本發(fā)明屬于細(xì)胞低溫凍存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種冷凍雪旺細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)的修復(fù)和再生一直是生物學(xué)和組織工程的研究熱點(diǎn)，而雪旺細(xì)胞(schwanncell)在神經(jīng)的再生方面起到了重要的作用。因此許多相關(guān)的的研究都需要用到雪旺細(xì)胞，那么如何體外大量的存儲(chǔ)雪旺細(xì)胞就成了一大難題，而低溫凍存是目前最常見且有效的保存方法。

低溫凍存是將細(xì)胞置于在超低溫(通常為-80℃或更低)環(huán)境中，抑制細(xì)胞的新陳代謝以達(dá)到長期儲(chǔ)存的目的。目前，低溫凍存技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用到干細(xì)胞、血紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、精子、卵母細(xì)胞、骨骼細(xì)胞、皮膚、角膜等細(xì)胞和組織的保存過程中。關(guān)于細(xì)胞的低溫凍存國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。低溫凍存的方法主要有程序化慢速凍存和玻璃化凍存兩種，在冷凍過程中的損傷主要由如下兩個(gè)的因素造成：(1)溶液損傷：降溫過程中細(xì)胞外溶液中水先結(jié)晶，使得細(xì)胞外液滲透壓加大，細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)大量滲透到細(xì)胞外溶液中，導(dǎo)致細(xì)胞脫水急劇收縮，造成細(xì)胞損傷甚至死亡；(2)細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷：同樣在降溫過程中，當(dāng)溫度達(dá)到細(xì)胞內(nèi)液的冰點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液中的水會(huì)開始結(jié)晶，對細(xì)胞造成不可避免的損傷，而冷凍保護(hù)劑可以減少細(xì)胞內(nèi)的含水量起到保護(hù)細(xì)胞的作用?，F(xiàn)階段致力于優(yōu)化冷凍方案的研究，尋找到一種安全、有效、簡便的低溫凍存方法。

冷凍保護(hù)劑指在細(xì)胞或組織低溫凍存時(shí)保護(hù)細(xì)胞或組織的免受損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑按照保護(hù)機(jī)理的不同可以分為滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑兩種。滲透性冷凍保護(hù)劑(permeablecryoprotectants，pc)又稱“胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑”，它可以滲透到細(xì)胞內(nèi)部，一般是小分子物質(zhì)，容易滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞內(nèi)的大部分水置換出來，降低細(xì)胞外溶液的電解質(zhì)濃度，使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓減小，避免細(xì)胞脫水過多，同時(shí)它還可以使細(xì)胞內(nèi)部溶液達(dá)到玻璃化所需要的濃度。常用的滲透性冷凍保護(hù)劑有二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇、甘油等。非滲透性冷凍保護(hù)劑(impermeablecryoprotectants，ipc)又稱“細(xì)胞外液冷凍保護(hù)劑”，這種冷凍保護(hù)劑主要是大分子物質(zhì)，它不能滲透到細(xì)胞內(nèi)部，而是在細(xì)胞外的溶液中提高其滲透壓，降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞或組織的目的。常見的非滲透性冷凍保護(hù)劑有蔗糖、海藻糖、葡萄糖、聚二乙醇等大分子物質(zhì)和糖類。非滲透性冷凍保護(hù)劑一般是生物相容性良好沒有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，因此通常將其和滲透性冷凍保護(hù)劑共同作用，一方面可以減少滲透性冷凍保護(hù)劑的用量，另一方面可以提高細(xì)胞和組織的保護(hù)效果。

超分子凝膠是一種物理交聯(lián)凝膠，它是由少量的低分子凝膠因子通過分子間的非共價(jià)作用在介質(zhì)(水或有機(jī)溶劑)中自組裝形成的。因此超分子凝膠一般具有良好的可降解性和觸變性，且是可逆的；由于非共價(jià)鍵的活化能相對較低，在受到外界環(huán)境的刺激后，超分子凝膠容易做出相應(yīng)的響應(yīng)。如通過氫鍵作用形成的超分子凝膠具有溫度響應(yīng)性；通過靜電作用形成的超分子凝膠對ph和電解質(zhì)濃度敏感等。

超分子凝膠可用于制備復(fù)合材料、生物傳感器、載藥材料等領(lǐng)域。但鮮見將超分子凝膠體系用于細(xì)胞的低溫凍存的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種利用新型復(fù)合低溫凍存體系冷凍雪旺細(xì)胞的方法，該體系能減小雪旺細(xì)胞在凍存過程中受到的損傷，提高其復(fù)蘇后的存活率并維持細(xì)胞功能，從而起到有效的冷凍保護(hù)作用。

為達(dá)到上述目的，采用技術(shù)方案如下：

復(fù)合低溫凍存體系冷凍雪旺細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

1)將氨基酸類凝膠因子加熱溶于細(xì)胞培養(yǎng)基中，過濾、除菌，用含有凝膠因子的細(xì)胞培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸浮液；

