專利名稱：預(yù)防腹瀉病原菌的乳桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳桿菌屬的新微生物，它們可用于預(yù)防病原菌引起的腹瀉。具體而言，本發(fā)明涉及使用該微生物制備可攝食的支持物和含有該支持物的組合物。
產(chǎn)生乳酸作為主要代謝成分的生物早已為人所知。這些細(xì)菌分別可見于牛奶和牛奶加工廠、活的或腐爛的植物，也存在于人和動(dòng)物的腸道中。這些微生物統(tǒng)稱為“乳酸細(xì)菌”，它們代表了非同質(zhì)性的組群，包括例如乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬，片球菌屬等。
乳酸細(xì)菌已被用作保存食物的發(fā)酵劑，這利用了其低pH和在發(fā)酵活動(dòng)中產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物的作用來抑制腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)。為此，乳酸細(xì)菌已被用來制備多種不同的食品，如乳酪、酸奶和其他牛奶發(fā)酵制品。
最近，乳酸細(xì)菌引起廣泛關(guān)注是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)某些菌株在攝入后對(duì)人和動(dòng)物具有有利作用。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬或雙歧桿菌屬的特定菌株能夠在腸粘膜上定居，幫助維持人和動(dòng)物的健康。
在這方面，EP 0 768 375公開了雙歧桿菌屬的特定菌株，它們可以植入腸道菌群，也可以附著腸細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，這些雙歧桿菌幫助免疫調(diào)節(jié)，能夠競(jìng)爭(zhēng)性排斥病原菌對(duì)腸道細(xì)胞的附著，從而有助于維持個(gè)體健康。
最近幾年，研究集中在乳酸細(xì)菌作為益生劑(probiotic agent)的潛在用途。益生菌是活的微生物制品，它通過保存腸道內(nèi)的天然菌群促進(jìn)個(gè)體健康。只要微生物制品的有效微生物和其作用方式是已知的，該微生物制品通常被認(rèn)為是益生菌。人們認(rèn)為，益生菌附著在腸道粘膜上，定居在腸道內(nèi)，同樣防止有害微生物附著于腸粘膜上。其作用的一個(gè)重要前提是它們必須以合適和活的形式到達(dá)腸道粘膜，而不會(huì)在胃腸道前部被破壞，特別是在胃中低pH的影響下。
在這方面，WO 97/00078公開了一種稱為乳桿菌GG(ATCC 53103)的特異菌株，它是益生菌。該微生物特別是用在防止或治療食物引起的過敏反應(yīng)的方法中，它與已經(jīng)用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶水解處理過的食物一起給予服用者。選用的乳桿菌菌株據(jù)稱具有附著和定居特性，具有蛋白酶系統(tǒng)，因此，食物中含有的蛋白質(zhì)被該特異性乳桿菌菌株分泌的蛋白酶進(jìn)一步降解。該文獻(xiàn)中討論的方法最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)原料被腸道吸收，不再有明顯的過敏物質(zhì)。
并且，EP 0 577 903提及使用具有取代幽門螺桿菌能力的乳酸菌制備用于治療或預(yù)防由幽門螺桿菌引起的潰瘍的支持物，幽門螺桿菌被認(rèn)為是導(dǎo)致潰瘍的病因。
了解到乳酸菌的某些菌株可能提供的有利特性，本領(lǐng)域希望獲得其他對(duì)人和/或動(dòng)物的健康有益的乳酸菌。
因此，本發(fā)明意欲提供對(duì)人和/或動(dòng)物具有新的有益特性的細(xì)菌菌株。
通過提供新的微生物，即屬于乳桿菌屬具有防止腹瀉病原菌定居于腸道能力的乳酸細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，乳桿菌菌株可以附著在哺乳動(dòng)物腸粘膜上，可以在0.4％的膽汁鹽存在時(shí)生長(zhǎng)。
然而，根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，乳酸菌選自鼠李糖乳桿菌或類干酪乳桿菌，優(yōu)選類干酪乳桿菌，更優(yōu)選類干酪乳桿菌CNCM I-2116。
已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明的微生物尤其顯示下列特性它們是革蘭氏陽性，觸酶陰性，NH3形成精氨酸陰性，二氧化碳產(chǎn)生陰性，它們產(chǎn)生L(+)乳酸，能夠在膽汁鹽濃度達(dá)約0.4％時(shí)生長(zhǎng)，可以基本上防止導(dǎo)致腹瀉的細(xì)菌定居于腸道細(xì)胞，導(dǎo)致腹瀉的細(xì)菌如致腸病大腸桿菌等病原性大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏菌等沙門氏菌。
