhoI位點RGS6 rev 5’-CCGCTCGAGTCAGGAGGACTGCATCAG(SEQ ID NO52)。
用HindIII和XhoI消化PCR產(chǎn)物，克隆進入p426TEF載體的類似位點。
株系的產(chǎn)生產(chǎn)生酵母株系以評估各種RGS嵌合蛋白質(zhì)互補sst2敲除的能力。在人Gβ5存在和缺失的情況下，轉(zhuǎn)化RGS嵌合質(zhì)粒進入基礎株系KY113中。所有株系含有對照或表達質(zhì)粒和螢火蟲熒光素酶報道基因以實現(xiàn)在相似介質(zhì)條件下的研究。在下表中概括了株系表4

結(jié)果用信息素應答報道基因在信息素應答測定中，檢測這些株系的功能互補。例如，在定量測定中利用熒光素酶報道基因。在信息素應答的定量測定中，在“暈圈測定”中也檢測了株系對暴露于α因子2天的應答。
在劑量曲線測定中檢測所有株系。對于基于熒光素酶的測定，檢測的α因子劑量是0、100pmol、1nmol、10nmol、100nmol、1μmol、10μmol和100μmol。
如前述進行暈圈測定。為了比較大量的劑量應答曲線，測定應答為曲線內(nèi)α因子的單劑量。然后測定應答為對不含有RGS和不含有Gβ5陰性對照株系的百分比應答。例如，將類似于含有空載體的sst2敲除株系的沒有作用的構(gòu)建體評分為100，而功能互補高的RGS蛋白質(zhì)，例如RGS4，將評分為0。
我們實驗了多個短的，即相對低分子量的RGS蛋白質(zhì)。先前檢測了RGS2和RGSz，盡管其不如RGS4有效，但是顯示了一些互補sst2敲除表現(xiàn)型的能力。RGS10也是短的RGS蛋白質(zhì)，然而當作為野生型蛋白質(zhì)表達時，在熒光素酶或暈圈測定中，其沒有顯示互補作用。然而，RGS4/RGS10嵌合體恢復了RGS功能，達到非常接近單獨RGS4表達所觀察到的值。圖12顯示這些結(jié)果。
從這些數(shù)據(jù)中，RGS4是sst2敲除表現(xiàn)型互補作用中最有效的RGS蛋白質(zhì)。RGS7是無功能的，而且通過缺失N-末端區(qū)域也沒有很大程度的改進。圖14顯示這些數(shù)據(jù)。加RGS4N-1末端區(qū)域到RGS7 C-末端區(qū)域或加RGS4N-末端區(qū)域到全長RGS7蛋白質(zhì)能實現(xiàn)一些水平的功能互補。而且，在暈圈測定中注意到了一些改進。
RGS9天然狀態(tài)顯示了互補sst2敲除表現(xiàn)型的中等能力。在缺失RGS9N-末端區(qū)域時，該互補作用無效。然而，加RGS4N-末端到RGS9-ggl的非功能性C-末端改進了互補作用，通過RGS9的ggl結(jié)構(gòu)的除去進一步改進了互補作用。
此外，我們觀察了RGS6(值是25)和RGS11(值是50)的一些中等互補作用，該中等互補作用不受Gβ5共表達的影響。
我們觀察了表達RGS9株系的應答差異，其中野生型蛋白質(zhì)有一些作用；而與Gβ5共表達常常觀察到增強的信息素應答。通過Gβ5和其它含有GGL的RGS蛋白質(zhì)，即RGS6，RGS7和RGA11的表達，沒有觀察到類似的作用。這些發(fā)現(xiàn)表明RGS9交替(alternate)的功能。
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因此，整體并入所有引用的出版物，專利和專利申請為參考文獻。
盡管上述說明書和為示例性目提供的實施例教授了本發(fā)明的原理，但是從閱讀該說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在不背離本發(fā)明實質(zhì)范圍內(nèi)可以進行各種形式和細節(jié)的變化。
序列表<110>WYETH公司<120>用于檢測RGS蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)物的方法和細胞<130>P03US051823<150>US 60/250，147<151>2000-12-01<160>52<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>26<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>1gacgtctccc atgtgcaaag gactcg 26<210>2<211>37<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>2cgggatcctt attaggcaca ctgagggact agggaag 37<210>3<211>31<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>3gaggatccgg cacactgagg gactagggaa g 31<210>4<211>20<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>4tttttacaga tcatcaagga 20<210>5<211>20<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>5tgcgtcttca gagcgctttt20<210>6<211>23<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>6gagccaagaa gaagtcaaga aat23<210>7<211>19<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>7tgggcttcat caaaacagg 19<210>8<211>21<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>8tatcgagtca atggggcagg c 21<210>9<211>21<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>9cgaaacgtgg attggtgaaa g 21<210>10<211>23<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>10attcggctat gactgggcac aac23<210>11<211>23<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>11gtaaagcacg aggaagcggt cag23<210>12<211>21<212>DNA<213>北美螢火蟲(Photinus pyralis)<400>12atataagcca tcaagtttct g 21<210>13<211>20<212>DNA<213>北美螢火蟲(Photinus pyralis)<400>13ctcactaaag ggaacaaaag20<210>14<211>24<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>14tcagtttcat ttttcttgtt ctat 24<210>15<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15ggatccatgg gatcagagcg gatg 24<210>16<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16cgatcgatta ctatgcttca atagatt27<210>17<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>17ccagcgggag aacgataatg c 21<210>18<211>18<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>18cccctcagga aaagaatg 18<210>19<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19cttggcggag gagggcacac20<210>20<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>20tggaggcatt gagacggaag a 21<210>21<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>21gcggatccat gaaacctcca acagaag27<210>22<211>26<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>22cgatcgatta ttagtaagac