2)在0-4℃下形成超分子凝膠；

3)滴加含有復(fù)合冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基，待體系達(dá)到溶脹平衡；所述復(fù)合冷凍保護(hù)劑是由滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑的混合；

4)放入凍存管在程序凍存盒冷凍，再將凍存管移入液氮中凍存。

按上述方案，所述氨基酸類凝膠因子按以下方法制備而來：

以boc-l-酪氨酸甲酯通過烷基化反應(yīng)制備得到十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯(bdte)；

十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯通過水解反應(yīng)制備得到十二烷基-boc-l-酪氨酸(bdt)，即為所述的氨基酸類凝膠因子。

按上述方案，所述的細(xì)胞培養(yǎng)基為rpmi1640培養(yǎng)基中加入10vol％胎牛血清和1vol％雙抗后制備成的細(xì)胞全培養(yǎng)基。

按上述方案，所述的滲透性冷凍保護(hù)劑為二甲基亞砜，非滲透性冷凍保護(hù)劑為海藻糖，二者終濃度分別為7.5～8.5vol％和0.045～0.055mol/l。

按上述方案，步驟3先滴加含有非滲透性冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基，再滴加含有滲透性冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。

運(yùn)用于細(xì)胞低溫凍存過程中凍存保護(hù)劑添加時(shí)的k-k模型，有兩個(gè)基本假設(shè)：(1)細(xì)胞內(nèi)液是理想稀溶液；(2)細(xì)胞膜是均勻半透膜。k-k模型可以用以下公式表示：

其中，vc表示細(xì)胞體積，lp表示細(xì)胞膜對于水的滲透系數(shù)，ps表示細(xì)胞膜對于凍存保護(hù)劑的滲透系數(shù)，ac表示細(xì)胞膜的表面積，r表示理想氣體常數(shù)，t表示絕對溫度，ns表示細(xì)胞內(nèi)溶液的同滲重摩，表示細(xì)胞內(nèi)外溶液的平均同滲重摩，mn表示非滲透液體的同滲重摩，σ表示反射系數(shù)；下標(biāo)n表示溶質(zhì)，s表示凍存保護(hù)劑，上標(biāo)i表示細(xì)胞內(nèi)，e表示細(xì)胞外。

由于氨基酸類凝膠因子自組裝形成的超分子凝膠通常具有獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在滴加冷凍保護(hù)劑時(shí)，凝膠發(fā)生溶脹，隨著冷凍保護(hù)劑的滴加，達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)細(xì)胞被超分子凝膠所包裹，減小了細(xì)胞膜對水和冷凍保護(hù)劑的滲透系數(shù)，可以有效的減緩細(xì)胞體積的變化，減緩細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的劇烈變化，使得滲透性冷凍保護(hù)劑dmso滲透速率降低，減小了冷凍保護(hù)劑的滲透損傷，且由于非滲透性冷凍保護(hù)劑海藻糖的存在，使得細(xì)胞外液滲透壓提高，降低了冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，海藻糖還能在細(xì)胞外形成一層保護(hù)膜，同時(shí)減小了細(xì)胞受到的滲透損傷和冰晶損傷；在降溫和復(fù)溫過程中，因?yàn)槌肿幽z體系在空間上的限制，冰晶的生長和再結(jié)晶受到了抑制，從而減小了冰晶損傷。

滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑的共同使用，一方面可以降低有毒的滲透性冷凍保護(hù)劑dmso的用量，另一方面可以提高細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果。

先滴加含有非滲透性冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基，再滴加含有滲透性冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。滴加非滲透性冷凍保護(hù)劑后，一方面增加了細(xì)胞外溶液的滲透壓，另一方面非滲透性冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞外形成了一層保護(hù)膜，與凝膠共同保護(hù)細(xì)胞；在滴加滲透性冷凍保護(hù)劑時(shí)，由于細(xì)胞外液滲透壓加大，更加利于冷凍保護(hù)劑滲透進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)由于有凝膠和非滲透性冷凍保護(hù)劑所形成的的雙層保護(hù)膜，大大降低了滲透性冷凍保護(hù)劑造成的滲透損傷。

氨基酸類凝膠因子自組裝形成的超分子凝膠具有熱可逆性，因此在復(fù)溫過程中，溫度達(dá)到相轉(zhuǎn)變溫度以上時(shí)，超分子凝膠從凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，通過離心即可和細(xì)胞分離，在不增加操作的同時(shí)不會(huì)影響復(fù)溫后細(xì)胞的增殖和分化。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

氨基酸類凝膠因子自組裝形成的超分子凝膠是一種物理交聯(lián)凝膠，它是由少量的低分子凝膠因子通過分子間的非共價(jià)作用在介質(zhì)(水、有機(jī)溶劑)中自組裝形成的。因此超分子凝膠一般具有良好的可降解性和觸變性，且是可逆的；由于非共價(jià)鍵的活化能相對較低，在受到外界環(huán)境的刺激后，超分子凝膠容易做出相應(yīng)的響應(yīng)。同時(shí)本發(fā)明所用的氨基酸類凝膠因子具有良好的生物相容性。

