內(nèi)生生防菌株及其制成的生防菌劑的制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種內(nèi)生生防菌株及其制成的生防菌劑的制備方法與應(yīng)用，所述菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），己于2014年1月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCCNO.8812，生防菌劑濃度為1×108cfu/mL的內(nèi)生生防菌株細(xì)胞懸液。能夠有效的防止石榴的腐爛、無污染、抑菌率高。
【專利說明】內(nèi)生生防菌株及其制成的生防菌劑的制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物菌種防治石榴腐爛的領(lǐng)域，尤其涉及一種內(nèi)生生防菌株及其制成的生防菌劑的制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]石榴(Punica granatum)，別名安石榴，石榴科石榴屬。原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等國家，現(xiàn)已在亞洲、非洲、歐洲沿地中海各地，均作為果樹栽培，而以非洲尤多。在我國，除了東北等極寒冷的少數(shù)省區(qū)外，均適合石榴栽培，我國已經(jīng)形成了最有影響的石榴五大產(chǎn)區(qū)，分別為陜西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠(yuǎn)、四川會理和云南巧家。石榴是集食用、藥用以及觀賞于一體的水果，特別是石榴中富含抗氧化物質(zhì)，是延緩衰老、預(yù)防動脈硬化且減緩癌變進(jìn)程的高水平抗氧化劑。調(diào)查表明，我國石榴20%~30%在中秋節(jié)和國慶節(jié)消費(fèi)，10%用于加工，50%飛0%經(jīng)過儲藏延長貨架期在春節(jié)前后上市。但是石榴采后果實在貯藏過程中，受到多種致病菌共同作用導(dǎo)致果實腐爛變質(zhì)，通常腐爛率是30%，嚴(yán)重時可達(dá)70%，嚴(yán)重影響了石榴的經(jīng)濟(jì)價值。對于貯藏期石榴果實腐爛病由什么病菌引起有兩種觀點(diǎn):大部分學(xué)者(戴芳瀾1934 ;周又生1999 ；Jin&Chang 2002，等)認(rèn)為是由石榴干腐病菌石榴鮮殼孢(ZythiaVersoniana Sacc.)引起；2007 年付娟妮認(rèn)為是葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的。目前控制石榴采后腐爛的有效措施是低溫貯藏結(jié)合化學(xué)防腐劑、熱、輻射、氣調(diào)等。常使用的化學(xué)防腐劑有甲基托布津(Thiophanate-Methyl )、多菌靈(Carbendazim)、敵霉煙劑(TBZ)等?；瘜W(xué)防治是果蔬產(chǎn)后病害防治的主要途徑，但隨著發(fā)現(xiàn)有致癌作用，且污染環(huán)境的化學(xué)殺菌劑越來越多，使其在果品上的應(yīng)用受到限制。另外，一些殺菌劑的頻繁使用也使病菌產(chǎn)生抗性，防效大為降低，如葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、青霉菌(Penicillium sp.)、梨形毛 霉菌(Mufcor piriformis Fischer)早已對苯來特(Benlate)有抗性，由于在柑桔上長期使用苯并咪睡類殺菌劑(Benzimidazole fungicide),使原來對其不敏感的柑桔黑腐病菌(Alternaria citri Ellis et.Pierce)和柑桔酸腐病菌(Oosporacitriaurantii ex Persoon)種群上升成為新問題。隨著消費(fèi)者對無公害農(nóng)產(chǎn)品、綠色食品和有機(jī)食品的強(qiáng)烈需求，開發(fā)高效、低毒、無殘留的生物農(nóng)藥已成為迫切希望。生物農(nóng)藥是指利用生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)或生物活體作為農(nóng)藥，以及人工合成的與天然化合物結(jié)構(gòu)相同的農(nóng)藥，是不污染環(huán)境的綠色農(nóng)藥，可望成為解決化學(xué)農(nóng)藥殘留污染的有效途徑之一。近年來植物根部、葉部病害生物防治的成功實例，大大激發(fā)人們將生物防治擴(kuò)展到果蔬產(chǎn)后病害的防治研究領(lǐng)域。特別自1983年起美國農(nóng)部以Wilson為主的一批美、以、澳、法等國科學(xué)家，在這方面做了大量的研究工作，在美國，已有防治核果類、仁果類、柑桔及一些蔬菜產(chǎn)后病害的幾種拮抗菌取得了專利或正在審定。目前，將生物防治技術(shù)用于石榴貯藏防腐的研究，國內(nèi)外沒有相關(guān)報道。綜上所述，篩選有效的生防細(xì)菌，開發(fā)新型、安全有效的微生物殺菌劑是控制石榴腐爛病的發(fā)生，減少貯藏期石榴的損失，促進(jìn)石榴產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)健發(fā)展的迫切需要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)生生防菌株及其制成的生防菌劑的制備方法與應(yīng)用，能夠有效的防止石榴的腐爛、無污染、抑菌率高。