新微生物可以用來制備多種可攝食的支持物材料，如牛奶、酸奶、凝乳、發(fā)酵牛奶、牛奶基發(fā)酵產(chǎn)品、發(fā)酵谷物基產(chǎn)品、牛奶基粉末、嬰兒配方食品，在支持物中的含量可以為約105cfu/g到約1011cfu/g。在本發(fā)明中，cfu代表菌落形成單位，其定義是通過在瓊脂平板上的微生物計(jì)數(shù)獲得的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量。
本發(fā)明也提供含有至少一種具有上述特性的乳桿菌菌株和/或含有微生物已在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物上清或其一個(gè)級(jí)分的食品或藥物組合物。
為了制備本發(fā)明的食品組合物，至少一種本發(fā)明的乳桿菌菌株被包含在合適的支持物中，含量為約105cfu/g到約1011cfu/g，優(yōu)選約106cfu/g到約1010cfu/g，更優(yōu)選約107cfu/g到約109cfu/g。
在制備藥物時(shí)，產(chǎn)品可以制備成丸劑、液體細(xì)菌懸液、干的口服補(bǔ)劑、濕的口服補(bǔ)劑、干的管飼產(chǎn)品或濕的管飼產(chǎn)品，加入的乳桿菌菌株的量為約1012cfu/g，優(yōu)選約107cfu/g到約1011cfu/g，更優(yōu)選約107cfu/g到約1010cfu/g。
新微生物在個(gè)體腸道中的活性通常是劑量依賴的。即，通過攝入上述食品原料或藥物組合物導(dǎo)入的新微生物越多，微生物的保護(hù)和/或治療活性越高。因?yàn)樾挛⑸飳?duì)人和動(dòng)物沒有害處，已從嬰兒的糞便中分離出了該微生物，可以大量導(dǎo)入該微生物，使得個(gè)體腸道的大部分都被該新微生物定居。
但是，根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的乳桿菌培養(yǎng)物上清可以用來制備一種上述可攝入支持物。上清可以原樣使用，或者在不會(huì)破壞微生物分泌到液體培養(yǎng)基中的代謝化合物的條件下干燥，如凍干，可以包含在載體中。為了減少上清中未知化合物的數(shù)量，乳桿菌菌株優(yōu)選生長(zhǎng)在成分明確且不會(huì)對(duì)生長(zhǎng)的宿主有不利影響的培養(yǎng)基中。并且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其一般知識(shí)，可以排除上清中的不想要的產(chǎn)物，如通過層析。


圖1顯示細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果，其中培養(yǎng)的ST11細(xì)胞用于抑制病原性大腸桿菌對(duì)上皮細(xì)胞的附著的試驗(yàn)中。
圖2顯示細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果，其中ST11培養(yǎng)物上清用于抑制病原性大腸桿菌對(duì)上皮細(xì)胞的附著的試驗(yàn)中。
圖3顯示細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果，其中培養(yǎng)的ST11細(xì)胞用于抑制鼠傷寒沙門氏菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲的試驗(yàn)中。
圖4顯示細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果，其中ST11培養(yǎng)物上清用于抑制鼠傷寒沙門氏菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲的試驗(yàn)中。
圖5顯示乳酪乳桿菌菌株CNCM I-2116(ST11)在不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的酸化。
圖6顯示乳酪乳桿菌菌株ST11在10°測(cè)定的30天存活率。
圖7顯示源自骨髓的小鼠附著細(xì)胞與系列稀釋的ST11溫育后，其中的IL-12和IL-10mRNA圖譜。
圖8顯示由于IL-4的產(chǎn)生減少導(dǎo)致的Th2分化的結(jié)果。
在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的廣泛研究過程中，發(fā)明人研究了嬰兒糞便，從其中分離了多種不同細(xì)菌菌株。隨后考察了這些菌株防止已知會(huì)引起腹瀉的細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的定居的能力。
篩選了包括乳桿菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬的幾個(gè)細(xì)菌屬的腹瀉抑制特性。抑制試驗(yàn)基本上以病原性大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌作為在個(gè)體中引起腹瀉的病原微生物的代表來進(jìn)行。
