專利名稱：一種高效、廣譜角蛋白酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種角蛋白酶及其基因。
角蛋白酶可應(yīng)用于飼料工業(yè)，將羽毛、豬毛等廢棄物轉(zhuǎn)化為高營(yíng)養(yǎng)飼料蛋白。角蛋白是禽類加工過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物—羽毛中的主要組分，羽毛粉中蛋白質(zhì)含量高達(dá)90％以上，必需氨基酸含量極高，是動(dòng)物飼料中的優(yōu)良蛋白源，但它以半胱氨酸二硫鍵高度互連而形成，不溶于水、不能被一般蛋白酶所降解，因而它在動(dòng)物體內(nèi)難以被消化利用。如何將羽毛發(fā)酵物轉(zhuǎn)化為動(dòng)物可利用的蛋白源是目前亟待解決的問(wèn)題。以往用蒸煮或化學(xué)的方法處理，一方面使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)被大量破壞，另一方面還造成了環(huán)境污染。利用角蛋白酶可有效地解決這一問(wèn)題，它的優(yōu)點(diǎn)在于更為經(jīng)濟(jì)，同時(shí)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值好，而且無(wú)污染。羽毛廢棄物資源極為豐富，僅在美國(guó)北卡羅拉州一年的羽毛廢棄物就超過(guò)10萬(wàn)噸，我國(guó)是單胃畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，每年的羽毛廢棄物超過(guò)60萬(wàn)噸，目前這部分優(yōu)良的蛋白源未能得到有效利用，造成了資源浪費(fèi)并污染環(huán)境，而我國(guó)又是飼料蛋白資源嚴(yán)重匱乏的國(guó)家，按照我國(guó)飼料工業(yè)發(fā)展規(guī)劃，到2010年飼料蛋白的缺口將達(dá)到800萬(wàn)噸，羽毛廢棄物的有效開發(fā)利用對(duì)我國(guó)這種蛋白資源極度匱乏的國(guó)家有著重要的意義。
角蛋白酶還可應(yīng)用于食品工業(yè)，如可使角蛋白降解為氨基酸和短肽，作為營(yíng)養(yǎng)學(xué)藥物；用來(lái)生產(chǎn)魚露、肉胨等高營(yíng)養(yǎng)食品，或作為肉類嫩化劑。在皮毛加工工業(yè)中，它可替代普通蛋白酶或與普通蛋白酶配合使用，提高處理效果并降低處理成本。在洗滌劑行業(yè)，可用于加酶洗滌劑。在美容保健上，角蛋白酶可溶解皮膚表層皮屑和黑斑，使皮膚柔軟、光滑，并能去除頭皮屑、軟化頭發(fā)和毛發(fā)等。在醫(yī)藥上，角蛋白酶可促使傷口愈合、去痂和上皮再生，是外科手術(shù)和皮膚燒傷、創(chuàng)傷的特效藥，也是治療高胱氨酸尿的特效藥。
角蛋白酶的研究工作已有幾十年的歷史，自然界中許多微生物均能分泌角蛋白酶，目前國(guó)內(nèi)外已有多種產(chǎn)角蛋白酶的真菌和細(xì)菌得到分離，國(guó)內(nèi)的如曲霉(張道海，生物技術(shù)，411-14，1994；羅文等，微生物學(xué)通報(bào)，20209～212，1993)、鏈霉菌(涂國(guó)全，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，16399～403，1994；丁正民等，微生物學(xué)報(bào)，33227～232，1993)等。國(guó)外分離到的角蛋白酶產(chǎn)生菌也主要集中在鏈霉菌和真菌上，如弗氏鏈霉菌(Noval，J Bacteriol，77251，1959)，真菌Cylindrocarpon、Graphium和Microsporum等(Malviya，Indian J Experiment Biol.30103，1992)。對(duì)產(chǎn)生的角蛋白酶也進(jìn)行了初步的酶學(xué)性質(zhì)研究，但由于這些菌株產(chǎn)生的酶大部分未進(jìn)行純化，不能確定這些菌株分解角蛋白的能力是由一種酶實(shí)現(xiàn)的還是由包括角蛋白酶在內(nèi)的混合蛋白酶完成的。
1992年美國(guó)Lin等(Appl Environ Microbiol，583271，1992)分離到一株產(chǎn)角蛋白酶的芽孢桿菌PWD-1，并對(duì)所產(chǎn)的角蛋白酶進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)此角蛋白酶無(wú)需別的蛋白酶配合就能降解角蛋白，它的分子量約為30kD，最適pH為7.5，比活性為5990U/mg酶蛋白，酶具有自我催化裂解作用，穩(wěn)定性較差，在室溫下的半衰期僅有4～5天。它除了能降解角蛋白外，還可降解多種動(dòng)植物蛋白。
到目前為止，國(guó)內(nèi)外還未有角蛋白酶的商品化生產(chǎn)和廣泛的實(shí)際應(yīng)用，其最主要的原因在于1.天然菌株中角蛋白酶的產(chǎn)量太低，使生產(chǎn)成本高昂，難以商品化生產(chǎn)；2.分離到的角蛋白酶的有效性不夠好，作用緩慢，如一般需數(shù)天乃至數(shù)十天才能將羽毛桿完全水解，限制了它的實(shí)際應(yīng)用。在高效角蛋白酶的篩選和分離上，目前國(guó)內(nèi)外分離到的各種角蛋白酶的有效性均不令人滿意，國(guó)外也正在嘗試通過(guò)蛋白質(zhì)工程來(lái)進(jìn)行分子改造以提高酶的有效性，但還未取得突破。