tgagca 26<210>23<211>40<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>23gcaagcttcc accatgacaa tccgacacca aggccagcag 40<210>24<211>36<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>24gctctagatt acaggctctc ccaggggcag atgacc 36<210>25<211>35<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>25ccggatccag atgacaatcc gacaccaagg ccagc 35<210>26<211>36<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>26cgctcgagtt acaggctctc ccaggggcag atgacc 36<210>27<211>28<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>27gcggatccat gaagaaacaa acagtcgt 28<210>28<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>28cgatcgaatt attacaggct ctcccag27<210>29<211>39<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>29gcccaagctt ccgccagcca tggcaaccga ggggctgca 39<210>30<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>30ccgctcgagt taggcccaga ctct 24<210>31<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>31cgcggatcca tgtgcaaagg gcttgca27<210>32<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>32tcccccgggc ttgacttcct cttggct27<210>33<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>33tcccccgggg atgagttaca acaacag27<210>34<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>34cccatcgatt tagtaagact gagc 24<210>35<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>35cgcggatcca tggcccaggg gaat 24<210>36<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>36tcccccggga aaaccccatc gttt 24<210>37<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>37tcccccggga aatgggctga atcactg27<210>38<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>38cccatcgatt taggcacact gagggac27<210>39<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>39cccaagctta tggaacacat ccacgacagc 30<210>40<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>40ccgctcgagt catgtgttat aaattctgga 30<210>41<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>41tcccccggga tggcccaggg gaat 24<210>42<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>42cccatcgatt tagtaagact gagc 24<210>43<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>43cccaagctta tgaacttcag cgaa 24<210>44<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>44ccgctcgagt tacaggctct ccca 24<210>45<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>45cccaagcttg ctgtcaaaaa agagatc27<210>46<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>46ccgctcgagt tacaggctct ccca 24<210>47<211>34<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>47tcccccgggg gcagtgcctc ccccacccca ccat34<210>48<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>48ccgctcgagt tagactttgg ggctctccga 30<210>49<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>49ccggaattca tggccgccgg ccccgcgccg 30<210>50<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>50cccaagcttc taggccaccc catctccacc 30<210>51<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>51cccaagctta tggctcaagg atccggggat 30<210>52<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>52ccgctcgagt caggaggact gcatcag2權(quán)利要求
1.一種對信息素應答的細胞，該細胞包含與信息素應答啟動子可操作地連接的編碼報道分子的異源核酸，其中報道分子是海腎熒光素酶(Renilla luciferase)，蟲熒光素酶(Photinus luciferase)，綠色熒光蛋白質(zhì)，或綠色熒光蛋白質(zhì)的衍生物。
2.如權(quán)利要求1的所述細胞，該細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞。
3.如權(quán)利要求2的所述細胞，該細胞是酵母細胞。
4.如權(quán)利要求1的所述細胞，其中所述異源核酸在質(zhì)粒中。
5.如權(quán)利要求1的所述細胞，其中所述異源核酸整合進入細胞基因組。
6.如權(quán)利要求1的所述細胞，其中所述的信息素應答啟動子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
7.如權(quán)利要求3所述的細胞，其中所述的酵母細胞是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，或巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)。
8.如權(quán)利要求7所述的細胞，其中所述酵母細胞是釀酒酵母。
9.如權(quán)利要求1所述的細胞，該細胞還包含編碼RGS蛋白質(zhì)的異源核酸。
10.如權(quán)利要求9的所述細胞，其中所述的RGS蛋白質(zhì)缺少GGL或DEP結(jié)構(gòu)域。
11.如權(quán)利要求9的所述細胞，該細胞還包含編碼與異源RGS蛋白質(zhì)對應的天然RGS蛋白質(zhì)的內(nèi)源核酸，其中突變該內(nèi)源核酸，使其不產(chǎn)生功能性天然RGS蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11的所述細胞，其中所述突變是缺失、插入或置換中的一種。