多種乳酸菌在合適的培養(yǎng)基如MRS、Hugo-Jago或M17培養(yǎng)基中在約30到40℃的溫度(相應(yīng)于其最佳生長(zhǎng)溫度)下生長(zhǎng)。達(dá)到靜止生長(zhǎng)后，離心收集細(xì)菌，重懸于生理鹽水溶液。不同試驗(yàn)之間，細(xì)菌細(xì)胞冰凍保存(-20℃)。
為了評(píng)價(jià)抗細(xì)菌特性，選擇了下列方法。
一種方法是，分別考察本發(fā)明培養(yǎng)的乳桿菌屬菌株防止引起腹瀉的病原菌附著于腸道細(xì)胞或侵入腸道細(xì)胞。為此，腸道細(xì)胞與病原菌和本發(fā)明培養(yǎng)的乳桿菌屬菌株接觸，分別評(píng)價(jià)附著率或侵入率。
第二種方法是，本發(fā)明的乳桿菌屬菌株的細(xì)胞培養(yǎng)物上清與病原微生物一起加入腸道細(xì)胞，分別評(píng)價(jià)附著率或侵入率。
因此，結(jié)果顯示培養(yǎng)的乳桿菌和上清對(duì)防止對(duì)腸道細(xì)胞的附著和侵入都極其有效，這表明新微生物分泌的代謝化合物可能與抗腹瀉活性有關(guān)。
除了上述發(fā)現(xiàn)，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株出人意料地也表現(xiàn)出抗過敏特性，所述菌株對(duì)不同免疫介體的合成有影響。
通常認(rèn)為，體液免疫應(yīng)答和過敏反應(yīng)是由具有2型表型(Th2)的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的。Th2細(xì)胞的特征在于產(chǎn)生高水平白介素4(IL-4)，這種細(xì)胞因子對(duì)IgE的分泌是必需的，而IgE是參與過敏反應(yīng)的主要抗體類別。
Th2細(xì)胞的分化為IFN-γ抑制，后者是由互斥的Th1亞類CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的。所述Th1細(xì)胞又受白介素12(IL-12)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。與此相對(duì)，另一種細(xì)胞因子IL-10已被證實(shí)對(duì)Th1細(xì)胞的增殖具有強(qiáng)烈的抑制作用，因此被認(rèn)為在免疫抑制機(jī)制中發(fā)揮作用。
總之，IL-12和IL-10通過影響Th1亞類的發(fā)育都對(duì)CD4+T細(xì)胞的發(fā)育具有強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)作用。IL-12是誘導(dǎo)Th1分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，從而抑制Th2應(yīng)答的產(chǎn)生。因此，抑制Th2細(xì)胞的主要途徑見于輔助細(xì)胞對(duì)IL-12合成的刺激。
眾所周知，革蘭氏陰性細(xì)菌的某些成分如LPS在附著細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中誘導(dǎo)高水平IL-12。因此，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細(xì)菌可以強(qiáng)烈促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1表型的分化。
微生物ST11作為本發(fā)明乳桿菌屬菌株的實(shí)例，已經(jīng)測(cè)試了其在誘導(dǎo)參與調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化的細(xì)胞因子中的可能作用。具體而言，已經(jīng)研究了ST11對(duì)經(jīng)歷Th2分化的CD4+T細(xì)胞表型的作用。
為此，ST11誘導(dǎo)源自骨髓的小鼠附著細(xì)胞中編碼這兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的mRNA合成的能力與其他四株乳桿菌菌株和革蘭氏陰性細(xì)菌對(duì)照(大腸桿菌K12)進(jìn)行了比較。細(xì)胞與107到109cfu/ml系列稀釋的細(xì)菌溫育6小時(shí)后，通過半定量RT-PCR測(cè)定mRNA。
盡管所有乳桿菌菌株都可以誘導(dǎo)IL-12mRNA一定程度的轉(zhuǎn)錄，但ST11是最強(qiáng)的誘導(dǎo)者，因?yàn)椋词乖谧畹图?xì)菌劑量下，也可檢測(cè)到強(qiáng)PCR信號(hào)。實(shí)際上，ST11誘導(dǎo)IL-12mRNA轉(zhuǎn)錄的能力同大腸桿菌一樣強(qiáng)。IL-10mRNA的誘導(dǎo)一般弱于IL-12mRNA，只有在較高的細(xì)菌劑量下才可檢測(cè)到信號(hào)。但是，與其他乳桿菌菌株和大腸桿菌對(duì)照相比，ST11仍是IL-10的最強(qiáng)誘導(dǎo)者。