國(guó)內(nèi)外已意識(shí)到基因工程的方法有望大副度提高角蛋白酶的單位產(chǎn)量。近年來(lái)國(guó)外已進(jìn)行了嘗試，但到目前為止，國(guó)外僅分離克隆到了一個(gè)角蛋白酶編碼基因(Shih，US Patent 5712147，1998；Wo Patent95/33056)，此基因來(lái)源于地衣芽孢桿菌PWD-1，結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1140bp，編碼379個(gè)氨基酸。1997年成功地將此基因在重組枯草芽孢桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)的角蛋白酶具有正常的生物學(xué)活性，在最高搖床水平上最高的重組子其角蛋白酶表達(dá)量比原始菌株提高了3倍(Lin，J IndMicrobiol Biotechnol，19134，1997)，對(duì)重組枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵研究表明，角蛋白酶的表達(dá)量達(dá)到300～500U/mL發(fā)酵液(Wang，JInd Microbiol Biotechnol，22608～616，1999)。由于構(gòu)建的枯草芽孢桿菌基因工程菌株比原始天然菌株單位產(chǎn)量還低，同時(shí)此角蛋白酶存在自溶現(xiàn)象，極不穩(wěn)定，因此還達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的要求。國(guó)內(nèi)雖然開展角蛋白酶研究工作較早，但均集中在菌株分離上，目前還未分離出一個(gè)角蛋白酶編碼基因，更談不上構(gòu)建基因工程高效菌株。
本發(fā)明人篩選到一種天然菌株，它所產(chǎn)生的角蛋白酶具有優(yōu)良的性質(zhì)。本發(fā)明篩選到的角蛋白酶來(lái)源于真菌發(fā)癬菌Trichophyton sp.95，具有高的比活性。其比活性為7000U/mg，高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道中的各種角蛋白酶，如來(lái)源于Bacillus licheniformis PWD-1的角蛋白酶(6000U/mg)(Applied Environ.Microbio.583271-3275，1992)和來(lái)源于鏈霉菌的角蛋白酶(124.8U/mg)(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，19(4)60-65)。本發(fā)明人篩選分離到的此角蛋白酶同時(shí)對(duì)α-角蛋白(如羊毛和頭發(fā))和β-角蛋白(如羽毛)有高效降解作用，而目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的各種來(lái)源的角蛋白酶一般只能降解β-角蛋白；此角蛋白酶的最適pH為7.0，有效作用pH值較寬，為4～10，具有很好的熱穩(wěn)定性，在70℃下處理1小時(shí)，其酶活性還維持在90％左右，并且酶本身無(wú)自我催化裂解作用，優(yōu)于報(bào)道中的各種角蛋白酶。如來(lái)源于Bacillus licheniformis PWD-1的角蛋白酶的最適pH值為7.9，耐熱性差，且會(huì)自我催化裂解(Applied Environ.Microbio.583271-3275，1992)。來(lái)源于鏈霉菌的角蛋白酶有效作用pH值為7～10，在70℃下處理0.5小時(shí)，其酶活性只維持在70％左右(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，19(4)60-65)。
本發(fā)明分離克隆到此角蛋白酶的編碼基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供優(yōu)良的基因材料。通過(guò)PCR的方法分離克隆了這一角蛋白酶基因kerB，DNA全序列分析結(jié)果表明，此角蛋白酶全長(zhǎng)1434核苷酸，編碼477個(gè)氨基酸，與國(guó)外唯一克隆到的角蛋白酶基因kerA(來(lái)源于Bacilluslicheniformis PWD-1)的氨基酸序列無(wú)同源性，是一個(gè)新角蛋白酶基因，其氨基酸序列示于SEQ ID NO2。
采用羽毛角蛋白為唯一N源，連續(xù)富集培養(yǎng)的方式篩選角蛋白酶產(chǎn)生菌。腐爛羽毛土樣樣品按常規(guī)稀釋后接種到篩選培養(yǎng)液(1.5g/LKH2PO4、0.025g/L MgSO4.7H2O、0.025g/L CaCl、0.015g/L FeSO4.7H2O、0.005g/L ZnSO4、0.5g/L羽毛粉，pH6.0)中，30℃培養(yǎng)10～15d，挑取繁殖生長(zhǎng)的菌液連續(xù)在此培養(yǎng)液中培養(yǎng)3輪，再在篩選培養(yǎng)基平板上涂布分離，挑取單菌落重新接種到篩選培養(yǎng)液中，生長(zhǎng)良好的菌株再重復(fù)平板分離和液體篩選培養(yǎng)，使菌株純化。通過(guò)此方法篩選到分泌角蛋白酶的菌株24株。