13.如權(quán)利要求9所述的細胞，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同種型，或含有RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
14.如權(quán)利要求13所述的細胞，其中所述的RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域是PLCB或cGMP PDE的γ亞基。
15.如權(quán)利要求13所述的所述細胞，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。
16.如權(quán)利要求9所述的細胞，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是嵌合體。
17.如權(quán)利要求16所述的細胞，其中所述的嵌合體包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS結(jié)構(gòu)域，或其部分。
18.如權(quán)利要求17所述的細胞，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
19.如權(quán)利要求17所述的細胞，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
20.如權(quán)利要求17所述的細胞，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
21.如權(quán)利要求17所述的細胞，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
22.如權(quán)利要求17所述的細胞，其中所述的axin RGS結(jié)構(gòu)域包含axin的氨基酸199-345。
23.一種包含編碼嵌合的RGS蛋白質(zhì)的異源核酸的細胞。
24.如權(quán)利要求24所述的細胞，該細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞。
25.如權(quán)利要求5所述的細胞，該細胞是酵母細胞。
26.如權(quán)利要求24所述的細胞，其中所述異源核酸在質(zhì)粒中。
27.如權(quán)利要求24所述的細胞，其中所述異源核酸整合進入細胞的基因組。
28.如權(quán)利要求24所述的細胞，其中所述嵌合體包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS結(jié)構(gòu)域。
29.如權(quán)利要求29所述的細胞，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
30.如權(quán)利要求29所述的細胞，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
31.如權(quán)利要求29所述的細胞，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
32.如權(quán)利要求29所述的細胞，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
33.如權(quán)利要求29所述的細胞，其中所述axin RGS結(jié)構(gòu)域包含axin的氨基酸199-345。
34.一種編碼嵌合的RGS蛋白質(zhì)的分離核酸。
35.如權(quán)利要求35所述的分離核酸，其中所述嵌合體包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS結(jié)構(gòu)域，或其部分。
36.如權(quán)利要求36所述的分離核酸，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
37.如權(quán)利要求36所述的分離核酸，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
38.如權(quán)利要求36所述的分離核酸，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
39.如權(quán)利要求36所述的分離核酸，其中所述的R6S4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
40.如權(quán)利要求36所述的分離核酸，其中所述axin RGS結(jié)構(gòu)域包含axin的氨基酸199-345。
41.一種包含有如權(quán)利要求35所述的分離核酸的載體。
42.如權(quán)利要求42的載體，該載體是質(zhì)?；虿《?。
43.如權(quán)利要求43的載體，該載體是質(zhì)粒。
44.如權(quán)利要求44的載體，其中所述的質(zhì)粒是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
45.一種包含有如權(quán)利要求42所述的載體的細胞。
46.如權(quán)利要求9所述的細胞，該細胞還包含編碼Gβ5的異源核酸。
47.如權(quán)利要求47所述的細胞，其中Gβ5是人Gβ5。
48.一種檢測實驗樣品改變RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因表達能力的方法，該方法包括(a)提供至少一種對信息素應答的第一細胞，其中該第一細胞包含編碼報道分子的異源核酸，該異源核酸可操作地與信息素應答啟動子連接，其中異源核酸的表達產(chǎn)生可檢測的信號；(b)提供至少一種對信息素應答的第二細胞，其中該第二細胞包含編碼報道分子的異源核酸和編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸，所述編碼報道分子的異源核酸可操作地與信息素應答啟動子連接，并且該異源核酸的表達產(chǎn)生可檢測的信號；(b)在信息素存在的情況下和在適合檢測可檢測信號的條件下，將實驗樣品與第一或第二細胞一起溫育；(c)檢測編碼報道分子的異源核酸表達的水平；和(d)比較第一細胞和第二細胞中的表達水平，其中表達水平的差異表明實驗樣品改變了RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因的表達。
49.如權(quán)利要求49所述的方法，其中以單一濃度使用實驗樣品。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中在一個濃度范圍內(nèi)使用實驗樣品。
51.如權(quán)利要求49所述的方法，其中在暈圈測定中檢測報道分子的表達水平。
52.如權(quán)利要求49所述的方法，其中用分光光度計測量檢測報道分子的表達水平。
53.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述檢測是自動化的。
54.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的異源核酸編碼海腎熒光素酶，蟲熒光素酶，綠色熒光蛋白質(zhì)，或綠色熒光蛋白質(zhì)的衍生物。
55.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的第一和第二細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞。
56.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的第一和第二細胞是酵母細胞。
57.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的編碼報道基因的異源核酸在質(zhì)粒中。
58.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的編碼報道基因的異源核酸整合進入細胞的基因組。
59.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸在質(zhì)粒中。
60.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸整合進入細胞的基因組。
61.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的信息素應答啟動子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
