專利名稱：L－抗壞血酸和d－異抗血壞酸的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用內(nèi)酯酶由2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸分別生產(chǎn)L-抗壞血酸(維生素C)或D-異抗壞血酸的新方法。
目前使用眾所周知的Reichstein法[Helv.Chim.Acta 17，311-328(1934)]由2-酮-L-古洛糖酸生產(chǎn)L-抗壞血酸。這種方法已經(jīng)在商業(yè)上使用了60多年，采用了許多化學(xué)和技術(shù)改進(jìn)以提高每一步的效率D-葡萄糖→D-山梨糖醇→L-山梨糖→二丙酮-L-山梨糖→二丙酮-2-酮-L-古洛糖酸→2-酮-L-古洛糖酸→2-酮-L-古洛糖酸甲酯→L-抗壞血酸。在這種方法中，由D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)變是唯一的微生物步驟，其它都是化學(xué)步驟。由二丙酮-2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變可由兩種不同的操作實(shí)現(xiàn)1)去保護(hù)得到2-酮-L-古洛糖酸，接著進(jìn)行甲醇酯化和堿催化環(huán)化；和2)直接由受保護(hù)或去保護(hù)的2-酮-L-古洛糖酸酸催化環(huán)化成L-抗壞血酸。堿催化反應(yīng)的起始物是2-酮-L-古洛糖酸甲酯，它本身由酸用酸性甲醇處理制備而成。或者將其甲酯與碳酸氫鈉或醋酸鈉反應(yīng)，提供L-抗壞血酸鈉。許多化學(xué)和技術(shù)改進(jìn)提高了每一步的效率，使多步合成法成為主要使用和經(jīng)濟(jì)的方法。
D-異抗壞血酸由D-葡萄糖經(jīng)2-酮-D-葡糖酸(它自身可由屬于假單孢菌屬的一種菌株發(fā)酵生產(chǎn))和2-酮-D-葡糖酸甲酯生產(chǎn)。D-異抗壞血酸主要在食品添加劑中作為抗氧化劑使用。
已經(jīng)投入了很多時(shí)間和努力去尋找L-抗壞血酸的其它微生物合成方法。大多數(shù)L-抗壞血酸的微生物生產(chǎn)聚焦在由L-山梨糖[G.Z.Yin等人，Wei Sheng Wu Hsueh Pao.20，246-251(1980)；A.Fujiwara等人.，EP213,591(Roche)；T.Hoshino等人，USP4,960,695(Roche)；和I.H.Nogami等人，EP221,707]，由D-山梨糖醇[A.Fujiwara等人，EP213,591(Roche)；T.Hoshino等人，USP5,312,741(Roche)；M.Niwa等人，WO95/23220；和S.F.Stoddard等人，WO98/17819]，或由D-葡萄糖采用單一、混合或重組培養(yǎng)物經(jīng)2，5-二酮葡糖酸[T.Sonoyama等人，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)43，1064-1069(1982)；和S.Anderson等人，Science 230，144-149(1985)]生產(chǎn)L-抗壞血酸生產(chǎn)中的中間產(chǎn)物2-酮-L-古洛糖酸上。然后2-酮-L-古洛糖酸可以用上述化學(xué)方法轉(zhuǎn)變成L-抗壞血酸。
最近報(bào)道了用酶法將2-酮-L-古洛糖酸酯轉(zhuǎn)變成L-抗壞血酸的內(nèi)容[J.C.Hubbs，WO97/43433，Eastman化學(xué)公司]。WO97/43433描述了制備L-抗壞血酸的方法，包括將2-酮-L-古洛糖酸或其酯與選自蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶的水解酶催化劑接觸。通過使用水解酶，如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶，WO97/43433例證了由2-酮-L-古洛糖酸的酯(2-酮-L-古洛糖酸丁酯)形成L-抗壞血酸，但是沒有由2-酮-L-古洛糖酸自身明顯形成L-抗壞血酸。WO97/43433公開了，如Candidaantartica B脂肪酶在8.6％甲醇存在時(shí)于pH3.1～3.2和38℃(實(shí)施例15)催化該反應(yīng)，由1％2-酮-L-古洛糖酸形成413～530mg/l 2-酮-L-古洛糖酸甲酯，但是沒有形成L-抗壞血酸。Candida antartica B脂肪酶在酸性pH下對(duì)2-酮-L-古洛糖酸(一種α-酮-羧酸)的酯合成活性是明顯陽性的，但是這種脂肪酶引起的分子內(nèi)酯的形成可以忽略。它沒有公開用內(nèi)酯酶作水解酶催化劑，由2-酮-L-古洛糖酸生產(chǎn)L-抗壞血酸。
驚訝地發(fā)現(xiàn)，由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變可以由內(nèi)酯酶進(jìn)行。相應(yīng)地，驚訝地發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯酶對(duì)環(huán)酯的選擇性有利于由2-酮-L-古洛糖酸生產(chǎn)L-抗壞血酸。