為了進(jìn)一步證實(shí)篩選到的菌株能分泌角蛋白酶，對(duì)菌株培養(yǎng)液進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶學(xué)測(cè)定方法與Lin報(bào)道的相同(Appl.Environ.Microbiol，583271～3275)。將5mg的疊氮角蛋白加入到0.8mL 0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，加入0.2mL酶稀釋液，50℃水浴振蕩15分鐘，加入0.2mL 10％TCA終止反應(yīng)，反應(yīng)液過(guò)濾后在450nm處測(cè)OD值。對(duì)照為先加入酶稀釋液和TCA后再加入底物。酶活性定義為酶反應(yīng)15分鐘后OD值增加0.01為1U。通過(guò)酶活性測(cè)定，挑選有角蛋白酶活性的菌株，其中最高的一株酶活性達(dá)到64U/mL培養(yǎng)液，初步鑒定為Trichophyton sp.95，并做為進(jìn)一步研究的材料。
實(shí)驗(yàn)二本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明角蛋白酶的純化程序。
首先進(jìn)行角蛋白酶的硫酸銨沉淀，菌株在篩選培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6～7天后，離心取上清酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至50％飽和度，置冰上2小時(shí)，然后13000rpm離心30min，取沉淀，沉淀用0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)重溶，成為濃縮酶液。接著進(jìn)行離子交換層析純化，將濃縮酶液上HiTrap_Q_Sepharose_XL(amersham pharmacia biotech預(yù)裝柱)陰離子柱。加樣0.5ml，先用pH8.5、0.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液洗脫平衡柱子，改用相同緩沖液配制的0～1mol/L NaCl梯度洗脫，流速為2ml/min，分部收集，每管1ml。然后對(duì)收集管中的溶液測(cè)酶活并進(jìn)行蛋白電泳分析。最后進(jìn)行凝膠層析分離，將經(jīng)離子交換柱層析后的檢測(cè)有酶活的收集樣再經(jīng)一次分子篩Superdex_75_HR_10/30(amersham pharmacia biotech預(yù)裝柱)，加樣0.5ml，用pH5.5醋酸緩沖液洗脫，流速為0.4ml/min，分部收集，每管1ml，得到純角蛋白酶KERB。
分別測(cè)定了以上各步樣品的酶活力、蛋白質(zhì)含量并進(jìn)行了SDS-PAGE。純化結(jié)果見表1，粗酶液經(jīng)幾步純化后，比活性從88.4/mg提高到7020.6/mg，純化倍數(shù)為79.4倍。蛋白電泳結(jié)果(

圖1)表明，純化后的角蛋白酶成熟蛋白在電泳上為單一條帶，分子量約為43kD。
表1角蛋白酶KERB純化步驟及結(jié)果比活性(U/mg)純化倍數(shù)粗酶液 88.41濃縮液 548.1 6.2過(guò)離子柱 4172.5 47.2過(guò)分子篩 7020.6 79.4注蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮蘭法測(cè)定實(shí)驗(yàn)三本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定方法。
角蛋白酶的最適pH測(cè)定方法如下經(jīng)純化的角蛋白酶在不同的pH值下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。底物角蛋白在不同pH的緩沖液中50℃下進(jìn)行角蛋白酶活力測(cè)定。結(jié)果(圖2)表明，KERB的最適pH為7.0，在pH4～10的范圍內(nèi)，酶活性均維持在最大酶活性的60％以上。
角蛋白酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定方法如下角蛋白酶的最適溫度的測(cè)定為在Tris-HCl緩沖液(pH7.0)體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為角蛋白酶在70℃下處理不同時(shí)間，再在50℃下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖3)表明，其最適溫度為60℃。酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明(圖4)，70℃處理30min后，剩余酶活還有95％左右，處理60min后，酶活性依然維持在90％以上。
在pH7.0的Tris-HCl緩沖液中分別加入洗干凈的雞羽毛和人頭發(fā)，再加入300U的角蛋白酶，50℃下水浴振蕩3小時(shí)，可觀察到羽毛和頭發(fā)均完全溶解，這說(shuō)明此角蛋白酶不但能降解β-角蛋白(如羽毛)，還能降解α-角蛋白(頭發(fā))。
KERB的普通蛋白酶活性按中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T1803-93進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，KERB能高效地降解酪蛋白，1U的角蛋白酶活性相當(dāng)于1.2U的蛋白酶活性。同時(shí)，KERB對(duì)可溶性的牛血清白蛋白(BSA)、不容性的膠原蛋白等均有降解作用。