62.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的酵母細胞是釀酒酵母，裂殖酵母或巴斯德畢赤酵母。
63.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述的酵母細胞是釀酒酵母。
64.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的RGS蛋白質(zhì)缺少GGL或DEP結(jié)構(gòu)域。
65.如權(quán)利要求49所述的方法，該方法還包括編碼與異源RGS蛋白質(zhì)對應的天然RGS蛋白質(zhì)的內(nèi)源核酸，其中突變該內(nèi)源核酸，使其不產(chǎn)生功能的天然RGS蛋白質(zhì)。
66.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述突變是缺失、插入或置換中的一種。
67.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同種型，或含有RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
68.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域是PLCB或cGMP PDE的γ亞基。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。
70.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述RGS蛋白質(zhì)是嵌合體。
71.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述嵌合體包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS結(jié)構(gòu)域，或其部分。
72.如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
75.如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
76.如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的axin RGS結(jié)構(gòu)域包含axin的氨基酸199-345。
77.一種檢測實驗樣品改變RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因表達能力的方法，該方法包括(a)提供至少兩等量份對信息素應答的細胞，其中該細胞包含編碼報道分子的異源核酸和編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸，所述編碼報道分子的異源核酸可操作地與信息素應答啟動子連接，并且該異源核酸的表達產(chǎn)生可檢測的信號；(b)在信息素存在情況下和在適合檢測可檢測信號條件下，溫育的所述等量份細胞，其中一等量份含有實驗樣品；(c)檢測等量份中編碼報道分子的異源核酸的表達水平；和(d)比較等量份中報道分子的表達水平，其中等量份間表達水平的差異表明實驗樣品改變了RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因的表達。
78.如權(quán)利要求78所述的方法，其中以單一濃度使用實驗樣品。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中在一個濃度范圍內(nèi)使用實驗樣品。
80.如權(quán)利要求78所述的方法，其中在暈圈測定中檢測報道分子的表達水平。
81.如權(quán)利要求78所述的方法，其中用分光光度計測量檢測報道分子的表達水平。
82.如權(quán)利要求82所述的方法，其中所述的檢測是自動化的。
83.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的異源核酸編碼海腎熒光素酶，蟲熒光素酶，綠色熒光蛋白質(zhì)，或綠色熒光蛋白質(zhì)的衍生物。
84.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞。
85.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述的細胞是酵母細胞。
86.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的編碼報道基因的異源核酸在質(zhì)粒中。
87.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的編碼報道基因的異源核酸整合進入細胞的基因組。
88.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸在質(zhì)粒中。
89.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸整合進入細胞的基因組。
90.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的信息素應答啟動子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
91.如權(quán)利要求86所述的方法，其中所述的酵母細胞是釀酒酵母，裂殖酵母或巴斯德畢赤酵母。
92.如權(quán)利要求92所述的方法，其中所述的酵母細胞是釀酒酵母。
93.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的RGS蛋白質(zhì)缺少GGL或DEP結(jié)構(gòu)域。
94.如權(quán)利要求78所述的方法，該方法還包括編碼與異源RGS蛋白質(zhì)對應的天然RGS蛋白質(zhì)的內(nèi)源核酸，其中突變該內(nèi)源核酸，使其不產(chǎn)生功能性天然RGS蛋白質(zhì)。
95.如權(quán)利要求95所述的方法，其中所述的突變是缺失、插入或置換中的一種。
96.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同種型，或含有RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
97.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述的RGS-樣(RGL)結(jié)構(gòu)域是PLCB或cGMP PDE的γ亞基。
98.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。
99.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的RGS蛋白質(zhì)是嵌合體。
100.如權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的嵌合體包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL結(jié)構(gòu)域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS結(jié)構(gòu)域，或其部分。
101.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
102.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
103.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
104.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
105.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的axin RGS結(jié)構(gòu)域包含axin的氨基酸199-345。
全文摘要
本申請描述了對信息素應答的新的細胞，其包含與信息素應答啟動子可操作地連接的編碼報道分子的異源核酸。所述細胞還可以進一步包含編碼RGS蛋白質(zhì)的第二異源核酸。還描述了涉及利用這些細胞檢測實驗樣品改變RGS蛋白質(zhì)介導的報道基因表達能力的方法。
文檔編號C12N15/62GK1478097SQ01819911
公開日2004年2月25日 申請日期2001年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月1日
發(fā)明者凱思琳·H·楊, 曹健, 大衛(wèi)·謝瓦, 凱思琳 H 楊, 謝瓦 申請人:Wyeth公司