已經(jīng)知道很多種內(nèi)酯酶，包括大腸桿菌[F.Hucho等人，生物化學(xué)及生物物理學(xué)學(xué)報(bào)276，176-179(1972)]或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌[M.Zachariou等人，細(xì)菌學(xué)雜志167，863-869(1986)和V.Kanagasundaram等人，生物化學(xué)及生物物理學(xué)學(xué)報(bào)1171，198-200(1992)]的葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)，和尖鐮孢[S.Shimizu等人，歐洲生物化學(xué)雜志209，383-390(1992)]的內(nèi)酯水解酶。另外報(bào)道的內(nèi)酯酶包括嗜糖假單孢菌的L-阿拉伯糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.15)和D-阿拉伯糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.30)、出芽茁霉(Pullularea pullulans)的L-鼠李糖酸-1，4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.65)、莓實(shí)假單孢菌和氧化葡糖桿菌的木糖酸-1，4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.68)、Trichoderma reesei的纖維二糖酸內(nèi)酯酶[Chem.-Ztg.113，122-124(1989)]、1，4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25)和EC編號(hào)為3.1.1.19、3.1.1.24、3.1.1.27、3.1.1.36、3.1.1.37、3.1.1.38、3.1.1.39、3.1.1.45、3.1.1.46和3.1.1.57的內(nèi)酯酶。
在這些內(nèi)酯酶中，已開發(fā)了尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶用于工業(yè)上D-泛酰內(nèi)酯的不對(duì)稱水解(K.Sakamoto等人，USP5,275,949)。該酶催化比較廣泛的內(nèi)酯化合物水解，包括D-泛酰內(nèi)酯和幾種醛糖酸內(nèi)酯，如D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯和D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯的水解，和逆反應(yīng)，即內(nèi)酯化。
可以得到一些內(nèi)酯酶基因的核苷酸序列，如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌的葡糖酸內(nèi)酯酶基因[960bp；320個(gè)氨基酸殘基；V.Kanagasundaram等人，生物化學(xué)及生物物理學(xué)學(xué)報(bào)1171，198-200(1992)]和尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶基因[1,140bp；380個(gè)氨基酸殘基；K.Sakamoto等人，WO97/10341]。
本發(fā)明提供了使用內(nèi)酯酶由2-酮-L-古洛糖酸生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，和由2-酮D-葡糖酸生產(chǎn)D-異抗壞血酸的方法。
相應(yīng)地，本發(fā)明致力于由2-酮-L-古洛糖酸生產(chǎn)L-抗壞血酸或由2-酮-D-葡糖酸生產(chǎn)D-異抗壞血酸的方法，該方法包括在溶液中將內(nèi)酯酶分別接觸2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸。
本發(fā)明方法中使用的內(nèi)酯酶可以由合適的生物體得到，包括動(dòng)物、植物和微生物，如真菌、酵母和細(xì)菌。任何微生物可以是它們的功能替代物、亞培養(yǎng)物、突變體或變種。
適合用于本發(fā)明方法的內(nèi)酯酶(如內(nèi)酯水解酶)是根據(jù)酶命名法(1992，學(xué)術(shù)出版社)的分類屬于酶類EC3.1.1.x的那些酶。在名稱“EC3.1.1.x”中，x表示任何位于“EC3.1.1.”之后的數(shù)，特征在于是內(nèi)酯酶，如內(nèi)酯水解酶，屬于有關(guān)類的酶；這些數(shù)x的例子是由上文給出的內(nèi)酯酶例子的酶類名稱中的那些。內(nèi)酯酶催化可逆反應(yīng)，具體地說是水解內(nèi)酯(由羧基和羥基之間的分子內(nèi)反應(yīng)形成的環(huán)酯)和重新形成內(nèi)酯。優(yōu)選的內(nèi)酯酶是葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)，尤其是大腸桿菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌的那些。尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶是進(jìn)一步優(yōu)選的內(nèi)酯酶。更特別優(yōu)選的內(nèi)酯酶是大腸桿菌IFO14410或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌IFO13756的葡糖酸內(nèi)酯酶和尖鐮孢IFO5942的內(nèi)酯水解酶。