因此，ST11被認(rèn)為可以有效地誘導(dǎo)參與CD4+T細(xì)胞分化的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。其誘導(dǎo)IL-12的能力強(qiáng)使其成為抑制Th2應(yīng)答的候選者，其明顯的IL-10誘導(dǎo)能力防止了炎癥應(yīng)答。
除了上述發(fā)現(xiàn)之外，也確定了ST11是否對(duì)經(jīng)歷Th2分化的CD4+T細(xì)胞具有抑制作用，對(duì)Th1功能具有正效應(yīng)。使用了成熟的細(xì)胞分化培養(yǎng)系統(tǒng)，其中前體CD4+T細(xì)胞經(jīng)多克隆活化和調(diào)節(jié)經(jīng)歷Th1或Th2分化，具體取決于在培養(yǎng)基中提供的共刺激因素的類型。Th1/Th2分化在7天的原代培養(yǎng)期間誘導(dǎo)，然后細(xì)胞在僅含培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)中再刺激2天，通過測(cè)定上清中產(chǎn)生的細(xì)胞因子類型(IFN-γvs.IL-4)評(píng)價(jià)特異表型(Th1或Th2)。
眾所周知，源自BALB/c背景的小鼠的前體CD4+T細(xì)胞在中性條件(第一代培養(yǎng)物中只有培養(yǎng)基)下激活后優(yōu)先向優(yōu)勢(shì)Th2表型分化(在第二代培養(yǎng)上清中IL-4高IFN-γ低)。這種表型在第一代培養(yǎng)物中加入針對(duì)IL-4的封閉單克隆抗體后可以完全逆轉(zhuǎn)到Th1表型(高IFN-γ低IL-4)。
為了研究ST11對(duì)Th2抑制的可能作用，來自BALB/c小鼠的純化前體CD4+T細(xì)胞在第一代培養(yǎng)時(shí)在存在骨髓附著細(xì)胞作為輔助細(xì)胞的情況下激活。這些細(xì)胞在僅有培養(yǎng)基時(shí)或在存在1mg/ml LPS或108cfu/ml ST11或108cfu/ml其他乳桿菌時(shí)共培養(yǎng)。此時(shí)，洗滌細(xì)胞，再次純化CD4+T，在僅有培養(yǎng)基的第二代培養(yǎng)中再刺激。
分化CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在2天后測(cè)定。不出所料，在僅有培養(yǎng)基存在時(shí)分化的細(xì)胞顯示主要是Th2表型。加入ST11至第一代培養(yǎng)中強(qiáng)烈地調(diào)節(jié)Th2分化的結(jié)果，因?yàn)樗鼘?dǎo)致IL-4的產(chǎn)生減少了8倍。抑制的幅度類似于在存在LPS時(shí)分化的細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的結(jié)果。與此相對(duì)，其他乳桿菌菌株對(duì)IL-4水平?jīng)]有明顯可見的作用。有趣的是，IFN-γ水平在第一代培養(yǎng)中加入ST11時(shí)沒有增加。
總之，ST11特異性阻止經(jīng)歷Th2分化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，但并不顯著增加IFN-γ的分泌。ST11不增加IFN-γ產(chǎn)生可能是由于其誘導(dǎo)IL-10的能力，因此盡管其具有抗Th2活性，但它保持了低炎癥效應(yīng)。
因此，結(jié)果顯示，ST11是一種具有良好抗Th2譜的乳桿菌菌株，這使其成為具有抗過敏的益生活性的細(xì)菌的優(yōu)秀候選者。
以下通過實(shí)施例介紹本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。
培養(yǎng)基和溶液MRS(Difco)Hugo-Jago(胰胨30g/l(Difco)，酵母提取物10g/l(Difco)，乳糖5g/l(Difco)，磷酸二氫鉀6g/l，牛肉提取物2g/l(Difco)，瓊脂2g/l(Difco))M17(Difco)DMEM(Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基)CFA(Ghost et al，臨床微生物學(xué)雜志，1993 31 2163-6)Muller Hinton瓊脂(Oxoid)LB(Luria Bertami，Maniatis，實(shí)驗(yàn)室指南，Cold Spring Harbor，1992)抗生素獲自SigmaC14乙酸鹽(53.4 Ci/mMol.Amersham International PLC)PBS(氯化鈉8g/l，氯化鉀0.2g/l，磷酸氫二鈉1.15g/l，磷酸二氫鉀0.2g/l)胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)
FCS胎牛血清(Gibco)大腸桿菌DAEC C 1845獲自西雅圖的華盛頓大學(xué)，大腸桿菌JPN15獲自美國(guó)馬里蘭大學(xué)的疫苗開發(fā)中心。鼠傷寒沙門氏菌SL1344獲自美國(guó)加州斯坦福大學(xué)微生物學(xué)系。
