專利名稱：表達多角體和幾丁質(zhì)酶融合蛋白的重組棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種能夠防治棉鈴蟲和煙青蟲的基因重組棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒；本發(fā)明還涉及該重組棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒株的制備方法。
本發(fā)明是按下述方案實現(xiàn)的利用PCR技術(shù)擴增病毒的多角體基因和幾丁質(zhì)酶基因(已申請專利，專利號01106469.2)克隆至通用載體pUC19，構(gòu)建融合基因；將融合基因插入含有egt基因上下游序列標記基因LacZ的真核轉(zhuǎn)移載體pHaWHL5，構(gòu)建真核轉(zhuǎn)移載體pHaWD6。將pHaWD6與野生型病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，通過同源重組用融合的多角體和幾丁質(zhì)酶基因置換基因組中的egt基因，構(gòu)建出缺失egt基因并表達多角體幾丁質(zhì)酶融合蛋白的新型重組病毒Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus WD6CCTCC-V200115。多角體與幾丁質(zhì)酶融合基因的核苷酸序列如下，核酸序列中起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)以黑體標明。兩基因在BamH I位點處融合，并以下劃線標明。ATGTATACTCGTTACAGTTACAGCCCTACTTTGGGCAAAACCTATGTGTACGACAACAAATACTTTAAGAATTTAGGTGCTGTTATTAAAATGCCAACGCAAGAGCATTTAGAGGAGCACGAACATGAAGAACGCAACTTGGATTCGCTCGACAAATACTTGGTGGCGGAAGATCCTTTTTTGGGACCTGGCAAAAATCAAAAACTAACTTTGTTTAAAGAGATTCGCAGCGTTAAGCCCGACACAATGAAGCTTGTAGTTAACTGGAGCGGTCGCGAATTTCTTCGCGAAACTTGGACGCGTTTCATGGAAGACAGTTTTCCCATTGTAAACGACCAAGAAATTATGGACGTGTTTCTGTCTGTTAATATGCGACCAACCAAACCGAACCGTTGTTACCGATTCTTAGCGCAACACGCTCTGCGTTGTGATCCCGACTATATTCCTCACGAAGTCATTCGTATTGTAGAACCTTCCTATGTAGGCAGTAACAACGAGTACAGAATTAGTTTAGCCAAAAAATACGGCGGTTGTCCCGTTATGAACTTGCACGCTGAATACACTAATTCCTTTGAAGATTTCATTACCAACGTAATTTGGGAGAACTTTTACAAACCAATTGTTTACGTAGGCACTGATTCTGCCGAAGAAGAGGAAATACTCCTAGAAGTTTCTTTGATATTTAAGATCAAAGAATTTGCACCTGACGCTCCGCTATACACTGGTCCTGCATATGGATCCGCTCCACCCGGCGTTCCCACATTAGACTGGGCCGATCACAGTTACGCTTTAGTGCAAATAAATCATCAAGCCACCGCTTACGAATCATTAGTAAACTCTCAACCGTTTGTAACTATCAAAGTATCATGGAGCGTATGGTCGGGCGAACAAGGCGAAATCGCTCAAGTGTATCTAGAAAATAAACTAGACTGCAAAGTAATCAACGTTTGGACTGGTCCGACGCAAGATCGTTTTGCTACTTTTGATTACAATACGAGCGGTCGTTATTCGATGTATGTAAAACTGTGCAATGCCGACGGCTGTTCGGCTAGTCAAACCGTAGAAGTCGTGATCGCAGACACCGATGGTAAACATTTAAAACCGTTACAATACACGTGGCAAGAAAACAATAAACCGTATACGTACAACACTGATCACACCGTAGCGGCCTATTTTGTCGAATGGGGCGTTTACGGTCGATCTTTTCCCGTGGACAAAGTGCCCACGCCGAACCTTTCGCACATTTTATACGGATTTATACCGATTTGCGGCGGTGACGGTATAAACGACAGTTTAAAATCTATCACGGGGAGTTTTGAAGCGTTGCAAAGATCGTGCGCTGGCAGGGACAATTTTAAAGTTTCCATACACGATCCGTGGGCGGCGCTCCAAAAACCACAAACAGGCGTTAGCGCATGGAACGAACCCTACAAAGGCAATTTTGGTCAATTAATGGCAGCAAAATTGGCCAATCCCAATCTAAAAGTGTTGGCATCAATCGGCGGTTGGACACTGTCCGATCCCTTCTATCATATGCACGATGCGCGAACGCGACAAATTTTTGTCGAATCCGTGCGTGAATTTGTGTTGACATGGAAATTTTTCGACGGCATCGATATTGATTGGGAATTTCCGGGCGGCAAAGGCGCCAATCCAAACGTTGGCGATGTGGAACGCGACAATAACACGTATATCGCTTTATTGGGCGAATTGCGCGCCATGCTCGATCAAGTTCAAATACAAACGAATCGTACTTTAGAACTCACCACAGCGATTAGCGCTGGCATAGACAAGATCGCCGCGGTTAATTACGACCGAGCACAACAGTATTTAGATAAAATTTTCGTGATGAGTTATGATTTCAAAGGAGCTTGGTCTAATACCGATCTCGGTCATCAGACGGCACTGTACGGTTCCGCGTGGAAACCTAACGAACCGTACACCGCCAACGTGGCCGTGGACGCTTTGCTCGCGCAACGAGTGAATCCAAAAAAACTCGTGTTGGGCGTAGCAATGTACGGCCGCGGTTGGACGGGCGTCCACAACTACAACAGTGACAATCCATTCAGTGGCGTAGCCGTCGGACCGATCACGGGTACATGGGAAAACGGCGTGGTCGACTACAGACAGATTGCTAAAAACATTTCGCGTTACGAATACGCATTCGACGACGTGGCCAAGGCTGCGTACGTATTCGACCGCGCCTCTGGCGACTTAATATCGTATGACAGCGAAAGATCGGTACTGGCCAAAGGCGAATACGTGCTTCAGCGTAGACTCGGCGGATTATTCGCATGGGAAATCGATGCGGACAACGGCGATTTGCTCAACGCTATGCATATTGGCTTGATGAAAACAGGTACAAACAGTAGATTGATTCATAACGAATTGTAA該融合基因編碼的氨基酸序列如下，氨基酸序列中G和S為兩基因融合處BamH I位點編碼的氨基酸。幾丁質(zhì)酶催化活性區(qū)(FDGIDIDWE)以下劃線標明。MYTRYSYSPTLGKTYVYDNKYFKNLGAVIKMPTQEHLEEHEHEERNLDSLDKYLVAEDPFLGPGKNQKLTLFKEIRSVKPDTMKLVVNWSGREFLRETWTRFMEDSFPIVNDQEIMDVFLSVNMRPTKPNRCYRFLAQHALRCDPDYIPHEVIRIVEPSYVGSNNEYRISLAKKYGGCPVMNLHAEYTNSFEDFITNVIWENFYKPIVYVGTDSAEEEEILLEVSLIFKIKEFAPDAPLYTGPAYGSAPPGVPTLDWADHSYALVQINHQATAYESLVNSQPFVTIKVSWSVWSGEQGEIAQVYLENKLDCKVINVWTGPTQDRFATFDYNTSGRYSMYVKLCNADGCSASQTVEVVIADTDGKHLKPLQYTWQENNKPYTYNTDHTVAAYFVEWGVYGRSFPVDKVPTPNLSHILYGFIPICGGDGINDSLKSITGSFEALQRSCAGRDNFKVSIHDPWAALQKPQTGVSAWNEPYKGNFGQLMAAKLANPNLKVLASIGGWTLSDPFYHMHDARTRGIFVESVREFVLTWKFFDGIDIDWEFPGGKGANPNVGDVERDNNTYIALLGELRAMLDQVQIQTNRTLELTTAISAGIDKIAAVNYDRAQQYLDKIFVMSYDFKGAWSNTDLGHQTALYGSAWKPNEPYTANVAVDALLAQRVNPKKLVLGVAMYGRGWTGVHNYNSDNPFSGVAVGPITGTWENGVVDYRQIAKNISRYEYAFDDVAKAAYVFDRASGDLISYDSERSVLAKGEYVLQRRLGGLFAWEIDADNGDLLNAMHIGLMKTGTNSRLI.