對(duì)純化后的KERB成熟蛋白N端進(jìn)行了氨基酸序列測(cè)定，結(jié)果表明其N-端的前8個(gè)氨基酸序列為A-E-S-T-L-G-A-A。
實(shí)驗(yàn)四本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明角蛋白酶編碼基因kerB的分離克隆程序菌株總DNA的提取采用中性裂解法，菌株培養(yǎng)5天后收集菌體，用液氮冷凍并研磨成粉狀，10mg菌體中加入10mL SDS-TE緩沖液(4％SDS、10mmol/LTris、0.1mmol/LEDTA，pH8.0)在室溫下裂解5min，用等體積的酚、酚-氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉淀。
根據(jù)測(cè)定的此角蛋白酶N端氨基酸序列合成簡(jiǎn)并引物，分別與20個(gè)隨機(jī)引物組對(duì)PCR擴(kuò)增角蛋白酶成熟蛋白的編碼序列。含有成熟酶編碼序列的PCR片段電泳回收后分別克隆到PGEM-T載體上，進(jìn)行序列分析。根據(jù)序列分析的結(jié)果，再合成反向PCR引物，分別與隨機(jī)引物組對(duì)后擴(kuò)增基因5′端信號(hào)肽編碼序列。
根據(jù)此成熟酶N端氨基酸序列合成簡(jiǎn)并引物，設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物為P1 5′GC(C/T/A/G)GA(G/A)AG(T/C)AC(G/A)CT(G/A/T/C)GG 3′另一端的引物采用20個(gè)隨機(jī)引物，分別與引物P1組對(duì)，以總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃變性1min、50℃退火45sec、72℃延伸1min；循環(huán)30輪后72℃保溫10min。其中僅一組引物擴(kuò)增到了約1.6kb的PCR片段。根據(jù)測(cè)定的此蛋白的分子量，推斷此酶蛋白的編碼基因長(zhǎng)度不超過(guò)1.4kb，如果此PCR片段為角蛋白酶編碼基因，應(yīng)該包括完整的結(jié)構(gòu)基因3′端。挑取此1.6kb的PCR片段，將它克隆到pGEM-T載體上，進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，在此片段有一個(gè)長(zhǎng)1359bp的閱讀框架，5′端編碼的6個(gè)氨基酸與氨基酸序列測(cè)定結(jié)果相一致，初步判斷為我們擬克隆的目的基因。
為了克隆酶蛋白N-端的信號(hào)肽編碼序列，我們根據(jù)上述測(cè)定的序列結(jié)果，設(shè)計(jì)合成一段反向PCR引物P25′GTTGAACTCACGGCTCGC 3′，同樣與隨機(jī)引物組對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一約600bp的PCR片段，將它克隆到pGEM-T質(zhì)粒上，進(jìn)行序列分析。
綜合這兩段序列的結(jié)果，得到完整的角蛋白酶的結(jié)構(gòu)編碼基因nphy(圖5)，此基因全長(zhǎng)1434個(gè)核苷酸，編碼477個(gè)氨基酸，根據(jù)信號(hào)肽序列的結(jié)構(gòu)規(guī)則推斷，N-端的25個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+25位的Gly之后，這一結(jié)果與成熟酶的N端氨基酸序列測(cè)定結(jié)果一致。此角蛋白酶的基因序列與目前唯一報(bào)道的角蛋白酶基因kerA(來(lái)源于Bacillus licheniformis PWD-1)的氨基酸序列無(wú)同源性，是一個(gè)新角蛋白酶基因。
序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所<120>一種高效、廣譜角蛋白酶及其基因<130>I2001258<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1434<212>DNA<213>Trichophyton<220><221>CDS<222>(1)..(1431)<223><220><221>sig_peptide<222>(1)..(75)<223><220><221>mat_peptide<222>(76)..()<223><400>1atg ggc tcg tac gcc ctt ccc aga tcc ggt atc cgc cgg aag atc cac 48Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Ile Arg Arg Lys Ile His-25 -20 -15 -10ggc ctg ctg ctg acg ctg gtc gtc ggc gtc ctc ggc acg gtc acc gca 96Gly Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Gly Val Leu Gly Thr Val Thr Ala-5 -1 1 5ctg gtg gcg ccg ccg acc gca cac gcc gcc gag