如下文實(shí)施例所述制備的葡糖酸內(nèi)酯酶或內(nèi)酯水解酶在純化后或部分純化后的物理-化學(xué)性質(zhì)如下1)酶活性本發(fā)明方法中使用的內(nèi)酯酶催化醛糖酸的內(nèi)酯化，并且有能力在沒有其它輔助因子的情況下生產(chǎn)醛糖酸內(nèi)酯。在50～70℃測定由2-酮-L-古洛糖酸形成L-抗壞血酸的量，進(jìn)行L-抗壞血酸形成的酶實(shí)驗(yàn)。對(duì)于酶的純化，在室溫(約20～25℃)下，使用對(duì)硝基酚作為pH指示劑，測定作用于D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯底物形成D-半乳糖酸的底物內(nèi)酯酶活性作為酶活性。產(chǎn)生的D-半乳糖酸造成的酸化由對(duì)硝基酚在405nm吸收值的降低檢測。2)最佳pH在0.2M 2-嗎啉代乙烷磺酸鈉(Na-MES)緩沖液(pH5.5～7.0)或0.2M醋酸鈉緩沖液(pH3.75～5.5)中，使用2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物作為底物，在30、37、45或55℃測定內(nèi)酯酶的反應(yīng)速率和pH的相關(guān)性。大腸桿菌的葡糖酸內(nèi)酯酶、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌的葡糖酸內(nèi)酯酶和尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶的最佳pH分別為5.5、5.5和4.5～5.0。3)最佳溫度在30～70℃，0.2M Na-MES緩沖液(pH5.5)或0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)的反應(yīng)混合物中測定內(nèi)酯酶的酶活性。大腸桿菌的葡糖酸內(nèi)酯酶、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌的葡糖酸內(nèi)酯酶和尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶的最佳溫度分別為70℃、50℃和55℃。4)分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上確定純化后或部分純化后的內(nèi)酯酶的分子量。使用兔骨骼肌磷酸化酶B(97,400)、牛血清清蛋白(66,200)、牛卵清蛋白(45,000)、牛碳酸酐酶(31,000)、大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500)和雞卵清溶菌酶(14,400)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果證實(shí)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌葡糖酸內(nèi)酯酶和尖鐮孢內(nèi)酯水解酶的亞基的分子量分別為約32kDa和約60kDa。
本發(fā)明方法也可以通過使用內(nèi)酯酶的功能衍生物實(shí)現(xiàn)。這些功能衍生物由于在內(nèi)酯酶(未修飾的)的正常序列中添加、插入、刪除和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不同于內(nèi)酯酶本身，但這些衍生物用本領(lǐng)域知道的或此處特別描述的實(shí)驗(yàn)測定仍然具有內(nèi)酯酶活性。這些功能衍生物可以用本領(lǐng)域知道的肽化學(xué)合成法或蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾法，或者根據(jù)此處公開的DNA序列用本領(lǐng)域知道的和如Sambrook等人(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，USA，第二版1989)公開的重組方法制備。蛋白質(zhì)和肽中通常不改變這些分子活性的氨基酸改變?yōu)楸绢I(lǐng)域所知道且有描述，如H.Neurath和R.L.Hill的“蛋白質(zhì)”(學(xué)術(shù)出版社，紐約，1979；具體參閱圖6，第14頁)。最經(jīng)常發(fā)生的改變有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，以及反向改變。
本發(fā)明方法中使用的內(nèi)酯酶可以由以下方法得到含有想要的內(nèi)酯酶的生物體可以從自然界、商業(yè)或從生長在合適培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物中得到。內(nèi)酯酶可以以完整生物體或者以純化或部分純化后的酶形式使用。
就通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)合適的微生物得到內(nèi)酯酶而言，微生物可以在提供合適營養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中在有氧條件下便利地培養(yǎng)?？梢栽诩spH1.5～12進(jìn)行培養(yǎng)。而培養(yǎng)時(shí)間隨著pH、溫度和使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基變化，通常1～10天時(shí)間即可獲得比較滿意的結(jié)果。進(jìn)行培養(yǎng)的優(yōu)選溫度范圍為約0～120℃。
