專利名稱：抗人血紅蛋白單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于潛血檢測的抗人血紅蛋白單克隆抗體。
背景技術(shù)：
糞便潛血試驗是消化道出血和腫瘤的主要診斷指標(biāo)。目前臨床上，糞便潛血試驗常用的一類過篩試驗方法，是利用血液的主要成份血紅蛋白(Hb)中的亞鐵血紅素，具有類似過氧化物酶作用而設(shè)計的簡易化學(xué)檢查法。這類方法的氧化顯色劑較多，如聯(lián)苯胺、鄰-甲苯胺、鄰聯(lián)甲苯胺、愈創(chuàng)木、還原酚酞、氨基吡啉、無色孔雀綠、四甲基聯(lián)苯胺、二苯胺、二甲基聯(lián)苯胺等；因而方法眾多。上述方法雖然簡便易行，但特異性較低、干擾因素較多。動物血、肉、肝臟及富含葉綠素食物、鐵劑、維生素C、中藥等均可引起假陽性。
為便于精確檢測潛血，避免假陽性、特異性差的特點，生產(chǎn)高特異性的的抗人血單克隆抗體具有很強的實用價值。
本發(fā)明的公開本發(fā)明的主要目的是為了提供一種特異性高的抗人血紅蛋白單克隆抗體。
本發(fā)明的次要目的是為了提供一種產(chǎn)生特異性高的抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系及其制備方法。
本發(fā)明的主要目的可通過如下措施來實現(xiàn)一種抗人血紅蛋白單克隆抗體。
本發(fā)明的次要目的還可通過如下措施來實現(xiàn)一種產(chǎn)生抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
一種制備產(chǎn)生抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法包括下述步驟(1)制備免疫脾細胞；取純化人血紅蛋白(Hb)與等量佐劑充分混勻，分別注入小鼠頸背部兩側(cè)、腹股溝部皮下；每只每次劑量為20-80μg，間隔2-4周，同法重復(fù)注入至少1次；第一次免疫用弗氏完全佐劑、第二次改用弗氏不完全佐劑、第三次不用佐劑；最后一次免疫后兩周，測小鼠血清中抗人血紅蛋白抗體滴度，將顯示有足夠高抗體滴度的小鼠作為免疫脾細胞的來源。
測定抗體滴度的方法，可用放射免疫測定RIA或酶聯(lián)免疫吸附ELISA測定法等；在本發(fā)明中通常采用ELISA法。
(2)制備骨髓瘤細胞；骨髓瘤細胞通常使用從小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0細胞系；在進行細胞融合前，將其在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-4天，以便在融合時可以得到2×107或更多的融合細胞。本發(fā)明通常選用SP2/0骨髓瘤細胞。
(3)細胞融合；將20-80μg的純化人血紅蛋白向已按步驟(1)的方式免疫接種的小鼠腹腔或靜脈接種免疫，并且在3-4天后去小鼠的脾臟獲得脾細胞；分散脾細胞，然后按體積比1∶30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吸打數(shù)次，再將脾細胞離心去上清液得脾細胞沉淀物。將上述(2)中培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0離心去上清液得骨髓瘤細胞沉淀。用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細胞沉淀和骨髓瘤細胞沉淀，并將脾細胞與骨髓瘤細胞按數(shù)量比(5-10)∶1混合兩種細胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比1∶2加入濃度為50％的聚乙二醇PEG，再靜置1-2分鐘后離心去上清液，并緩慢加入沉淀物體積的25-35倍的HAT培養(yǎng)液(在常規(guī)培養(yǎng)液中含有次黃嘌呤(10-6至10-3M)，氨基喋呤(10-8至10-7M)與胸苷(10-6至10-4M))懸浮融合細胞，最后補加HAT液至沉淀物體積的140-160倍；再將融合細胞按100μl/孔的加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100μlHAT液小鼠腹水細胞(約1-2×105M/孔)作為飼養(yǎng)細胞。將上述培養(yǎng)孔置于濃度為3-7％的二氧化碳培養(yǎng)箱中，在溫度為35-38℃條件下培養(yǎng)10-14小時，從第3天開始，每隔2-3天用每孔半量HAT液換液一次。
