本發(fā)明涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液組合物及其用途，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，mscs)是一類來源于中胚層及外胚層的多能干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能。研究證明，間充質(zhì)干細(xì)胞可分化成為脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，具有很好的損傷修復(fù)能力。間充質(zhì)干細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，主要參與骨髓造血干細(xì)胞的定向歸巢及穩(wěn)態(tài)的維持。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞除具有多向分化潛能外，還具有很好的免疫調(diào)節(jié)特性，因此而被用于諸如移植物抗宿主(gvhd)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎，自身免疫性腸炎等多種炎癥性疾病等治療，臨床應(yīng)用市場巨大。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一類極具應(yīng)用價(jià)值的間充質(zhì)干細(xì)胞，其來源于產(chǎn)婦廢棄胎盤組織。相比傳統(tǒng)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不受個(gè)體條件影響，更具有采集方便，來源豐富，以及特性均一等特點(diǎn)。大量研究已嘗試應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療多種疾病，并取得了理想的療效。將優(yōu)質(zhì)低代數(shù)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行凍存，在必要時(shí)進(jìn)行復(fù)蘇擴(kuò)增是間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的必經(jīng)程序。在凍存過程中有效保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞活性，保障間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)的活率是間充質(zhì)干細(xì)胞凍存保護(hù)液及操作流程在設(shè)計(jì)時(shí)考慮的最終目的。通過凍存復(fù)蘇后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老及病變引起的組織器官損傷修復(fù)?，F(xiàn)有技術(shù)中使用的間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液多含有胎牛血清，胎牛血清中富含多種細(xì)胞營養(yǎng)因子，可用于細(xì)胞培養(yǎng)及凍存，能長期保持細(xì)胞活力。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞在接觸胎牛血清時(shí)會(huì)內(nèi)吞血清物質(zhì)，當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞回輸人體后可由異源蛋白引起過敏反應(yīng)，在使得間充質(zhì)干細(xì)胞移植后成功率降低的同時(shí)，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，嚴(yán)重的可引起過敏性休克。另外，優(yōu)質(zhì)胎牛血清多源于進(jìn)口，價(jià)格昂貴的同時(shí)，面臨著攜帶瘋牛病病毒的風(fēng)險(xiǎn)，因此胎牛血清為或臨床使用批準(zhǔn)，只能用于基礎(chǔ)科研。公開號(hào)為cn101919378b的中國發(fā)明專利申請，公開了一種直接靜脈應(yīng)用的間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液，相關(guān)操作步驟包括:1)將人ab血置于無菌離心管中，在1000～1200rpm條件下離心15分鐘；2)吸取上清液，轉(zhuǎn)移入新的離心管中，在4000g條件下離心20分鐘，再次取出上清即為凍存用人ab血漿；3)將二甲基亞砜(dmso)、凍存用人ab血漿、勃脈力a注射液按體積比1:3:6混合均勻，即為間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液。由該專利文件的實(shí)施例表1可見，經(jīng)該凍存液i和ii分別凍存細(xì)胞1、2、3個(gè)月后復(fù)蘇檢測，凍存液i的細(xì)胞活率依次為96％、92.6％和89％，其細(xì)胞活率降低率為3.5％/月，凍存液ii細(xì)胞活率依次為97.4％，95％和為94.7％，其細(xì)胞活率降低率為1.35％/月，該申請公開的凍存液雖然可以直接靜脈輸注，但細(xì)胞活率維持時(shí)間較短。并且，該間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液中含有人ab血漿，其中大量成分未知，且存在個(gè)體差異，無法保證細(xì)胞凍存的標(biāo)準(zhǔn)化及穩(wěn)定性，用于異體輸注存在安全隱患。另外，健康血漿來源少，成本高，難以大規(guī)模應(yīng)用。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞凍存液難以有效維持間充質(zhì)干細(xì)胞活率，且不具備臨床使用的條件。