通常要求培養(yǎng)基含有諸如可同化的碳源、可消化的氮源和無機(jī)物、維生素、微量元素和其它生長促進(jìn)因子之類營養(yǎng)物?？梢允褂酶视?、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿拉伯糖醇、L-山梨糖、D-山梨糖醇等等作為可同化的碳源。
許多有機(jī)物和無機(jī)物也可以被用作氮源，如酵母提取物、肉提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米漿、尿素、氨基酸、硝酸鹽、銨鹽等等。作為無機(jī)物，可以使用硫酸鎂、磷酸鉀、氯化亞鐵和氯化鐵、碳酸鈣等等。
可以通過下列本領(lǐng)域眾所周知的方法，在培養(yǎng)后由微生物分離和純化內(nèi)酯酶(1)由發(fā)酵肉湯離心或過濾收獲細(xì)胞。
(2)通過常用的細(xì)胞裂解方法，如超聲波法、勻漿法、French擠壓處理、和用細(xì)胞溶解酶處理，由細(xì)胞制備粗制酶溶液。通過滲透休克方法或自身裂解方法的提取法可應(yīng)用于粗制酶溶液的制備。
(3)通過常用的蛋白質(zhì)純化方法，如硫酸銨沉淀、透析、離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析、親合層析和結(jié)晶，由粗制酶溶液分離和純化內(nèi)酯酶。
在內(nèi)酯酶(如大腸桿菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌的葡糖酸內(nèi)酯酶和尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶)的酶純化過程中，可以用醛糖酸內(nèi)酯(如D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯和D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯)作為底物測定酶活性。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的反應(yīng)混合物包括底物，即2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸，和作為催化劑的內(nèi)酯酶，如上文提及的，內(nèi)酯酶以完整生物體的形式、以純化或部分純化的形式、或以功能衍生物的形式存在。
2-酮-L-古洛糖酸和2-酮-D-葡糖酸優(yōu)選的化學(xué)形式是游離酸、它的鈉鹽或它的鈣鹽。
本發(fā)明方法(酶反應(yīng))在溫度0～120℃，優(yōu)選20～100℃，最優(yōu)選37～80℃便利地進(jìn)行。
實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)的合適pH為pH1.5～12，優(yōu)選pH1.5～8，且最優(yōu)選pH2.5～7。
底物2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸在反應(yīng)混合物中的濃度便利地為1～300g/l，優(yōu)選10～200g/l，最優(yōu)選50～150g/l。
反應(yīng)可以在水或者由水和一種醇或幾種醇混合物組成的含水溶劑(即含水醇)中便利地實(shí)現(xiàn)。或者，它可以在非醇的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和上述含水溶劑(含水醇)的混合物中實(shí)現(xiàn)。醇優(yōu)選C1～6醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇和叔丁醇。合適的有機(jī)溶劑包括脂肪族碳?xì)浠衔?如庚烷和異辛烷)、脂環(huán)族碳?xì)浠衔?如環(huán)己烷)和芳香族碳?xì)浠衔?如苯和甲苯)。優(yōu)選的溶劑是水或含水溶劑，尤其是水自身。從經(jīng)濟(jì)和環(huán)境角度看，在工業(yè)方法中盡可能少使用有機(jī)溶劑。
反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步含有抗氧化劑，如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或半胱氨酸，以防止生成的L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸降解。
作為內(nèi)酯酶自身的替代物，反應(yīng)混合物可以包括具有內(nèi)酯酶活性的生物體。
對(duì)于該反應(yīng)，可以使用內(nèi)酯酶的任何形式，尤其是酶溶液、固定化酶、具有內(nèi)酯酶活性的生物體的完整細(xì)胞和具有內(nèi)酯酶活性的固定化細(xì)胞。
通過在用一個(gè)容器的一步轉(zhuǎn)變法中或在用兩個(gè)容器的兩步轉(zhuǎn)變法中結(jié)合使用具有內(nèi)酯酶活性的生物體和具有L-山梨糖/L-山梨糖酮脫氫酶和D-山梨糖醇脫氫酶的生物體，例如氧化葡糖桿菌DSM4025，可以由L-山梨糖或D-山梨糖醇生產(chǎn)L-抗壞血酸[A.Fujiwara等人，EP213,591(Roche)；T.Hoshino等人，USP4,960,595(Roche)；T.Hoshino等人，USP5,312,741(Roche)]。