agc acg ctc ggc gcc 144Leu Val Ala Pro Pro Thr Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala10 15 20gcg gcg gca cag agc ggc cgc tac ttc ggc acc gcc atc gcc tcg ggc 192Ala Ala Ala Gln Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly25 30 35aag ctg ggc gac tcg gcg tac acg acg atc gcg agc cgt gag ttc aac 240Lys Leu Gly Asp Ser Ala Tyr Thr Thr Ile Ala Ser Arg Glu Phe Asn40 45 50 55atg gtg acg gcc gag aac gag atg aag atc gac gcc acc gaa ccg cag 288Met Val Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gln60 65 70cgg ggc cag ttc aac ttc tcc gcc ggt gac cgc gtc tac aac tgg gcg 336Arg Gly Gln Phe Asn Phe Ser Ala Gly Asp Arg Val Tyr Asn Trp Ala75 80 85gtg cag aac ggc aag cag gtg cgc ggc cac acc ctg gcc tgg cac tcc 384Val Gln Asn Gly Lys Gln Val Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser90 95 100cag cag ccc ggc tgg atg cag agc ctc agc ggc agc aca ctg cgc cag 432Gln Gln Pro Gly Trp Met Gln Ser Leu Ser Gly Ser Thr Leu Arg Gln105 110 115gcg atg atc gac cac atc aac ggc gtg atg ggc cac tac aag ggc aag 480Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Val Met Gly His Tyr Lys Gly Lys120 125 130 135atc gcc cag tgg gac gtc gtg aac gag gcc ttc tcg gac gac ggt tcg 528Ile Ala Gln Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ser Asp Asp Gly Ser140 145 150ggc ggc cgc cgg gat tcc aac ctg cag cgc acc ggc aac gac tgg atc 576Gly Gly Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile155 160 165gag gtc gcc ttc cgc acc gcg cgc gcc gcc gac ccg gcg gcc aag ctc 624Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ala Ala Lys Leu170 175 180tgc tac aac gac tac aac atc gag aac tgg acc tgg gcg aag acc cag 672Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gln185 190 195ggc gtg tac aac atg gtc cgc gac ttc aag cag cgc ggc gtg ccg atc 720Gly Val Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val Pro Ile200 205 210 215gac tgc gtc ggc ttc cag tcg cac ttc aac agc ggc agc ccc tac aac 768Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn
220 225 230agc aac ttc cgc acc acc ctc cag aac ttc gcc gcc ctc ggc gtc gac 816Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gln Asn Phe Ala Ala Leu Gly Val Asp235 240 245gtg gcc atc acc gaa ctc gac atc cag ggc gcg tcg tcc tcg acc tac 864Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala Ser Ser Ser Thr Tyr250 255 260gcc gcc gtg acc aac gac tgc ctg gcc gtc tcg cgc tgc ctg ggc atc 912Ala Ala Val Thr Asn Asp Cys Leu Ala