當(dāng)觀察培養(yǎng)孔中出現(xiàn)雜交細胞集落時，再在每孔加半量HA培養(yǎng)液，取培養(yǎng)上清液，用ELISA測抗人血紅蛋白抗體及抗體滴度。
將上述抗人血紅蛋白抗體陽性、滴度高的雜交瘤轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進行克隆?？梢酝ㄟ^一種經(jīng)有限稀釋該雜交瘤使一孔中只含有一個單一雜交瘤細胞的方法?；蛞环N從軟瓊脂培養(yǎng)基中分離集落的軟瓊脂方法?；蛞环N采用顯微操作器，挑取單一雜交瘤細胞的方法?；蛞环N采用細胞分選儀分離單一的雜交瘤細胞的“分選儀克隆”方法。本發(fā)明優(yōu)選簡單或易于操作的有限稀釋方法來進行克隆?？寺∵^程中采用1640培養(yǎng)液，并用ELISA檢測克隆細胞孔上清培養(yǎng)液中抗體及滴度。對抗體陽性、滴度高的孔繼續(xù)進行克隆3-4次，直至再次克隆時，所有克隆孔均呈抗體陽性，篩選具有一個穩(wěn)定抗體滴度的克隆作為產(chǎn)生抗人Hb抗體的雜交瘤細胞系。
(4)制備單克隆抗體；用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述(3)中得的雜交瘤。大量生產(chǎn)單克隆抗體，可采用大瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法?；蛲敌∈篌w內(nèi)誘生法。其中大瓶培養(yǎng)法可通過培養(yǎng)上述(3)雜交瘤純化得到抗人將上述(3)Hb單克隆抗體。同系鼠(本發(fā)明用Balb/c小鼠)體內(nèi)誘生法可通過將上述(3)得到的產(chǎn)生抗人Hb抗體的雜交瘤細胞(5×105-106)注入經(jīng)降植烷處理的雌性小鼠(4至8周齡)腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成份，其上清液即含有抗人Hb單克隆抗體。如果需要進一步純化，可采用硫酸銨沉淀和凝膠層析方法純化。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點本發(fā)明的抗人血蛋白單克隆抗體具有高度特異性。
本發(fā)明的實施方式本發(fā)明還將結(jié)合實施例作進一步詳述一種抗人血紅蛋白單克隆抗體。
一種產(chǎn)生抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
一種制備產(chǎn)生抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法包括下述步驟(1)制備免疫脾細胞取純化人血紅蛋白(Hb)與等量佐劑充分混勻，分別注入小鼠頸背部兩側(cè)、腹股溝部皮下；每只每次劑量為20-80μg，間隔2-4周，同法重復(fù)注入至少1次第一次免疫用弗氏完全佐劑、第二次改用弗氏不完全佐劑、第三次不用佐劑；最后一次免疫后兩周，測小鼠血清中抗人血紅蛋白抗體滴度，將顯示有足夠高抗體滴度的小鼠作為免疫脾細胞的來源。
測定抗體滴度的方法，可用放射免疫測定RIA或酶聯(lián)免疫吸附ELISA測定法等；在本發(fā)明中通常采用ELISA法。
(2)制備骨髓瘤細胞；骨髓瘤細胞通常使用從小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0細胞系；在進行細胞融合前，將其在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-4天，以便在融合時可以得到2×107或更多的融合細胞。本發(fā)明通常選用SP2/0骨髓瘤細胞。