本發(fā)明由下列實(shí)施例舉例說明實(shí)施例1(1)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌IFO13756的葡糖酸內(nèi)酯酶的部分純化將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌IFO13756在6升含0.5％酵母提取物和2％葡萄糖的培養(yǎng)基(pH6.9)中于30℃靜止培養(yǎng)22.5小時(shí)。離心收集細(xì)胞，并用含0.1M NaCl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)清洗。
在酶純化過程中，所有柱層析于4℃進(jìn)行。使用對(duì)硝基苯酚作為pH指示劑，通過分光光度法實(shí)驗(yàn)測定D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯的水解活性作為酶活性。實(shí)驗(yàn)混合物含100mM D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、50μg/ml對(duì)硝基酚、10mM 2-嗎啉代乙烷磺酸鈉(Na-MES)緩沖液(pH6.4)和酶。產(chǎn)生的D-半乳糖酸造成的酸化由在405nm吸收值的降低檢測。
將細(xì)胞(濕重11.7g)懸浮于1,200ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，然后加入EDTA(pH8.0)至1mM。懸浮液在室溫下擱置并攪拌30分鐘。離心(8,000xg，20分鐘，4℃)收集細(xì)胞，并重懸浮于12ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)。將懸浮液倒入1,800ml冰冷的5mM MgSO4·7H2O中稀釋，在冰上擱置并攪拌30分鐘。將所得懸浮液離心(8,000xg，20分鐘，4℃)得到上清液作為周質(zhì)部分。
向周質(zhì)部分中加入Na-MES緩沖液(pH6.4)和2-巰基乙醇分別至20mM和0.1mM，然后加入(NH4)2SO4至1.25M。將所得周質(zhì)部分上樣到Butyl-Toyopearl 650 S柱(40ml內(nèi)徑(ID)2.5×8.2cm，TOSOH公司，東京，日本)，該柱已用含0.1mM 2-巰基乙醇和1.25M(NH4)2SO4的20mM Na-MES緩沖液(pH6.4)平衡過。用平衡緩沖液清洗柱子后，用線性梯度濃度的(NH4)2SO4[于含0.1mM 2-巰基乙醇的20mM Na-MES緩沖液(pH6.4)中1.25～0M]將酶洗脫。收集活性部分。
用含0.1mM 2-巰基乙醇的25mM Na-MES緩沖液(pH5.0)透析后，將酶部分上樣到用相同緩沖液平衡的HiTrap SP柱(1ml，Amersham PharmaciaBiotech AB，瑞典)上。用相同緩沖液清洗柱子后，用線性梯度濃度的NaCl(于相同緩沖液中的0～0.5M NaCl)將酶洗脫并收集活性部分。將酶溶液用20mM Na-MES緩沖液(pH6.4)透析，然后用Centricon 30(Amicon有限公司，USA)濃縮。將酶溶液保存于-80℃直至使用。
最后，由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌經(jīng)440倍純化得到純度約為30％的含葡糖酸內(nèi)酯酶的酶溶液(0.319mg蛋白質(zhì))。在SDS-PAGE上該酶的亞基大小約為32kDa，與由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌ATCC29191報(bào)道的相同[生物化學(xué)及生物物理學(xué)學(xué)報(bào)1171，198-200(1992)]。(2)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌IFO13756的葡糖酸內(nèi)酯酶作用下由2-酮-L-古洛糖酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-抗壞血酸將部分純化后的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌葡糖酸內(nèi)酯酶用于由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變。反應(yīng)混合物含8％2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物、1mM CaCl2和320μg/ml部分純化后的酶(于200mM Na-MES緩沖液，pH5.5中)。反應(yīng)在厭氧條件下于50℃進(jìn)行20小時(shí)。用HPLC在YMC-PackPolyamine II柱(ID 4.6×150mm；YMC公司，日本)上于264nm檢測L-抗壞血酸，流動(dòng)相溶劑含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氫銨，流速1.5ml/min。生成L-抗壞血酸236.3mg/l(表1)。
表1
*1酶純度約30％*2酶純度低于30％*3Na-2KGA·H2O2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物實(shí)施例2(1)大腸桿菌C600(IFO14410)的葡糖酸內(nèi)酯酶的部分純化將大腸桿菌C600在6升含0.2％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)5小時(shí)。離心收集細(xì)胞，并用含0.1M NaCl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)清洗。