本發(fā)明所提提供的重組病毒及其構(gòu)建策略將為新型病毒殺蟲劑的研制奠定基礎(chǔ)。該重組病毒可在昆蟲食入多角體后第一時間發(fā)揮作用，解決了現(xiàn)有重組病毒殺蟲外源蛋白表達時間晚，起效慢的缺點。有效地提高了病毒感染中腸的效率，從而提高殺蟲速度。
該圖是重組病毒HaSNPV-WD6的構(gòu)建過程，說明如下載體pCXW99和pCXW125分別含有完整的HaSNPV多角體基因和幾丁質(zhì)酶基因。中間載體pUC19-fusion含有多角體和幾丁質(zhì)酶融合基因。中間載體pHaWHL5含有egt基因的5’端及基因的上游序列(即egt3’)、3’端及基因的下游序列(即egt5’)、HaSNPV多角體蛋白基因啟動子HaPph，以及標記基因LacZ，即β-半乳糖苷酶基因。轉(zhuǎn)移載體pHaWD6為插入融合基因的pHaWHL5。egt為蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
上述的幾丁質(zhì)酶基因還可以由其它有相同效果的基因如桿狀病毒的組織蛋白酶基因v-cath、gp37基因、昆蟲痘病毒的紡錘體蛋白基因fusolin、蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白(IAP)基因等替換。融合基因的插入位點可以在egt位點，也可在病毒基因組中的其它位點。標記基因還可以用綠色熒光蛋白GFP基因等替換，也可以在重組病毒構(gòu)建好后刪除標記基因。
2、所述本發(fā)明的棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒HaSNPV-WD6的構(gòu)建方法，含以下步驟(1)設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)從pCXW99和pCXW125分別獲得HaSNPV完整的多角體基因編碼框和除去了編碼N端信號肽和C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位肽部分的幾丁質(zhì)酶基因編碼框。多角體基因片斷以EcoR I和BamH I酶切，幾丁質(zhì)酶基因片斷以BamH I和Pst I酶切；將兩個基因片斷克隆至通用載體pUC19，使兩個基因片斷融合為一個開放閱讀框，得到中間載體pUC19-fusion。利用EcoR I和Pst I酶切pUC19-fusion，獲得雙粘端的融合基因片斷。將融合基因片斷平端化處理后克隆至載體pWHL5的多角體啟動子下游，獲得真核轉(zhuǎn)移載體pWD6。
(2)將野生型HaSNPV基因組DNA和pWD6共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，利用同源重組技術(shù)，缺失基因組上的蛻皮激素尿昔二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)酶基因，并在缺失的位置插入融合基因。經(jīng)多輪空斑純化，得到純的雙重重組病毒HaSNPV-WD6。
權(quán)利要求
1.一種表達多角體和幾丁質(zhì)酶融合蛋白的重組棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒，Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus WD6，CCTCC No.V200115，在缺失蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因位點處，插入由病毒多角體蛋白基因啟動子啟動的多角體和幾丁質(zhì)酶融合基因，以及由熱休克蛋白基因啟動子控制的標記基因β-半乳糖苷酶基因。
2.一種實施權(quán)利要求1所述的表達多角體和幾丁質(zhì)酶融合蛋白的重組棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒的制備方法，包括以下步驟(1)設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)獲得HaSNPV多角體基因編碼框和幾丁質(zhì)酶基因編碼框除去了編碼N端信號肽和C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位肽的，多角體基因片斷以EcoR I和BamH I酶切，幾丁質(zhì)酶基因片斷以BamH I和Pst I酶切；將兩個基因片斷克隆至通用載體pUC19，使兩個基因片斷融合為一個開放閱讀框，得到中間載體；利用EcoRI和PstI酶切中間載體，獲得雙粘端的融合基因片斷；將融合基因片斷平端化處理后克隆至載體pWHL5的多角體啟動子下游，獲得真核轉(zhuǎn)移載體pWD6；(2)將野生型HaSNPV基因組DNA和pWD6共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，利用同源重組技術(shù)，缺失基因組上的蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并在缺失的位置插入融合基因，經(jīng)多輪空斑純化，得到純的雙重重組病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達多角體和幾丁質(zhì)酶融合蛋白的重組棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒及其制備方法利用PCR技術(shù)擴增HaSNPV多角體基因和幾丁質(zhì)酶基因，克隆至載體pUC19構(gòu)建融合基因；將融合基因插入真核載體pHaWHL5，獲得真核轉(zhuǎn)移載體pHaWD6。該轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，通過同源重組將融合基因插入病毒基因組，并缺失egt基因。構(gòu)建出重組病毒HaSNPV－WD6。融合表達的幾丁質(zhì)酶被包埋于多角體中。該重組病毒可在昆蟲食入病毒多角體后第一時間發(fā)揮作用。
文檔編號C12N15/62GK1429902SQ0113837
公開日2003年7月16日 申請日期2001年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月30日
發(fā)明者吳東, 陳新文, 胡志紅 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所