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種內(nèi)生生防菌株，所述菌株為枯草芽孢桿菌subtil is,己于2014年I月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC N0.8812。保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0005]一種根據(jù)所述菌株的制備方法，其特征是:第一步，內(nèi)生生防菌株的分離和純化，采集健康的石榴葉片稱取3.0 g，用無菌水沖洗4飛次，無菌剪刀剪成4飛mm見方的小塊后，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無菌水沖洗3次，然后加30 mL無菌水在無菌研缽中研磨；研磨后靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進(jìn)行梯度稀釋至10_5，從10_3、10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次沖洗液0.2 mL涂布平板進(jìn)行無菌檢驗，每處理3個重復(fù)。在37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24-48 h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行純化；純化后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 h，4°C冰箱保存?zhèn)溆?；第二步，?nèi)生生防菌株的篩選，首先將石榴腐爛病菌在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上28°C培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用接種環(huán)挑取少量的病原菌孢子點(diǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對稱直線處劃線接種已分離的內(nèi)生菌株，以只接石榴腐爛病菌為對照，28 1:恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照中病菌菌絲即將鋪滿全皿時，計算抑制率的大小，篩選出抑菌效果較好的菌株；第三步，將篩選出的內(nèi)生生防菌株進(jìn)行保存，第一種保存方法，將選擇培養(yǎng)的內(nèi)生菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨斜 面上，培養(yǎng)24 h后置于4°C冰箱保存，半年轉(zhuǎn)管一次防止培養(yǎng)基干涸菌種死亡，供臨時使用，第二種保存方法為甘油保存:將內(nèi)生生防菌株用無菌水懸浮，充分混勻制成菌懸液，取20 %的滅菌甘油與菌懸液在渦旋震蕩器上充分混勻轉(zhuǎn)入無菌的1.5 mL EP管中，于-80 °〇冷凍長期保存。
[0006]根據(jù)所述菌株的制備方法，其特征是:所述滅菌甘油與菌懸液的體積比為2:1。
[0007]—種根據(jù)所述的內(nèi)生生防菌株生防菌劑，其特征是:生防菌劑濃度為IXlO8Cfu/mL的內(nèi)生生防菌株細(xì)胞懸液。
[0008]一種根據(jù)所述生防菌劑的制備方法，其特征是:挑取活化的內(nèi)生生防菌株少許，接種到10 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 °C, 180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，作為種子液；將種子液按1% (v/v)的比例接種于含200 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的IL三角瓶中，37 V,180 r/min搖床培養(yǎng)48 h,得到發(fā)酵液,2 500 r/min離心6 min,收集菌體用無菌水洗漆,用清水配成濃度為I X IO8 cfu/mL的內(nèi)生生防菌株細(xì)胞懸液，即為內(nèi)生生防菌株生防菌劑。
[0009]一種根據(jù)所述的生防菌劑在防治石榴貯藏期果實腐爛病的應(yīng)用，其特征是:將石榴果實用清水洗凈、風(fēng)干，將石榴果實浸入生防菌劑中10 min，取出后浙干萼筒內(nèi)的殘留溶液并預(yù)冷至5°C左右，再用0.025、.03 mm厚的聚乙烯袋單果包裝，裝箱入庫，保存溫度為4~6°C，相對濕度為90%。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)效果在于:本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一株具有高活性的、穩(wěn)定的內(nèi)生細(xì)菌菌株一Bacillus subtilis NS04。該菌株培養(yǎng)方法簡單，在PDA平板上對石榴干腐病菌有較好的抑制效果，抑制率為55.6%，對石榴貯藏期果實腐爛病有顯著的防效，不同貯藏期的相對防效為100%~54.082%，商品率顯著提高20%~12%，且該菌株為枯草芽孢桿菌UaciJAz1S來源于石榴葉片內(nèi)部組織，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥使用所帶來的一系列問題，綠色、無毒、環(huán)保，明顯將石榴果實的貨架期顯著延長了 90 d，提高了果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入。因此，菌株NS04作為石榴采后果實防腐的生防因子具有廣闊的開發(fā)前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為普通對照菌落的抑制效果圖。