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明提供一種符合臨床使用要求，且能有效保證臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞活力的凍存液級(jí)凍存方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液組合物，其包括按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)的如下組分：復(fù)方右旋糖酐40注射液：30～80％；20wt％人血清白蛋白：10～50％；dmso：5～20％；其中，所述20wt％人血清白蛋白的溶劑為生理鹽水。作為優(yōu)選方案，各所述組分的體積百分?jǐn)?shù)分別為：復(fù)方右旋糖酐40注射液：65％；20％人血清白蛋白：25％；dmso：10％。一種如前述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液組合物在制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中的用途。作為優(yōu)選方案，包括如下步驟：利用新生兒臍帶血提取充質(zhì)干細(xì)胞；將所述充質(zhì)干細(xì)胞用權(quán)利要求1所述的凍存保護(hù)液組合物進(jìn)行重懸，得到的細(xì)胞懸液。作為優(yōu)選方案，還包括將所述細(xì)胞懸液進(jìn)行凍存的步驟，具體為：將細(xì)胞懸液放入梯度降溫盒中，-80℃冰箱過夜，第2天放入液氮罐長期保存。作為優(yōu)選方案，所述充質(zhì)干細(xì)胞的重懸濃度為1×105～1×108個(gè)/ml。作為優(yōu)選方案，所述充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法為：無菌條件下取新鮮新生兒臍帶，并將所述臍帶進(jìn)行預(yù)處理成組織塊；將所述組織塊進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，用胰酶進(jìn)行消化，離心收集充質(zhì)干細(xì)胞。作為優(yōu)選方案，所述臍帶預(yù)處理的方法為：將新鮮新生兒臍帶剪成1～2cm臍段，剔除血管，用d-pbs漂洗凈血跡，再剪成0.125cm3組織塊。本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液所含成分都為臨床藥物(復(fù)方右旋糖酐40注射液，20％人血清白蛋白)或臨床使用級(jí)(dmso)。其中復(fù)方右旋糖酐40注射液含右旋糖酐，是理想的血漿替代物，可參與提高凍存體系中的膠體滲透壓。同時(shí)，右旋糖酐屬于非滲透性抗凍劑，還能降低溶液中低分子溶質(zhì)(電解質(zhì))濃度，減輕鹽損傷；人血清白蛋白屬于非滲透性抗凍劑，可降低凍存保護(hù)液中自由水的含量，減少冰晶的形成，同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷，大大提高細(xì)胞存活率；dmso(二甲基亞砜)作為滲透型細(xì)胞保護(hù)劑能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，降低冰點(diǎn)、延緩凍存過程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液，可以長時(shí)間維持間充質(zhì)干細(xì)胞的活性及生物學(xué)活性，不含細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、人血漿等不安全成分。所有成分為臨床藥物復(fù)方右旋糖酐40注射液，20％人血清白蛋白)或臨床使用級(jí)(二甲基亞砜(ups臨床級(jí)))，可使凍存復(fù)蘇的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞滿足臨床使用要求的同時(shí)，保證了臨床標(biāo)準(zhǔn)化間充質(zhì)干細(xì)胞凍存體系的穩(wěn)定性。安全有效，制備方法簡單，具有良好的臨床應(yīng)用前景。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：圖1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存前生長形態(tài)；圖2本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞活率；圖3本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液及對照組凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞生長形態(tài)；圖4凍存前后臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線；圖5凍存前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力圖；圖6本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后成脂分化能力圖；圖7凍存前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力圖；圖8本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后成骨分化能力圖；圖9本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面cd45檢測結(jié)果；圖10本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面cd31檢測結(jié)果；圖11本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