Val Ser Arg Cys Leu Gly Ile265 270 275acc gtc tgg ggc gtg cgc gac acc gac tcc tgg cga tcg ggg gac acg 960Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Thr Asp Ser Trp Arg Ser Gly Asp Thr280 285 290 295ccg ctg ctg ttc aac ggc gac ggc agc aag aag gct gcc tac acc gcc 1008Pro Leu Leu Phe Asn Gly Asp Gly Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Thr Ala300 305 310gtc ctc aac gca ctc aac ggc ggc tcc tcc acg ccg ccg cct tcg ggt 1056Val Leu Asn Ala Leu Asn Gly Gly Ser Ser Thr Pro Pro Pro Ser Gly315 320 325ggc gga cag atc aag ggc gtc ggt tcg ggc cgt tgc ctg gac gtg ccc 1104Gly Gly Gln Ile Lys Gly Val Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Val Pro330 335 340aac gcc agc acc acc gac ggc acc cag gtt cag ttg tac gac tgc cac 1152Asn Ala Ser Thr Thr Asp Gly Thr Gln Val Gln Leu Tyr Asp Cys His345 350 355agc gcc acc aac cag cag tgg acg tac acc gac gcc ggc gag ctc agg 1200Ser Ala Thr Asn Gln Gln Trp Thr Tyr Thr Asp Ala Gly Glu Leu Arg360 365 370 375gtc tac ggc gac aag tgc ctg gac gcc gcc ggc acc ggc aac ggc acc 1248Val Tyr Gly Asp Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Gly Asn Gly Thr380 385 390aag gtc cag atc tac age tgc tgg ggc ggc gac aac cag aag tgg cgc 1296Lys Val Gln Ile Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Asp Asn Gln Lys Trp Arg395 400 405ctc aac tcc gac gga tcc atc gtc ggc gtc cag tcg ggc ctc tgc ctc 1344Leu Asn Ser Asp Gly Ser Ile Val Gly Val Gln Ser Gly Leu Cys Leu410 415 420gac gcc gtc gga ggc gga acc gcc aac ggc acc ctg atc cag ctc tac 1392Asp Ala Val Gly Gly Gly Thr Ala Asn Gly Thr Leu Ile Gln Leu Tyr425 430 435tcc tgc tcc aac ggc agc aac cag cgc tgg acc cgc acc tga 1434Ser Cys Ser Asn Gly Ser Asn Gln Arg Trp Thr Arg Thr440 445 450<210>2<211>477<212>PRT<213>Trichophyton<400>2Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Ile Arg Arg Lys Ile His-25 -20 -15 -10Gly Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Gly Val Leu Gly Thr Val Thr Ala-5 -1 1 5Leu Val Ala Pro Pro Thr Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala10 15 20Ala Ala Ala Gln Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly25 30 35Lys Leu Gly Asp Ser Ala Tyr Thr Thr Ile Ala Ser Arg Glu Phe Asn40 45 50 55Met Val Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gln60 65 70Arg Gly Gln Phe Asn Phe Ser Ala Gly Asp Arg Val Tyr Asn Trp Ala75 80 85Val Gln Asn Gly Lys Gln Val Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser90 95 100Gln Gln Pro Gly