在酶純化過程中，所有柱層析于4℃進(jìn)行。如實(shí)施例1描述通過分光光度法測定酶活性。實(shí)驗(yàn)混合物含200mM D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、50μg/ml對(duì)硝基苯酚、10mM Na-MES緩沖液(pH6.4)和酶。產(chǎn)生的D-半乳糖酸造成的酸化檢測為405nm吸收值的降低。
將細(xì)胞(濕重15.4g)懸浮于1,200ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，然后加入EDTA(pH8.0)至1mM。懸浮液在室溫下擱置并攪拌30分鐘。離心(8,000xg，20分鐘，4℃)收集細(xì)胞，并重懸浮于12ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)。將懸浮液倒入1,800ml冰冷的5mM MgSO4·7H2O中稀釋，并在冰上擱置并攪拌30分鐘。將所得懸浮液離心(8,000xg，20分鐘，4℃)得到上清液作為周質(zhì)部分。
向周質(zhì)部分，加入Tris-HCl緩沖液(pH7.5)和2-巰基乙醇分別至25mM和0.1mM，然后加入(NH4)2SO4至1.5M。將所得周質(zhì)部分上樣于Butyl-Toyopearl 650 S柱(40mlID 2.5×8.2cm，TOSOH公司，東京，日本)中，該柱已用含0.1mM 2-巰基乙醇和1.5M(NH4)2SO4的25mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡。用平衡緩沖液清洗柱子后，用線性梯度濃度的(NH4)2SO4[于含0.1mM 2-巰基乙醇的25mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中的1.5～0M]將酶洗脫并收集活性部分。
用含0.1mM 2-巰基乙醇的25mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)透析后，將酶部分上樣于用相同緩沖液平衡的HiTrap Q柱(1ml，AmershamPharmacia Biotech AB，瑞典)上。用相同緩沖液清洗柱子后，用線性梯度的NaCl(于相同緩沖液中的0～0.8M NaCl)將酶洗脫并收集活性部分。
將酶溶液用25mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)透析，然后上樣于用相同緩沖液平衡的RESOURCE Q柱(1ml，Amersham Pharmacia Biotech AB，瑞典)上。用相同緩沖液清洗柱子后，用線性梯度濃度的NaCl(于相同緩沖液中的0～0.6M NaCl)將酶洗脫并收集活性部分。將酶溶液用相同緩沖液透析，然后用Centricon 30(Amicon有限公司，USA)濃縮。最后，由大腸桿菌500倍純化得到含葡糖酸內(nèi)酯酶的酶溶液(0.291mg蛋白質(zhì))。在SDS-PAGE上觀察到至少5條蛋白質(zhì)帶。將酶溶液保存于-80℃直至使用。(2)大腸桿菌C600(IFO14410)的葡糖酸內(nèi)酯酶作用下由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變將部分純化后的大腸桿菌葡糖酸內(nèi)酯酶用于由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變。反應(yīng)混合物含8％2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物、1mMCaCl2和269μg/ml部分純化后的酶(于200mM Na-MES緩沖液，pH5.5中)。反應(yīng)在厭氧條件下于70℃進(jìn)行20小時(shí)，并如實(shí)施例1所述用HPLC檢測L-抗壞血酸。生成L-抗壞血酸30.5mg/l(表1)。實(shí)施例3(1)尖鐮孢IFO5942的內(nèi)酯水解酶的純化基本上按照文獻(xiàn)描述的方法[S.Shimizu等人，歐洲生物化學(xué)雜志209，383-390(1992)]由IFO5942菌株純化尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶。通過監(jiān)控葡糖酸內(nèi)酯酶的活性純化酶。用實(shí)施例1所述方法測定活性。實(shí)驗(yàn)混合物含25mM D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、0.25mM對(duì)硝基苯酚、20mM 3-嗎啉代-1-丙烷磺酸鈉緩沖液(pH7.2)和1mM CaCl2。產(chǎn)生的D-半乳糖酸造成的酸化由在405nm吸收值的降低檢測。