實(shí)施例1由嬰兒糞便中分離乳酸菌由16名15到27日齡健康嬰兒的尿布收集新鮮糞便。將1g新鮮糞便至于厭氧條件下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，取樣后2小時(shí)進(jìn)行微生物分析，在Ringer溶液中系列稀釋，在選擇培養(yǎng)基上鋪平板。MRS瓊脂培養(yǎng)基加抗生素(phosphomycine 80μg/ml，磺胺甲惡唑93μg/ml，甲氧芐啶5μg/ml)37℃溫育48小時(shí)以分離乳酸菌。隨機(jī)挑取菌落并純化。對(duì)分離物進(jìn)行生理和遺傳鑒定。
實(shí)施例2培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞在抑制實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞系Caco-2用作腸道模型。該細(xì)胞系具有腸道細(xì)胞的典型特征，如極化、腸道酶的表達(dá)，產(chǎn)生特定結(jié)構(gòu)多肽等。
細(xì)胞生長(zhǎng)在三種不同的支持物上，即在塑料平皿(25cm3，Corning)上生長(zhǎng)和增殖，在去脂和無菌的6孔玻璃平板(22×22mm，Corning)上進(jìn)行附著實(shí)驗(yàn)，在24孔玻璃平板(Corning)上進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。
培養(yǎng)2天后，每日更換培養(yǎng)基(DMEM)。在使用前，培養(yǎng)基中加入100U/ml青霉素/鏈霉素，1μg/ml amphoterine和20％56℃滅活30分鐘的FCS。在含有90％空氣和10％二氧化碳的氣氛中37℃培養(yǎng)。細(xì)胞每6天分裂一次。通過用PBS中的0.25％胰蛋白酶和3mM EDTA，pH7.2處理使細(xì)胞同孔壁脫離。為了中和胰蛋白酶的作用，向得到的細(xì)胞懸液中加入等體積FCS，混合物離心(1000rpm 10分鐘)，將細(xì)胞沉淀再次置于培養(yǎng)物中。大約3.5×105細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)到細(xì)胞單層匯合。
實(shí)施例3培養(yǎng)細(xì)菌ST11細(xì)菌菌株在含有15％甘油的MRS培養(yǎng)基中-20℃保存。菌株在厭氧條件下在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，每隔24小時(shí)轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中，抑制實(shí)驗(yàn)之前共轉(zhuǎn)移兩次。實(shí)驗(yàn)中使用2×109cfu/ml的濃度。
20000rpm離心1小時(shí)收集上清，然后檢查所得上清中是否存在細(xì)菌。
大腸桿菌使用兩種大腸桿菌菌株大腸桿菌DAEC C1845(擴(kuò)散附著大腸桿菌)和大腸桿菌JPN15(EPEC致腸病大腸桿菌)。
解凍后第一次傳代在CFA-Muller Hinton瓊脂上進(jìn)行，該培養(yǎng)基適于細(xì)菌表達(dá)附著因子。
每次實(shí)驗(yàn)之前，細(xì)菌細(xì)胞在37℃溫育，每隔24小時(shí)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，共轉(zhuǎn)移兩次。由于JPN15含有氨芐青霉素抗性基因，生長(zhǎng)過程中使用該抗生素選擇。
沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌SL1344用于該實(shí)驗(yàn)，使用前將其生長(zhǎng)于LB培養(yǎng)基中。
實(shí)施例4大腸桿菌抑制實(shí)驗(yàn)兩次傳代到新鮮培養(yǎng)基中后，病原菌株用10μCi/ml C14-乙酸鹽在LB培養(yǎng)基中標(biāo)記。在該培養(yǎng)基中將菌株37℃溫育18小時(shí)。
然后將細(xì)菌懸液離心(1041g，15min)，以除去上清中剩余的C14-乙酸鹽。細(xì)胞沉淀懸浮于PBS中洗滌，細(xì)胞懸液的濃度為約108細(xì)胞/ml，其中含有1％無菌甘露糖。抑制甘露糖抑制非特異性附著。
不同病原菌株(大腸桿菌)與Caco-2細(xì)胞單層接觸(37℃，10％二氧化碳，90％空氣)3小時(shí)。使用上清(20000rpm離心40分鐘得到)進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。
作為對(duì)照，病原菌與Caco-2細(xì)胞單層接觸，但分別不同時(shí)加入ST11或培養(yǎng)物上清。