面hla-dr檢測結(jié)果；圖12本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面cd34檢測結(jié)果；圖13本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面cd90檢測結(jié)果；圖14本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面cd105檢測結(jié)果；圖15本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存1年復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面cd73檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中涉及的主要儀器及試劑:1)儀器：離心機(jī)eppendorf5810r；co2培養(yǎng)箱thermo8000；流式細(xì)胞儀beckmancytoflex；細(xì)胞計(jì)數(shù)countstarbiotech；倒置相差顯微鏡奧林巴斯ckx412)試劑:復(fù)方右旋糖酐40注射液(福他樂):購自西安萬隆制藥有限責(zé)任公司20％人血清白蛋白：購自baxterag(百特中國)dmso(ups臨床級(jí))購自德國wak-chemielg-dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10％胎牛血清購自gibcod-pbs購自gibco0.25％胰酶-0.38g/ledta溶液購自gibco0.04％臺(tái)盼藍(lán)染色液購自gibco人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化試劑盒購自gibco人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化試劑盒購自gibco茜素紅(alizarinreds)購自sigma-aldrich油紅o(oilredo)購自sigma-aldrich多聚甲醛購自sigma-aldrich流式染色抗體(fitc標(biāo)記annexin5，pe標(biāo)記抗cd45、cd31、cd34、hla-dr、cd90、cd73，cd105)以及7-aad染料購自ebioscience。實(shí)施例1本實(shí)施例涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液的制備，具體包括如下步驟：1)如表1所示凍存液配方，取復(fù)方右旋糖酐40注射液、20wt％人血清白蛋白，dmso混合，加入密度為5×106/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成細(xì)胞懸液，即可。表1.凍存液配方表對照組：取40mllg-dmem培養(yǎng)基(40％)與50ml胎牛血清(50％))混勻，加入臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至細(xì)胞密度為5×106/ml，再加入10mldmso，即可。對照組的配方是國內(nèi)作為常用的間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液配方。2)檢測復(fù)蘇后臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞活率取凍存前細(xì)胞檢測細(xì)胞活率；將本發(fā)明制備的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存懸液以及對照組細(xì)胞，通過程控降溫后保存于液氮罐里，凍存1年后，迅速在37℃水浴復(fù)蘇后，檢測細(xì)胞活率。檢測方法為臺(tái)盼藍(lán)經(jīng)典染色法：(總細(xì)胞數(shù)一臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞)/總細(xì)胞數(shù)％或annexinv以及7-aad流式染色檢測凋亡細(xì)胞。3)結(jié)果表2.細(xì)胞活率檢測結(jié)果組別細(xì)胞活率％凍存前97.3對照組93.4191.2295.8393.7492.3由表2可見，本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞一年以后復(fù)蘇，細(xì)胞活率均在91.2％之上，與凍存前相比，細(xì)胞活率最多僅下降了6.1％/年，細(xì)胞活率降低率最多僅為0.51％/月，下降幅度極低；在本發(fā)明優(yōu)選范圍內(nèi)，進(jìn)一步提高細(xì)胞活率，降低生產(chǎn)成本，且最優(yōu)保存液的ph、滲透壓接近人體的ph、滲透壓，更為安全；其中，配方2的細(xì)胞活率最高，為95.8％，ph為6.7～6.9，滲透壓為340～380mosmol/l最接近人體ph和滲透壓，故配方安全有效，為最佳配比。證明本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液可以長時(shí)間維持細(xì)胞活率。在此基礎(chǔ)上，選取最優(yōu)配比凍存液配方進(jìn)一步研究。實(shí)施例2本實(shí)施例涉及一種凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液的制備方法，包括如下步驟：1)無菌條件下取新鮮新生兒臍帶，將臍帶剪成1～2cm臍段，剔除血管，用d-pbs洗凈血跡，再剪成0.125cm3組織塊。用無菌鑷夾取吸取組織塊均勻散布在10cm培養(yǎng)皿中。37℃，5％co2培養(yǎng)箱孵育30min以使組織塊黏貼在培養(yǎng)皿壁上。向每個(gè)培養(yǎng)皿中滴加10ml完全培養(yǎng)基(注意沿皿壁小心滴加，勿使沖動(dòng)組織塊)。