[0012]圖2為內(nèi)生生防菌株對石榴干腐病菌抑制作用圖。
[0013]圖3為內(nèi)生生防菌株培養(yǎng)48h的形態(tài)圖。
[0014]圖4為內(nèi)生生防菌株在顯微鏡下的形態(tài)圖。
[0015]圖5為內(nèi)生生防菌株傳代對石榴干腐病菌抑制的穩(wěn)定性圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
實施例1:內(nèi)生生防菌株NS04的篩選:
1.內(nèi)生生防菌株的分離和純化 采集健康的石榴葉片稱取3.0 g，用無菌水沖洗4-5次，無菌剪刀剪成4飛mm見方的小塊后，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無菌水漂洗3次，然后加30 mL無菌水在無菌研缽中研磨；研磨后靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進(jìn)行10倍梯度稀釋至10_5，從10' 10_4、IO-5稀釋懸液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板進(jìn)行無菌檢驗，每處理3個重復(fù)。在37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24~48 h，觀察，若對照沒有菌落長出，說明表面滅菌徹底，所得到的菌株為內(nèi)生生防菌株，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)平板上采用平板劃線法進(jìn)行純化；純化后的菌株接種于NA斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 h，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0017]2.內(nèi)生生防菌株的篩選
以大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為的腐爛病的病菌石榴鮮殼孢(Zythia Versoniana Sacc.)為指示菌，采用平板對峙法測定內(nèi)生細(xì)菌對腐爛病菌的抑制作用。首先將石榴腐爛病菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上28 1:培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用接種環(huán)挑取少量的病原菌孢子點(diǎn)接到PDA平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對稱直線處劃線接種已分離的內(nèi)生細(xì)菌，以只接石榴腐爛病菌為對照，每處理3個重復(fù)，28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照中病菌菌絲即將鋪滿全皿時，計算抑制率的大小。
[0018]抑制率(％ )=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/對照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:厘米(cm)。
[0019]通過石榴葉片內(nèi)生菌的分離純化和篩選，獲得了一株對石榴腐爛病菌有較好抑菌活性的內(nèi)生菌菌株，抑制率為55.6%，編號為NS04 (圖1)。
[0020]實施例2:內(nèi)生生防菌株NS04的保存方法
可以采用兩種方法保存該菌種，將培養(yǎng)24 h的內(nèi)生細(xì)菌劃線接種在NA斜面上，培養(yǎng)24h后置4 1:冰箱保存，半年轉(zhuǎn)管一次防止培養(yǎng)基干涸菌種死亡，供臨時使用。甘油保存:將菌株用無菌水懸浮，充分混勻制成菌懸液，取20 %的滅菌甘油與菌懸液(Vws =Vea =2:1)渦旋震蕩器上充分混勻轉(zhuǎn)入無菌的1.5 mL EP管中，于-80 1:冷凍長期保存。
[0021 ] 實施例3:內(nèi)生生防菌株NS04的鑒定
1.NS04菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性
形態(tài)學(xué)和生理生化特性采用常規(guī)方法測定，測定結(jié)果表明NS04菌株在NA平板培養(yǎng)基上菌落直徑約為0.76 cm,白色，不透明，不規(guī)則狀，隆起，邊緣裂葉狀，隨培養(yǎng)時間延長菌落表面出現(xiàn)褶皺(圖2)。NS04單個細(xì)胞呈短桿狀，0.63~0.87X 1.75~2.51 μ m，單生或?qū)ι?圖3)，革蘭氏染色陽性，有橢圓形或柱狀芽孢。NS04菌株和枯草芽孢桿菌UaciJAz1Ssubtilis)的生理生化特性基本一致(表1)。