溫育3小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，將單層用PBS洗滌3次。每一洗滌步驟包括20×PBS溶液攪動(dòng)，以便基本上除去所有非特異性附著。然后加入1毫升碳酸鈉裂解細(xì)胞，37℃溫育40分鐘。勻漿后，取一試樣(250微升)在5毫升閃爍液(Hionicfluor Packcard)中稀釋并計(jì)數(shù)(Packard 2000)。病原細(xì)胞對(duì)Caco-2細(xì)胞的附著百分比根據(jù)對(duì)照計(jì)算，對(duì)照設(shè)定為100％(附著，或侵入見實(shí)施例5)。
實(shí)施例5沙門氏菌抑制實(shí)驗(yàn)沙門氏菌是侵入上皮細(xì)胞并在其中增殖的細(xì)菌。為了確定ST11的抑制活性，鼠傷寒沙門氏菌SL1344如上所述在含有C14乙酸鹽的培養(yǎng)基中溫育，如實(shí)施例4所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
溫育后，Caco-2細(xì)胞用PBS洗滌，以便除去所有非附著細(xì)胞。然后將培養(yǎng)基加入到含有慶大霉素(20μg/ml)，37℃繼續(xù)溫育1小時(shí)。慶大霉素不會(huì)進(jìn)入腸道細(xì)胞，因此，殺死所有細(xì)胞外微生物，而已經(jīng)侵入腸道細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌則存活下來。用PBS洗滌細(xì)胞兩次后，細(xì)胞通過加入無菌蒸餾水裂解，如實(shí)施例4所述測(cè)定發(fā)射活性。
實(shí)施例4和5的結(jié)果見圖1到4。由結(jié)果可見，培養(yǎng)的ST11細(xì)胞和培養(yǎng)物上清在防止引起腹瀉的微生物對(duì)腸道細(xì)胞的附著和侵襲方面非常有效。
實(shí)施例6ST11的特性ST11已經(jīng)經(jīng)受了模擬胃液的溫育。模擬胃液通過將胃蛋白酶(3g/l)懸浮于無菌鹽水(0.5％w/v)中并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.0到3.0來制備。ST11在上述培養(yǎng)基中以不同量生長(zhǎng)，微生物的抗性也被確定。
結(jié)果總結(jié)在下表1中。
表1

ST11具有根據(jù)Ed.B.J.B.Wood和W.H.Holzapfel，Blackie A & P在乳酸細(xì)菌屬公開的方法限定的下列特性。
-革蘭氏陽性-觸酶陰性-氨形成精氨酸陰性-二氧化碳產(chǎn)生陰性-L(+)乳酸產(chǎn)生
-在濃度高達(dá)約0.4％的膽汁鹽存在下生長(zhǎng)實(shí)施例7在不同條件下ST11的生長(zhǎng)ST11在基于番茄的培養(yǎng)基(4％番茄粉在蒸餾水中重配)中37℃培養(yǎng)不同時(shí)間，培養(yǎng)基中補(bǔ)加有蔗糖(0，0.5，1或2％)或大豆蛋白胨(0.5％)或葡萄糖(0.5％)。結(jié)果見圖5。
再將2.5％的ST11加入由稻米淀粉(3％)、小麥淀粉(2％)或蔗糖(3％)組成的培養(yǎng)基中，37℃溫育直至pH達(dá)到4.4。冷卻后，加入或不加入維生素C將產(chǎn)物包裝，并儲(chǔ)存在10℃。
圖5顯示ST11在用不同塑料材料(HDPE高密度聚乙烯，PS聚苯烯)包裝的谷物飲料中10℃存活數(shù)據(jù)。
實(shí)施例8ST11誘導(dǎo)小鼠附著細(xì)胞中IL-12和IL-10mRNA合成由8周齡無病原菌C57BL/6小鼠股骨和脛骨分離骨髓細(xì)胞，并在RPMI培養(yǎng)基(Gibco)中以2×106細(xì)胞/毫升的濃度在5％二氧化碳?xì)夥障?7℃培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清，1mM L-谷氨酰胺，12mM Hepes，0.05mM 2-巰基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(所有試劑來自Gibco)。非附著細(xì)胞通過用溫?zé)崤囵B(yǎng)基3次連續(xù)洗滌除去，收獲留下的附著細(xì)胞，以106細(xì)胞/ml的濃度在細(xì)菌存在或不存在時(shí)溫育6小時(shí)。以前已經(jīng)確定，6小時(shí)是小鼠附著細(xì)胞響應(yīng)于LPS合成細(xì)胞因子mRNA的最佳時(shí)間點(diǎn)。細(xì)菌以109到107cfu/ml的不同濃度加入。細(xì)菌如前所述生長(zhǎng)和保存。
6小時(shí)培養(yǎng)期末，離心分離細(xì)胞，使用TRIzol試劑盒(GibcoBRL，目錄號(hào)15596-018)按照廠商說明裂解細(xì)胞。通過異丙醇沉淀分離總RNA，使用200單位逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript II，BRL)在40微升反應(yīng)體積中42℃ 90分鐘將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)溶液中含有200mM TrispH8.3，25mM KCl，1μg/ml寡聚d(T)15(Boehringer Mannheim)和40U/ml Rnasin(Promega)。PCR引物和條件如Kopf等所述(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1996 Sep 1；184(3)1127-36)。樣品中cDNA的量使用管家基因(β-2-微球蛋白)特異性引物校準(zhǔn)。PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上分離，在紫外光下分析條帶。
