專利名稱：測定多基因表達的信使核糖核酸特異性單一標記探針的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于基因分析的標記探針，特別是一種測定多基因表達的信使核糖核酸特異性單一標記探針及其制備方法。
此外，現(xiàn)有的多基因分析方法，大都采用離體反向轉錄成cDNA和PCR放大。而以胸腺嘧啶寡核甘酸作為引物的離體反向轉錄，其效率嚴格依賴于核糖核酸分子末端的Poly A結構。對那些已經部份降解和不含Poly A結構的核糖核酸分子，以及那些Poly A結構較短的核糖核酸分子，則是那些采用離體反向轉錄和PCR放大所無法分析的。這是所有間接多基因分析方法的一大致命缺陷。
本發(fā)明的技術方案是測定多基因表達的信使核糖核酸特異性單一標記探針，其特征在于探針分子具有下列化學通式R1-[X]n-R2；其中R1為含有可以檢測到的標記基團包括放射標記與非放射性標記基團；X為具有與鹼基A特異配對功能的胸腺嘧啶核甘酸殘基和尿嘧啶殘基的鹼基殘基，n代表該分子結構中胸腺嘧啶核甘酸殘基及與其他具有同樣雜交功能的核甘酸殘基的總數(shù)目和，為10至200間的任何自然數(shù)；R2為含有可以檢測到的標記基團包括放射標記與非放射性標記基團。
本發(fā)明標記胸腺嘧啶寡核甘酸探針分子可以采用化學法合成。合成所用底物預先標記。標記方法為放射標記或為非放射標記放射標記所用同位素以半衰期較長者為宜；非放射標記采用螢光標記，酶聯(lián)標記，和特定抗原標記，如鹼性磷酸酶，生物素，地高辛原等。
本發(fā)明標記胸腺嘧啶寡核甘酸探針分子還可以采用化學法合成。合成所用底物未預先標記，待合成后再進行末端標記。標記方法為放射標記或為非放射標記放射標記所用同位素以半衰期較長者為宜；非放射標記采用螢光標記，酶聯(lián)標記，和特定抗原標記，如鹼性磷酸酶，生物素，地高辛原等。
本發(fā)明標記胸腺嘧啶寡核甘酸探針分子也可以采用生物法合成。合成所用底物預先標記。標記方法為放射標記或為非放射標記放射標記所用同位素以半衰期較長者為宜；非放射標記采用螢光標記，酶聯(lián)標記，和特定抗原標記，如鹼性磷酸酶，生物素，地高辛原等。
在采用生物法合成中可以采用a)單向引物延伸反應先合成模板Poly A，該模板的三末端含有與單向引物互補的其他鹼基；或采用b)雙向引物延伸反應先合成模板Poly A，該模板的三末端和五末端分別含有與引物對互補的其他鹼基序列。
采用本發(fā)明進行基因分析時待定量樣本需預先與非標記的基因特異性探針進行第一次雜交，然后與標記的Poly T分子進行第二次雜交。當信號分離采用電泳時，這種雜交反應在液相中進行；當信號分離采用芯片技術時，雜交反應在固相液相交界面進行。
需要指出的是，當多基因分析的重點包括了部份3末端降解的核糖核酸分子或短尾及無尾的核糖核酸分子時，其與標記的胸腺嘧啶寡核甘酸分子進行第二次雜交前，必須進行尾端結構加尾反應或一體化的處理。加尾反應通過Poly A聚合酶進行；加尾之后即可與信使核糖核酸特異性多用途單一探針進行最后的雜交反應。
而一體化處理的目的則是使所有待測mRNA分子都帶有一個長度相等的Poly A尾。這一效果通過三種方式所達到即對超過設定長度的Poly A尾，予以切短；對不夠設定長度的Poly A尾，予以補齊；對缺乏Poly A尾的，予以加上設定長度的Poly A尾。這種設定長度的Poly A尾，由制備單鏈反義cDNA探針時的反義引物上特定限制性內切酶之前所附加帶有的常規(guī)的胸腺嘧啶寡核甘酸的長度決定。這一附加帶有的胸腺嘧啶寡核甘酸的長度通常在20-100鹼基之間，以不超過200個鹼基為上限。
待測標本中的mRNA先與帶胸腺嘧啶寡核甘酸結構的單鏈基因特異性探針雜交，然后進行mRNA尾的延長反應；這一反應與簡單的引物延伸反應相同。之后對雜交復合物進行單鏈酶處理，以使各種mRNA含有相同長度的Poly A尾。在第一次雜交和尾長度一體化之后，再與小分子的單一探測標記胸腺嘧啶寡核甘酸雜交，以形成標記胸腺嘧啶寡核甘酸與核糖核酸尾Poly A的復合體。
未與Poly A形成復合體的標記胸腺嘧啶寡核甘酸分子的分離，其必要性視所用方法決定。當應用電泳時，由于未形成復合體的標記胸腺嘧啶寡核甘酸分子的遷移速度遠大于由基因特異性探針/mRNA/單一標記胸腺嘧啶寡核甘酸等三種成分形成的殊結構，因而無須單獨的分離過程。當使用芯片技術時，未形成復合體的標記胸腺嘧啶寡核甘酸分子，以漂洗的方法進行分離。