【權(quán)利要求】
1.一種內(nèi)生生防菌株，所述菌株為枯草芽孢桿菌(ifeci77i/5.己于2014年I月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCCN0.8812。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株的制備方法，其特征是:第一步，內(nèi)生生防菌株的分離和純化，采集健康的石榴葉片稱取3.0 g，用無菌水沖洗4飛次，無菌剪刀剪成4飛mm見方的小塊后，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無菌水沖洗3次，然后加30mL無菌水在無菌研缽中研磨；研磨后靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL,取上清液I mL進(jìn)行梯度稀釋至10_5，從10' 10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次沖洗液0.2 mL涂布平板進(jìn)行無菌檢驗，每處理3個重復(fù)；在37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24~48 h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行純化；純化后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 h，4°C冰箱保存?zhèn)溆?；第二步，?nèi)生生防菌株的篩選，首先將石榴腐爛病菌在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上28°C培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用接種環(huán)挑取少量的病原菌孢子點(diǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板中央，在距平板中央3cm的兩條對稱直線處劃線接種已分離的內(nèi)生菌株，以只接石榴腐爛病菌為對照，28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照中病菌菌絲即將鋪滿全皿時，計算抑制率的大小，篩選出抑菌效果較好的菌株；第三步，將篩選出的內(nèi)生生防菌株進(jìn)行保存，第一種保存方法，將選擇培養(yǎng)的內(nèi)生菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨斜面上，培養(yǎng)24 h后置于4°C冰箱保存，半年轉(zhuǎn)管一次防止培養(yǎng)基干涸菌種死亡，供臨時使用，第二種保存方法為甘油保存:將內(nèi)生生防菌株用無菌水懸浮，充分混勻制成菌懸液，取20 %的滅菌甘油與菌懸液在渦旋震蕩器上充分混勻轉(zhuǎn)入無菌的1.5 mL EP管中，于-80 °〇冷凍長期保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述菌株的制備方法，其特征是:所述滅菌甘油與菌懸液的體積比為 2:1。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)生生防菌株生防菌劑，其特征是:生防菌劑濃度為lX108cfu/mL的內(nèi)生生防菌株細(xì)胞懸液。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述生防菌劑的制備方法，其特征是:挑取活化的內(nèi)生生防菌株少許，接種到10 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 °C, 180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，作為種子液；將種子液按1% (v/v)的比例接種于含200 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的IL三角瓶中，37 °C, 180 r/min搖床培養(yǎng)48 h,得到發(fā)酵液,2 500 r/min離心6 min,收集菌體用無菌水洗滌，用清水配成濃度為I X IO8 cfu/mL的內(nèi)生生防菌株細(xì)胞懸液，即為內(nèi)生生防菌株生防菌劑。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的生防菌劑在防治石榴貯藏期果實腐爛病的應(yīng)用，其特征是:將石榴果實用清水洗凈、風(fēng)干，將石榴果實浸入生防菌劑中10 min，取出后浙干萼筒內(nèi)的殘留溶液并預(yù)冷至5°C左右，再用0.025、.03 mm厚的聚乙烯袋單果包裝，裝箱入庫，保存溫度為4~6°C，相對濕度為90%。
【文檔編號】A01N63/02GK104017748SQ201410106089
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】馬耀華, 譚小艷 申請人:棗莊學(xué)院