本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì)，申請(qǐng)人前期根據(jù)羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，已推導(dǎo)出甜苷v可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷v生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內(nèi)基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發(fā)生在胞質(zhì)中，mep途徑發(fā)生在質(zhì)體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經(jīng)牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進(jìn)而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經(jīng)角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環(huán)氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進(jìn)一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)的作用下，形成羅漢果甜苷v。
異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生受到限速酶活性的嚴(yán)格調(diào)控，一直被認(rèn)為在其生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，ugt基因的表達(dá)對(duì)羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達(dá)ugt基因，可以促進(jìn)羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制ugt基因的表達(dá)，羅漢果甜苷v的產(chǎn)量將顯著降低。然，ugt基因是個(gè)超基因家族，申請(qǐng)人前期研究發(fā)現(xiàn)，ugt71v1可能參與羅漢果甜苷v的合成途徑?，F(xiàn)有技術(shù)中未見有促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法。
為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法，包括如下步驟：在羅漢果組培過程中和羅漢果栽培過程中，施加濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯，以促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)。
優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法中，所述羅漢果組培過程中，將所述茉莉酸甲酯添加到所述羅漢果組培過程中的固體培養(yǎng)基中。
優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法中，所述羅漢果栽培過程中，于羅漢果授粉后20～30天后，向羅漢果表面噴灑所述濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯至其表面滴水為止，每天于早上、中午和晚上各噴灑一次，連續(xù)噴施5天。
優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法中，所述羅漢果組培過程中所述固體培養(yǎng)基包含：ms，1.5mg/l6-ba，0.3mg/liba，3.5g/l瓊脂，30g/l蔗糖和1.0g/l活性炭。
優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法中，所述羅漢果組培過程中的培養(yǎng)條件為：于相對(duì)濕度60-66％，光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d和溫度21～25℃條件下培養(yǎng)30d。
優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法，還包括：茉莉酸母液配制：用2％(v/v)的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，得到滅菌后的茉莉酸甲酯母液；
將該茉莉酸甲酯母液添加到羅漢果組培過程中的固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯的終濃度為50-400μmol/l；
用乙醇助溶，將茉莉酸甲酯母液配成50-400μmol/l的溶液，施加于所述羅漢果栽培過程中。
優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法中，還包括如下步驟：
qrt-pcr檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)：
1)采集羅漢果果實(shí)，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>
2)采用trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna；
3)將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna；
4)采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)量，其中，擴(kuò)增ugt71v1的引物序列為：上游引物ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，下游引物cggaattcttactctcctccttctggcccg，內(nèi)參基因用ubq5基因，擴(kuò)增引物序列為：上游引物ataaaagacccagcaccacattc，下游引物cccttgccgactacaacatcc。
優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法中，還包括：所述羅漢果栽培過程中，向羅漢果表面噴灑的茉莉酸甲酯的溫度為8～12℃，同時(shí)，還采用注射的方式將茉莉酸甲酯注射入羅漢果植株的主莖中，注射量為6～15ml，注射的速率為3～5ml/h。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
(1)本發(fā)明通過在羅漢果組培苗和栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯，短期內(nèi)快速誘導(dǎo)羅漢果甜苷v生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因ugt71v1的高表達(dá)，為促進(jìn)羅漢果甜苷v含量的積累打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)；
(2)本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，成本低，對(duì)環(huán)境友好，適于規(guī)?；a(chǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣價(jià)值。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
本發(fā)明提供一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法，包括如下步驟：在羅漢果組培過程中和羅漢果栽培過程中，施加濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯，以促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)。
在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述羅漢果組培過程中，將所述茉莉酸甲酯添加到所述羅漢果組培過程中的固體培養(yǎng)基中。
在上述方案中，作為優(yōu)選，所述羅漢果組培過程中所述固體培養(yǎng)基包含：ms，1.5mg/l6-ba，0.3mg/liba，3.5g/l瓊脂，30g/l蔗糖和1.0g/l活性炭。
在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述羅漢果栽培過程中，于羅漢果授粉后20～30天后，向羅漢果表面噴灑所述濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯至其表面滴水為止，每天于早上、中午和晚上各噴灑一次，連續(xù)噴施5天。
在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述羅漢果組培過程中的培養(yǎng)條件為：于相對(duì)濕度60-66％，光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d和溫度21～25℃條件下培養(yǎng)30d。
在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，還包括：茉莉酸母液配制：用2％(v/v)的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，得到滅菌后的茉莉酸甲酯母液；
將該茉莉酸甲酯母液添加到羅漢果組培過程中的固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯的終濃度為50-400μmol/l；
用乙醇助溶，將茉莉酸甲酯母液配成50-400μmol/l的溶液，施加于所述羅漢果栽培過程中。
在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，還包括如下步驟：
qrt-pcr檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)：
1)采集羅漢果果實(shí)，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>
2)采用trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna；
3)將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna；
4)采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)量，其中，擴(kuò)增ugt71v1的引物序列為：上游引物ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca(seqidno:1)，下游引物cggaattcttactctcctccttctggcccg(seqidno:2)，內(nèi)參基因用ubq5基因，擴(kuò)增引物序列為：上游引物ataaaagacccagcaccacattc(seqidno:3)，下游引物cccttgccgactacaacatcc(seqidno:4)。
在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，還包括：所述羅漢果栽培過程中，向羅漢果表面噴灑的茉莉酸甲酯的溫度為8～12℃，同時(shí)，還采用注射的方式將茉莉酸甲酯注射入羅漢果植株的主莖中，注射量為6～15ml，注射的速率為3～5ml/h。在羅漢果栽培過程中，向羅漢果表面噴灑此溫度的茉莉酸甲酯溶液，對(duì)羅漢果的果實(shí)給予一定的冷刺激，能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)ugt71v1基因的表達(dá)。將茉莉酸甲酯直接注射于羅漢果體內(nèi)，能夠便于羅漢果植株對(duì)其的直接吸收，進(jìn)一步加大吸收效率，且由于是直接注射到體內(nèi)，冷刺激更加明顯，能夠進(jìn)一步促進(jìn)ugt71v1基因的表達(dá)。
實(shí)施例1
一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為50μmol/l，滅菌并冷卻至24℃；固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中，置于相對(duì)濕度60％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度23℃條件下培養(yǎng)30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成50μmol/l的溶液，噴灑于授粉后20d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d。