(3)細胞融合；將60μg的純化人血紅蛋白向已按步驟(1)的方式免疫接種的小鼠腹腔或靜脈接種免疫，并且在3-4天后去小鼠的脾臟獲得脾細胞；分散脾細胞，然后按體積比1∶30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吸打數(shù)次，再將脾細胞離心去上清液得脾細胞沉淀物。將上述(2)中培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0離心去上清液得骨髓瘤細胞沉淀。用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細胞沉淀和骨髓瘤細胞沉淀，并將脾細胞與骨髓瘤細胞按數(shù)量比8∶1混合兩種細胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比1∶2加入濃度為50％的聚乙二醇PEG，再靜置1-2分鐘后離心去上清液，并緩慢加入沉淀物體積的30倍的HAT培養(yǎng)液(在常規(guī)培養(yǎng)液中含有次黃嘌呤(10-6至10-3M)，氨基喋呤(10-8至10-7M)與胸苷(10-6至10-4M))懸浮融合細胞，最后補加HAT液至沉淀物體積的150倍；再將融合細胞按100ml/孔的加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100mlHAT液小鼠腹水細胞(約1×105M/孔)作為飼養(yǎng)細胞。將上述培養(yǎng)孔置于濃度為6％的二氧化碳培養(yǎng)箱中，在溫度為35-38℃條件下培養(yǎng)12小時，從第3天開始，每隔2-3天用每孔半量HAT液換液一次。
當(dāng)觀察培養(yǎng)孔中出現(xiàn)雜交細胞集落時，再在每孔加半量HA培養(yǎng)液，取培養(yǎng)上清液，用ELISA測抗人血紅蛋白抗體及抗體滴度。
將上述抗人血紅蛋白抗體陽性、滴度高的雜交瘤轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進行克隆。可以通過一種經(jīng)有限稀釋該雜交瘤使一孔中只含有一個單一雜交瘤細胞的方法?；蛞环N從軟瓊脂培養(yǎng)基中分離集落的軟瓊脂方法?；蛞环N采用顯微操作器，挑取單一雜交瘤細胞的方法?；蛞环N采用細胞分選儀分離單一的雜交瘤細胞的“分選儀克隆”方法。本發(fā)明優(yōu)選簡單或易于操作的有限稀釋方法來進行克隆?？寺∵^程中采用1640培養(yǎng)液，并用ELISA檢測克隆細胞孔上清培養(yǎng)液中抗體及滴度。對抗體陽性、滴度高的孔繼續(xù)進行克隆3-4次，直至再次克隆時，所有克隆孔均呈抗體陽性，篩選具有一個穩(wěn)定抗體滴度的克隆作為產(chǎn)生抗人Hb抗體的雜交瘤細胞系。
(4)制備單克隆抗體；用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述(3)中得的雜交瘤。大量生產(chǎn)單克隆抗體，可采用大瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法。或同系小鼠體內(nèi)誘生法。其中大瓶培養(yǎng)法可通過培養(yǎng)上述(3)雜交瘤純化得到抗人將上述(3)Hb單克隆抗體。同系鼠(本發(fā)明用Balb/c小鼠)體內(nèi)誘生法可通過將上述(3)得到的產(chǎn)生抗人Hb抗體的雜交瘤細胞(5×105-106)注入經(jīng)降值烷處理的雌性小鼠(4至8周齡)腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成份，其上清液即含有抗人Hb單克隆抗體。如果需要進一步純化，可采用硫酸銨沉淀和凝膠層析方法純化。
權(quán)利要求
1.一種抗人血紅蛋白單克隆抗體。
2.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
3.一種制備權(quán)利要求2所述的雜交瘤細胞系的方法，其特征在于采用常規(guī)技術(shù)將源自于已用純化抗人血紅蛋白免疫接種的鼠的脾臟細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，選擇產(chǎn)生所需抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗人血紅蛋白單克隆抗體，其特異性高，制備方法簡便。
文檔編號C12P21/08GK1428353SQ01138108
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月25日
發(fā)明者李克生, 杜惠芬, 施岺, 何曉東, 王永昌, 王蘭, 劉元強 申請人:甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院