如圖7所示，ST11對(duì)IL-12和IL-10mRNA顯示最強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用，與陽性對(duì)照(大腸桿菌)中觀察到的水平相當(dāng)。在最低細(xì)菌濃度下可以最清楚地看到差異。
實(shí)施例9通過ST11抑制IL-4合成CD4+T細(xì)胞使用Miltenyi Biotec(目錄號(hào)492-01)的MiniMACS試劑盒從物特異病原菌的BALB/c小鼠脾臟純化。CD4+T細(xì)胞以2×105細(xì)胞/ml在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清，1mML-谷氨酰胺，12mM Hepes，0.05mM 2-巰基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在一周期間通過與培養(yǎng)板結(jié)合的抗CD3(克隆2C11)和CD28(克隆37.51)單克隆抗體(兩種抗體均來自Pharmingen)交叉結(jié)合而被激活。在第一代培養(yǎng)中，CD4+T細(xì)胞與作為輔助細(xì)胞的骨髓附著細(xì)胞(如上分離)和108cfu/ml ST11或cfu/ml La1或1mg/mlLPS或僅培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。此后，洗滌細(xì)胞，使用MiniMACS試劑盒再次純化CD4+T細(xì)胞，在僅含培養(yǎng)基的第二代培養(yǎng)中再次刺激。分化CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在2天后使用夾心ELISA在上清中測(cè)定(試劑盒來自Endogen和Pharmingen)。
結(jié)果示于圖5。在僅含培養(yǎng)基時(shí)分化的細(xì)胞顯示以高水平IL-4為特征的優(yōu)勢(shì)Th2表型。加入ST11至第一代培養(yǎng)物中強(qiáng)烈地調(diào)節(jié)Th2分化的結(jié)果，因?yàn)樗鼘?dǎo)致IL-4的產(chǎn)生降低8倍。這種抑制的幅度類似于來自在LPS存在時(shí)分化的細(xì)胞的培養(yǎng)物中觀察到的結(jié)果。與此相對(duì)，其他乳桿菌菌株對(duì)IL-4水平?jīng)]有可檢測(cè)的結(jié)果。有趣的是，IFN-γ水平在第一代培養(yǎng)中加入ST11時(shí)沒有增加。
由以上可見，利用微生物的有利特性，本發(fā)明的菌株可以制備成食品和/或藥物載體。
實(shí)施例10在Guatemala市郊的一個(gè)社區(qū)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中測(cè)試了ST11菌株影響該地區(qū)大部分兒童患過的急性雨季腹瀉病的傳遞和發(fā)病的能力。本研究招募了總共203名35到70個(gè)月齡的兒童，他們?cè)?9天的進(jìn)食期間接受了1010活微生物(ST11)或?qū)φ?安慰劑)。選擇樣品和安慰劑的兒童由于營(yíng)養(yǎng)不良在重量-年齡和高度-年齡方面具有典型缺陷。
在學(xué)齡前兒童進(jìn)食試驗(yàn)開始之前，進(jìn)行了體外和體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)研究。體外研究顯示了類似于食品中應(yīng)用的其他乳桿菌的抗生素抗性特征，沒有由于降解粘蛋白和解聚膽汁鹽形成生物源氨的可能。在包括42個(gè)成年志愿者的安慰劑對(duì)照臨床研究中，在監(jiān)測(cè)的可能表型如腸胃氣脹、每日排便次數(shù)和糞便稠度中，ST11耐受良好，沒有誘發(fā)任何副作用；血清中急性期蛋白水平相對(duì)于可能的炎癥反應(yīng)沒有出現(xiàn)任何值得關(guān)注之處。
樣品和安慰劑在瑞士Konolfingen的Nestle Product TechnologyCentre制造廠包裝成酏劑(sachet)，低溫海運(yùn)到Guatemala。每10克酏劑由巧克力味賦形劑和0.2克ST11(1010cfu)組成，安慰劑則是0.2克奶粉。巧克力味賦形劑由可可粉、糖、大豆卵磷脂、香草和肉桂組成。酏劑保存在4℃到6℃，使用前2小時(shí)取出。使用前，酏劑必需溶解在100毫升Nestle提供的水中，這種水中不含任何細(xì)菌污染。