37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)，5天(d6)后半量換液。再過5天后，夾去組織塊的同時(shí)，再次半量換液(此時(shí)已有細(xì)胞明顯爬出)。之后每3天換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8天，待細(xì)胞達(dá)到約80～90％后可進(jìn)行細(xì)胞傳達(dá)培養(yǎng)或凍存。2)棄去培養(yǎng)皿中上清，d-pbs沖洗兩次，用0.25％胰酶，1min，室溫消化細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化，200g，5min離心收集細(xì)胞。3)按體積比例將65％復(fù)方右旋糖酐40注射液(福他樂)、25％人血清白蛋白，以及10％dmso混合配置成為凍存液，按1×105～1×108/ml濃度重懸臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，得細(xì)胞懸液。4)本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存保護(hù)液凍存獲得的細(xì)胞，放入梯度降溫盒中，-80℃冰箱過夜，第2天放入液氮罐長期保存。實(shí)施例3本實(shí)施例涉及前述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床凍存保護(hù)液凍存細(xì)胞1年后細(xì)胞特性檢測按照實(shí)施例1中最優(yōu)配方3配置凍存液并凍存另一批次臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，凍存1年后，37℃水浴復(fù)蘇后，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、成脂成骨分化，以及表面標(biāo)志物檢測。對照組同實(shí)施例11)細(xì)胞形態(tài)觀察復(fù)蘇后，將細(xì)胞加入10cm培養(yǎng)皿，并加入完全培養(yǎng)基37℃，5％co2培養(yǎng)24h后顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)。2)細(xì)胞生長曲線將凍存前細(xì)胞，本發(fā)明凍存液凍存細(xì)胞注射液和對照組復(fù)蘇后細(xì)胞，分別以2×104個(gè)接種在t25培養(yǎng)瓶中，每個(gè)組別接種21瓶，分別每天每個(gè)組細(xì)胞進(jìn)行三個(gè)培養(yǎng)瓶臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)，取其平均值，進(jìn)行生長曲線的繪制。沒有計(jì)數(shù)的培養(yǎng)瓶每3天更換一次培養(yǎng)基。(見圖4)3)細(xì)胞分化能力檢測將凍存前細(xì)胞，本發(fā)明凍存液凍存細(xì)胞注射液和對照組復(fù)蘇后細(xì)胞，分別以2×105個(gè)接種于6孔板中，待長至70％融合度時(shí)，分別加入成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每4天換液一次，14天后用油紅o進(jìn)行成脂分化染色，21天后用茜素紅s進(jìn)行成骨分化染色。4)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測將凍存前細(xì)胞，本發(fā)明凍存液凍存細(xì)胞注射液和對照組復(fù)蘇后細(xì)胞，分別進(jìn)行pe標(biāo)記抗cd45、cd31、cd34、hla-dr、cd73、cd105，cd90抗體染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。5)檢查結(jié)果如圖1-2所示，本發(fā)明凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1年后復(fù)蘇，細(xì)胞形態(tài)與凍存前以及對照組細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯變化，均呈梭形，折光度高，分布均一。由圖3，及表2可以見，與凍存前和對照組相比，本發(fā)明凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1年后復(fù)蘇，增殖能力沒有明顯變化。如圖5～8所示，本發(fā)明凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1年后復(fù)蘇，其成脂、骨分化能力與凍存前以及對照組細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯變化，均出現(xiàn)大量的脂肪滴和鈣堆積。仍然具有成脂、骨分化能力。如圖9～15所示，本發(fā)明凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1年后復(fù)蘇48小時(shí)后的細(xì)胞高表達(dá)cd90、cd105、cd73，而不表達(dá)cd31、cd34、cd45、hla-dr，符合人間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用本發(fā)明凍存液凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)、表型，增殖、分化能力均未受到影響；本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液可以長時(shí)間維持細(xì)胞活率，臨床應(yīng)用非常有效方便。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。當(dāng)前第1頁12