對于同一樣本中不同種類的mRNA的比較的另一種更為直接的方法，是采用基因特異性探針3‘末端含有特定長度的Poly A附加定標成份。如這內在定標成份加在持家基因上，其長度可為標記探針分子長度的0.5倍，1倍，2倍。在定量分析時，該持家基因表達的實際多少，可由含有與不含有附加定標成份探針所顯示的標記量的比較，得出天然長度的Poly A持家基因與定長Poly A持家基因的信號強弱，達到準確定量的目的。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明利用mRNA分子中特有的多聚腺嘌呤(Poly A)尾端結構，以胸腺嘧啶寡核甘酸為中心進行化學改構而制造mRNA分子特異性的單一標記探針，解決多基因分析時因標記所造成的誤差。對于比較不同樣本中同一類別的mRNA較其他方法有許多明顯的優(yōu)勢，該方法簡便，可靠，重復性好，所得數(shù)據為其相對含量的直接比較。更為重要的是，對于同一樣本中不同種類的mRNA的比較，本技術通過對mRNA進行尾端結構的一體化處理，使現(xiàn)有多基因間接測定技術無法分析的短尾和無尾mRNA也能達到嚴格的一對一的數(shù)量關系。本發(fā)明的對天然mRNA測定時所具有的簡單，直接分析的特征，開創(chuàng)了多基因分析的新方向。
圖中mRNA在芯片上的位置或其在電泳時的位置，由其與特異探針的關系所確定。在這里，Poly T僅僅起到對不同mRNA分子進行數(shù)目的清點，或者說有多少“尾”mRNA。
圖2是具體應用舉例地高辛原標記Poly T用于脫氧核糖核酸的固相定量技術。
圖中1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12為不同濃度的脫氧核糖核酸點樣在尼龍膜上，然后通過加熱交聯(lián)，與生物素標記Poly T雜交，漂洗，然后與預先交聯(lián)鹼性磷酸酶結合，最后通過酶促化學反應的顯色原理，進行定量分析。其中1，2，3分別為20，2，0.2ng人胎盤肝臟脫氧核糖核酸；4，5，6分別為20，2，0.2ng人類胚胎腎臟脫氧核糖核酸；7，8，9分別為20，2，0.2ng人胎盤脫氧核糖核酸；10，11，12分別為20，2，0.2ng人胚胎腦脫氧核糖核酸。
以下為幾種測試過的標記胸腺嘧啶寡核甘酸探針分子1)5’R1-[X]n-R2其中R1為生物素；[X]為T殘基n＝39；R2為T；2)5’R1-[X]n-R2其中R1為生物素；[X]為T殘基n＝40；R2為生物素；3)5’R1-[X]n-R2其中R1為地高辛原；[X]為T殘基n＝29；R2為T；4)5’R1-[X]n-R2-其中R1為地高辛原；[X]為T殘基n＝29；R2為地高辛原；5)5’R1-[X]n-R2其中R1為GGGGGGTGGGGGGTTTT，[X]為第7位3H標記的T，n＝50；R2為GCGGCG；6)5’R1-[X]n-R2其中R1為GGGGGGTGGGGGGTTTT；[X]為T與U的混合物，其U/T為1/5，U為地高辛原-11-dUTP，n＝29；R2可為T(機會為5/6)也可為U(機會為1/6)；7)5’R1-[X]n-R2其中R1為GGGGGGTGGGGGGTTTT；[X]為32P標記的T與非標記的T以1∶10的比例隨機組合，n＝30；R2為GCGGCG。
權利要求
1一種測定多基因表達的信使核糖核酸特異性單一標記探針，其特征在于所說的探針分子具有下列化學通式R1-[X]n-R2；其中R1為含有可以檢測到的標記基團包括放射標記與非放射性標記基團；X為具有與鹼基A特異配對功能的胸腺嘧啶核甘酸殘基和尿嘧啶殘基的鹼基殘基，n代表該分子結構中胸腺嘧啶核甘酸殘基及與其他具有同樣雜交功能的核甘酸殘基的總數(shù)目和，為10至200間的任何自然數(shù)；R2為含有可以檢測到的標記基團包括放射標記與非放射性標記基團。
2按照權利要求1所述的標記探針，其特征在于X是沒有改構的天然胸腺嘧啶核甘酸殘基是放射標記。
3按照權利要求1所述的標記探針，其特征在于X是改構的具有放射標記的胸腺嘧啶核甘酸殘基。
4按照權利要求1所述的標記探針，其特征在于X是具有與胸腺嘧啶核甘酸殘基相同雜交功能的其他核甘酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明是一種測定多基因表達的信使核糖核酸特異性單一標記探針。其特征在于探針分子具有下列化學通式R1－[X]n－R2；其中R1、R2為含有可以檢測到的標記基團包括放射標記與非放射性標記基團；X為具有與鹼基A特異配對功能的胸腺嘧啶核甘酸殘基和尿嘧啶殘基的鹼基殘基，n代表該分子結構中胸腺嘧啶核甘酸殘基及與其他具有同樣雜交功能的核甘酸殘基的總數(shù)目和，為10至200間的任何自然數(shù)。本發(fā)明對于比較不同樣本中同一類別的mRNA較其他方法有許多明顯的優(yōu)勢，該方法簡便，可靠，重復性好，所得數(shù)據為其相對含量的直接比較，開創(chuàng)了多基因分析的新方向。
文檔編號C12Q1/68GK1430062SQ0113864
公開日2003年7月16日 申請日期2001年12月29日 優(yōu)先權日2001年12月29日
發(fā)明者李凱, 張佳, 張旭 申請人:張旭