將尖鐮孢IFO5942在7.5升含3％蔗糖、0.4％NaNO3、0.2％K2HPO4、0.1％MgSO4·7H2O、0.05％KCl、0.001％FeSO4·7H2O、0.002％ZnSO4·7H2O改進(jìn)后的Czapek培養(yǎng)基(pH6.0)中于28℃培養(yǎng)48小時(shí)。用Whatman 1SP濾器(Whatman NJ，UK)過濾收集細(xì)胞，并用“TB”緩沖液[含0.1mM二硫蘇糖醇的20mM Tris-HCl(pH7.4)]清洗，得到濕重365g細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于1升TB緩沖液，加入2M Na2CO3至pH6.0～6.2，在10～15℃保溫7天。將所得細(xì)胞懸浮液用Whatman 1SP濾器過濾并將所得濾出液離心以除去細(xì)胞碎片；由細(xì)胞分離出約1升上清液。將上清液用5升TB緩沖液透析，得到1200ml細(xì)胞提取液，含408mg總蛋白。首先將細(xì)胞提取液上樣于DEAE-Toyopearl 650M(TOSOH公司，東京，日本，ID 4.4×4cm，60ml，用TB緩沖液平衡)上。用1升TB緩沖液清洗后，用540ml于TB緩沖液中的0～0.3M NaCl線性梯度濃度將蛋白質(zhì)洗脫。收集活性部分，用2升TB緩沖液透析并上樣于SuperQ-Toyopearl 650M(TOSOH公司，日本，ID1.5×8cm，14ml，用TB緩沖液平衡)上。用20ml TB緩沖液清洗后，用240ml于TB緩沖液中的0～0.15M NaCl線性梯度濃度將蛋白質(zhì)洗脫。收集活性部分(30ml)并用20ml TB緩沖液稀釋(最終蛋白質(zhì)濃度約為1mg/ml)。向得到的50ml酶溶液中，加入0.5ml 2M Tris-HCl(pH8.25)和30g固體硫酸銨(約85％飽和硫酸銨)并于4℃保溫10分鐘。15,000rpm離心30分鐘除去沉淀的蛋白質(zhì)。為了除去硫酸銨，將有酶活性的上清液用TB緩沖液充分透析，在濃縮器中用YM-30濾器(Amicon有限公司，MA，USA)反復(fù)濃縮和稀釋。透析和濃縮后(直至小于10ml)，酶開始以晶體(針芒)析出。離心收集結(jié)晶的酶，用TB緩沖液清洗兩次并以純化酶濃度為2.0mg/ml蛋白質(zhì)溶于含0.1M KCl的TB緩沖液中。最后，由細(xì)胞提取液中以約56倍的純化系數(shù)和27％的回收產(chǎn)量得到在SDS-PAGE上顯示單一60kDa條帶的2mg純化后酶。將純化后的酶保存于-80℃直至使用。(2)尖鐮孢IFO5942的內(nèi)酯水解酶作用下由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變將純化后的尖鐮孢內(nèi)酯水解酶用于由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變。反應(yīng)混合物含12％2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物、0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)和1mM CaCl2。反應(yīng)在厭氧條件下于55℃進(jìn)行20小時(shí)，并如實(shí)施例1所述用HPLC檢測生成的L-抗壞血酸。含400μg/ml純化酶的反應(yīng)混合物生成L-抗壞血酸714.8mg/l。不含純化酶的相同反應(yīng)條件顯示L-抗壞血酸背景積累7.2mg/l(表1)。(3)尖鐮孢IFO5942的內(nèi)酯水解酶的酯選擇性將2-酮-L-古洛糖酸甲酯(12％w/v)、尖鐮孢IFO5942的內(nèi)酯水解酶(100μg/ml)和0.2M Na-MES緩沖液(pH7.0)在氬氣中于50℃保溫2小時(shí)。加入內(nèi)酯水解酶對(duì)2-酮-L-古洛糖酸甲酯的消耗沒有影響。
在下列條件下檢測對(duì)2-酮-L-古洛糖酸(12％)與甲醇(10％)的直鏈酯合成活性將2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物(12％w/v)、甲醇(10％)、尖鐮孢IFO5942的內(nèi)酯水解酶(200μg/ml)和0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)在氬氣中于50℃保溫20小時(shí)。沒有檢測到2-酮-L-古洛糖酸甲酯，而檢測到L-抗壞血酸219mg/l。
實(shí)施例4脂肪酶的由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)變活性沒有檢測到德氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶具有將2-酮-L-古洛糖酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-抗壞血酸的活性。反應(yīng)混合物含購自SEIKAGAKU公司(編號(hào)No.100890，東京，日本)的德氏根霉脂肪酶、6％2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物、0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)和1mM CaCl2。反應(yīng)在厭氧條件下于37℃進(jìn)行20小時(shí)，并如實(shí)施例1所述用HPLC檢測生成的L-抗壞血酸。含500μg/ml脂肪酶RD的反應(yīng)混合物沒有生成可檢測量的L-抗壞血酸(表2)。含100μg/ml尖鐮孢內(nèi)酯水解酶的相似反應(yīng)條件由3.2％2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物生成了L-抗壞血酸48.3mg/l(表2)。
表2