根據(jù)應(yīng)用的方法，腹瀉定義為24小時(shí)期間排出3次或更多次液體或不定形糞便。腹瀉事件定義為表現(xiàn)出腹瀉特征(24小時(shí)腹瀉排泄3次)的事件。其持續(xù)時(shí)間自3次指標(biāo)糞便首次的時(shí)刻到首次出現(xiàn)成形糞便或24小時(shí)未排泄的時(shí)刻。對(duì)于兒童，前一事件終止后至少48小時(shí)才計(jì)算為新的事件。如果不是這樣，則計(jì)算為同一事件的持續(xù)，使用總的持續(xù)事件來評(píng)價(jià)。一個(gè)病例是在29天的觀察期內(nèi)，經(jīng)歷了一次或多次有記錄的事件的兒童。腹瀉事件的強(qiáng)度根據(jù)產(chǎn)生的松散糞便總數(shù)評(píng)價(jià)。事件嚴(yán)重性的因素包括糞便中帶血、粘液或膿，以及有發(fā)燒和嘔吐癥狀。每24小時(shí)排便7次的強(qiáng)度或需要在診所、健康中心或醫(yī)院中由專業(yè)人員干預(yù)也被歸入嚴(yán)重事件。
當(dāng)預(yù)警系統(tǒng)監(jiān)視腹瀉事件時(shí)，取腹瀉糞便的樣品進(jìn)行顯微鏡檢查，并培養(yǎng)以鑒定該事件可能的病原體。檢查樣品中的輪狀病毒抗原、賈第鞭毛蟲和E.Histolytica，樣品是痢疾，檢查細(xì)菌病原體包括志賀氏菌、沙門氏菌、氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、大腸桿菌和可能的霍亂弧菌。
在研究期間，收集產(chǎn)物樣品以檢查施用期間包括的微生物的活力。可以證實(shí)，在整個(gè)研究期間，酏劑內(nèi)微生物都是活的，所以研究結(jié)束時(shí)，酏劑用水重配時(shí)仍能提供1010活微生物。
該研究揭示，與對(duì)照組(安慰劑)相比，含有益生微生物的樣品可以降低腹瀉的出現(xiàn)約30％。然而，相對(duì)于沒有接受樣品或安慰劑的正常人群，對(duì)照組中腹瀉的發(fā)生也降低了。后一發(fā)現(xiàn)可能部分歸因于接受了額外的有價(jià)值營(yíng)養(yǎng)和無污染的水的兒童。但是，由于該研究是在自然環(huán)境中進(jìn)行的，很顯然ST11可以減少體內(nèi)腹瀉的發(fā)生。

權(quán)利要求
1.屬于乳桿菌屬具有防止引起腹瀉的病原菌在腸道定居能力的乳酸菌菌株。
2.權(quán)利要求1的乳桿菌菌株，它能夠附著在宿主有機(jī)體的腸道粘膜上。
3.前述任一權(quán)利要求的乳桿菌菌株，它能在高達(dá)0.4％膽汁鹽存在時(shí)生長(zhǎng)。
4.前述任一權(quán)利要求的乳桿菌菌株，它選自鼠李糖乳桿菌或類干酪乳桿菌。
5.權(quán)利要求4的乳桿菌菌株，它是類干酪乳桿菌。
6.權(quán)利要求5的乳桿菌菌株，它是類干酪乳桿菌CNCMI-2116(NCC 2461)。
7.前述任一權(quán)利要求的乳桿菌菌株用于制備可攝入的支持物材料的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中在支持物材料中含有的乳桿菌菌株量為約105cfu/g到約1012cfu/g支持物材料。
9.權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的乳桿菌菌株培養(yǎng)物的上清用于制備可攝入的支持物的用途。
10.權(quán)利要求7到9任一項(xiàng)的用途，其中支持物材料是選自牛奶、酸奶、凝乳、發(fā)酵牛奶、牛奶基發(fā)酵產(chǎn)品、冰激凌、發(fā)酵谷物基產(chǎn)品、牛奶基粉末、嬰兒配方食品的食品組合物。
11.權(quán)利要求7到10任一項(xiàng)的用途，其中支持物材料用來治療和/或預(yù)防與腹瀉有關(guān)的疾病。
12.含有至少一種權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的乳桿菌菌株或其培養(yǎng)物上清的食品或藥物組合物。
13.權(quán)利要求12的組合物，它選自牛奶、酸奶、凝乳、乳酪、發(fā)酵牛奶、牛奶基發(fā)酵產(chǎn)品、冰激凌、發(fā)酵谷物基產(chǎn)品、牛奶基粉末、嬰兒配方食品、丸劑、液體細(xì)菌懸液、干的口服補(bǔ)劑、濕的口服補(bǔ)劑、干的管飼產(chǎn)品或濕的管飼產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及乳桿菌屬的新微生物,它們可用于預(yù)防病原菌導(dǎo)致的腹瀉。具體而言,本發(fā)明涉及使用該微生物制備可攝食的支持物和含有該支持物的組合物。
文檔編號(hào)A23C9/123GK1350461SQ00807401
公開日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2000年3月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月11日
發(fā)明者J·－R·尼斯, R·雷尼洛, A·塞爾萬 申請(qǐng)人:雀巢制品公司