同時(shí)設(shè)置對(duì)比例1，
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
2)不對(duì)羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實(shí)施例1一致。
(3)qrt-pcr檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)。
采集果實(shí)，挑取果肉，切成2mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。
采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。
將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應(yīng)條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內(nèi)參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應(yīng)條件為95℃(30s)，接著進(jìn)行40個(gè)cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例1中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量為1，而實(shí)施例1中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量高達(dá)5.6，較對(duì)比例1提高了460％，可見，實(shí)施例1可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因的高表達(dá)；hplc檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例1中，羅漢果甜苷v含量為0.72％，而實(shí)施例1中，羅漢果甜苷v含量高達(dá)1.81％，較對(duì)比例1提高了151.39％，可見，實(shí)施例1還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。
實(shí)施例2
一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為400μmol/l，滅菌并冷卻至26℃；固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中，置于相對(duì)濕度66％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度21℃條件下培養(yǎng)30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成400μmol/l的溶液，噴灑于授粉后30d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d。
同時(shí)設(shè)置對(duì)比例2，
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
2)不對(duì)羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實(shí)施例1一致。
(3)qrt-pcr檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)。
采集果實(shí)，挑取果肉，切成4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。
采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。
將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應(yīng)條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內(nèi)參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應(yīng)條件為95℃(30s)，接著進(jìn)行40個(gè)cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例2中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量為1，而實(shí)施例2中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量高達(dá)15.3，較對(duì)比例2提高了1430％，可見，實(shí)施例2可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因的高表達(dá)；hplc檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例2中，羅漢果甜苷v含量為0.72％，而實(shí)施例2中，羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.72％，較對(duì)比例2提高了277.78％，可見，實(shí)施例2還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。
實(shí)施例3
一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為225μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃；固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中，置于相對(duì)濕度63％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度25℃條件下培養(yǎng)30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成225μmol/l的溶液，噴灑于授粉后25d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d。
同時(shí)設(shè)置對(duì)比例3，
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
2)不對(duì)羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實(shí)施例1一致。
(3)qrt-pcr檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)。
采集果實(shí)，挑取果肉，切成3mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。
采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。
將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應(yīng)條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內(nèi)參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應(yīng)條件為95℃(30s)，接著進(jìn)行40個(gè)cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例3中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量為1，而實(shí)施例3中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量高達(dá)20.7，較對(duì)比例3提高了1970％，可見，實(shí)施例3可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因的高表達(dá)；hplc檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例3中，羅漢果甜苷v含量為0.76％，而實(shí)施例3中，羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.96％，較對(duì)比例3提高了289.47％，可見，實(shí)施例3還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。
實(shí)施例4
一種促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為100μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃；固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中，置于相對(duì)濕度64％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度24℃條件下培養(yǎng)30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成300μmol/l的溶液，置于冰箱中降溫，使茉莉酸甲酯的溫度降至8～12℃，再噴灑于授粉后23d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d。同時(shí)，還采用注射的方式將茉莉酸甲酯注射入羅漢果植株的主莖中，注射量為6～15ml，注射的速率為3～5ml/h。
同時(shí)設(shè)置對(duì)比例4
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
2)不對(duì)羅漢果植株噴灑和注射茉莉酸甲酯；其他條件與實(shí)施例4一致。
(3)qrt-pcr檢測(cè)ugt71v1基因的表達(dá)。
采集果實(shí)，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。
采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。
將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應(yīng)條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內(nèi)參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應(yīng)條件為95℃(30s)，接著進(jìn)行40個(gè)cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例4中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量為1，而實(shí)施例4中，羅漢果ugt71v1基因的表達(dá)量高達(dá)20.1，較對(duì)比例4提高了1910％，可見，實(shí)施例4可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因的高表達(dá)；hplc檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比例4中，羅漢果甜苷v含量為0.76％，而實(shí)施例4中，羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.87％，較對(duì)比例4提高了277.63％，可見，實(shí)施例4還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。
這里說明的模塊數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡(jiǎn)化本發(fā)明的說明的。對(duì)本發(fā)明的促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法的應(yīng)用、修改和變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。
sequencelisting
<110>韋榮昌
<120>促進(jìn)羅漢果ugt71v1基因表達(dá)的方法
<130>2016
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