Trp Met Gln Ser Leu Ser Gly Ser Thr Leu Arg Gln105 110 115Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Val Met Gly His Tyr Lys Gly Lys120 125 130 135Ile Ala Gln Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ser Asp Asp Gly Ser140 145 150Gly Gly Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile155 160 165Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ala Ala Lys Leu170 175 180Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gln185 190 195Gly Val Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val Pro Ile200 205 210 215Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn220 225 230Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gln Asn Phe Ala Ala Leu Gly Val Asp235 240 245Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala Ser Ser Ser Thr Tyr250 255 260Ala Ala Val Thr Asn Asp Cys Leu Ala Val Ser Arg Cys Leu Gly Ile265 270 275Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Thr Asp Ser Trp Arg Ser Gly Asp Thr280 285 290 295Pro Leu Leu Phe Asn Gly Asp Gly Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Thr Ala
300 305 310Val Leu Asn Ala Leu Asn Gly Gly Ser Ser Thr Pro Pro Pro Ser Gly315 320 325Gly Gly Gln Ile Lys Gly Val Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Val Pro330 335 340Asn Ala Ser Thr Thr Asp Gly Thr Gln Val Gln Leu Tyr Asp Cys His345 350 355Ser Ala Thr Asn Gln Gln Trp Thr Tyr Thr Asp Ala Gly Glu Leu Arg360 365 370 375Val Tyr Gly Asp Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Gly Asn Gly Thr380 385 390Lys Val Gln Ile Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Asp Asn Gln Lys Trp Arg395 400 405Leu Asn Ser Asp Gly Ser Ile Val Gly Val Gln Ser Gly Leu Cys Leu410 415 420Asp Ala Val Gly Gly Gly Thr Ala Asn Gly Thr Leu Ile Gln Leu Tyr425 430 435Ser Cys Ser Asn Gly Ser Asn Gln Arg Trp Thr Arg Thr440 445 450<210>3<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>3gttgaactca cggctcgc 18
權(quán)利要求
1.一種角蛋白酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的角蛋白酶的基因。
3.按照權(quán)利要求2所述的角蛋白酶的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種角蛋白酶及其編碼基因。此角蛋白酶比活性高、熱穩(wěn)定性好、作用pH范圍寬、同時(shí)對(duì)α－角蛋白和β－角蛋白均有高效降解作用。除了角蛋白酶活性外，還具有普通蛋白酶的特性，可降解動(dòng)植物來(lái)源的多種蛋白質(zhì)。做為一種新型的酶制劑，可廣泛應(yīng)用于飼料、食品、洗滌、毛紡、制藥、化妝品、皮革加工等行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N15/57GK1405305SQ0114181
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月19日
發(fā)明者姚斌, 王亞茹, 操時(shí)樹, 史秀云, 袁鐵崢, 范云六 申請(qǐng)人:姚斌, 范云六