*1Na-2KGA·H2O2-酮-L-古洛糖酸鈉單水化物實(shí)施例5運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌IFO13756和大腸桿菌C600的葡糖酸內(nèi)酯酶作用下將2-酮-D-葡糖酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-異抗壞血酸將部分純化后的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌和大腸桿菌葡糖酸內(nèi)酯酶用于由2-酮-D-葡糖酸到D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)變。反應(yīng)混合物含4.7％2-酮-D-葡糖酸半鈣鹽(Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州，USA)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌或大腸桿菌葡糖酸內(nèi)酯酶(于167mM Na-MES緩沖液，pH5.5)。加入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌葡糖酸內(nèi)酯酶濃度為213μg/ml，反應(yīng)在厭氧條件下于50℃進(jìn)行20小時(shí)。加入大腸桿菌葡糖酸內(nèi)酯酶濃度為180μg/ml，反應(yīng)在厭氧條件下于70℃進(jìn)行20小時(shí)。用HPLC在YMC-Pack Polyamine II柱(ID 4.6×150mm；YMC公司，日本)上于264nm檢測D-異抗壞血酸，流動(dòng)相溶劑含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氫胺，流速1.5ml/min。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌和大腸桿菌葡糖酸內(nèi)酯酶分別生成D-異抗壞血酸35.8mg/l和39.6mg/l(表3)。
表3
*1酶純度約30％*2酶純度低于30％*32-酮-D-葡糖酸半鈣鹽
權(quán)利要求
1.由2-酮-L-古洛糖酸生產(chǎn)L-抗壞血酸或由2-酮-D-葡糖酸生產(chǎn)D-異抗壞血酸的方法，包括在溶液中使2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸分別接觸內(nèi)酯酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)酯酶是根據(jù)酶命名法的分類屬于酶類EC3.1.1.x的一種酶。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述內(nèi)酯酶為屬于酶類EC3.1.1.17的葡糖酸內(nèi)酯酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述內(nèi)酯酶為大腸桿菌或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌的葡糖酸內(nèi)酯酶。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述內(nèi)酯酶為尖鐮孢的內(nèi)酯水解酶。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)酯酶為內(nèi)酯酶的功能衍生物或具有內(nèi)酯酶活性的生物體。
7.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)的方法，其中溶劑為水。
8.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)的方法，其中溶劑為含水溶劑，其由水和一種醇或者幾種醇的混合物組成。
9.權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)的方法，其中2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸在溫度0～120℃，優(yōu)選20～100℃，最優(yōu)選37～80℃下與內(nèi)酯酶接觸。
10.權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)的方法，其中2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸在pH1.5～12，優(yōu)選pH1.5～8，最優(yōu)選pH2.5～7下與內(nèi)酯酶接觸。
11.權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸均以游離酸、其鈉鹽或鈣鹽的形式使用。
全文摘要
由2－酮－L－古洛糖酸生產(chǎn)L－抗壞血酸(維生素C)或由2－酮－D－葡糖酸生產(chǎn)D－異抗壞血酸的方法,包括在溶液中使2－酮－L－古洛糖酸或2－酮－D－葡糖酸分別接觸內(nèi)酯酶(尤其是根據(jù)酶命名法的分類屬于酶類EC3.1.1.x)。用于這一反應(yīng)的溶劑可以是水、含水醇、非醇有機(jī)溶劑或者含水醇和非醇有機(jī)溶劑的混合物。酶促反應(yīng)通常在0～120℃的溫度范圍和1.5～12的pH范圍進(jìn)行。兩種情況中原料可以是游離酸、鈉鹽或鈣鹽的形式。如此生成的維生素C有很熟悉的用途,生產(chǎn)的D－異抗壞血酸可作為食品添加劑中的抗氧化劑使用。
文檔編號(hào)C12P17/04GK1263950SQ00100990
公開日2000年8月23日 申請(qǐng)日期2000年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月18日
發(fā)明者淺倉信良, 星野立夫, 木安龍彌, 新城公子 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司