由于氨基酸類凝膠因子自組裝形成的超分子凝膠獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在含有凝膠因子的細(xì)胞懸浮液形成凝膠后滴加冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞被超分子凝膠所包裹，使得冷凍保護(hù)劑滲透速率降低，減緩了細(xì)胞體積的變化細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的劇烈變化，減小了冷凍保護(hù)劑的滲透損傷，由于非滲透性冷凍保護(hù)劑的存在，同時(shí)減低了滲透損傷和冰晶損傷；在降溫和復(fù)溫過程中，因?yàn)槟z體系在空間上的限制，冰晶的生長和再結(jié)晶受到了抑制，從而減小了冰晶損傷；超分子凝膠具有熱可逆性，因此在復(fù)溫過程中，溫度達(dá)到相轉(zhuǎn)變溫度以上時(shí)，超分子凝膠從凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，通過離心即可和細(xì)胞分離，在不增加操作的同時(shí)不會(huì)影響復(fù)溫后細(xì)胞的增殖和分化。

在超分子凝膠體系的基礎(chǔ)上同時(shí)使用滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑，其中非滲透性冷凍保護(hù)劑一般是生物相容性良好沒有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，因此將其和滲透性冷凍保護(hù)劑共同作用，一方面可以減少滲透性冷凍保護(hù)劑的用量，另一方面可以提高細(xì)胞的保護(hù)效果，所以兩種冷凍保護(hù)劑的聯(lián)用可以在低溫凍存過程中起到更好的保護(hù)效果。

附圖說明

圖1：超分子凝膠體系室溫(25℃)下在載玻片上的微觀形貌圖；

圖2：超分子凝膠體系的相轉(zhuǎn)變溫度與凝膠因子濃度的關(guān)系；

圖3：復(fù)合低溫凍存體系冰水浴(0～4℃)中在載玻片上的微觀形貌圖；

圖4：復(fù)合低溫凍存體系的dsc測試結(jié)果；

圖5：對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率對比；

圖6：mtt檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。下面的實(shí)施例只是對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但并非窮舉，不對本發(fā)明做任何限制。

實(shí)施例1

超分子凝膠的制備及其性能：

1、制備凝膠因子bdt：

(1)十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯(bdte)的合成(boc-l-酪氨酸甲酯烷基化)：

稱取3.998g(0.0135mol)boc-l-酪氨酸甲酯置于25ml圓底燒瓶中，加入10mldmf，待原料完全溶解后，再加入3.7113gk2co3(0.027mol)作為縛酸劑，后加入4ml溴代十二烷(0.0167mol)，室溫反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后加20ml水洗滌，抽濾、洗滌濾餅、真空干燥24h后得到得白色固體。無水乙醇(20ml)重結(jié)晶1次，得純凈的白色固體。

(2)bdt的合成(bdte的水解反應(yīng))：

將0.5007g(0.0011mol)bdte置于25ml燒瓶中用10ml乙醇溶解，在冰水浴下逐滴加入1mol/l的naoh溶液1.7ml(0.0017mol)，在0℃左右反應(yīng)1h，室溫反應(yīng)5h。在強(qiáng)烈攪拌下向反應(yīng)體系中逐滴加入0.2mol/l的冰鹽酸(25ml)溶液至ph為1～2，抽濾，真空干燥24h得0.4858g白色固體。

該凝膠因子可以自組裝形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子凝膠體系，細(xì)胞被其包裹，使得冷凍保護(hù)劑滲透速率降低，減小了冷凍保護(hù)劑的滲透損傷；在降溫和復(fù)溫過程中，冰晶的生長和再結(jié)晶受到了抑制，從而減小了冰晶損傷。

2.超分子凝膠形貌表征所需溶液：將5mgbdt加入到1mlrpmi1640培養(yǎng)基中，置于60℃水浴中溶解，待其完全溶解后，冷卻至室溫，將其滴在載玻片上，置于光學(xué)顯微鏡下觀察微觀形貌，圖1即為超分子凝膠體系室溫(25℃)下在載玻片上的微觀形貌圖，可以看到凝膠因子在細(xì)胞培養(yǎng)液rpmi1640中自組裝形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子凝膠，該結(jié)構(gòu)可以在冷凍過程中包裹細(xì)胞，起到減少冰晶損傷的作用。

3.取一定量的bdt加入到1mlrpmi1640培養(yǎng)基中，置于60℃水浴中溶解，分別配置成1g/l、1.5g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、8g/l的bdt培養(yǎng)基溶液，并用落球法測定其相轉(zhuǎn)變溫度，測試結(jié)果如圖2所示。bdt濃度在1g/l至5g/l時(shí)相轉(zhuǎn)變溫度急劇增加，在濃度達(dá)到5g/l后，增加趨于平緩。隨著凝膠因子濃度的增加，纖維數(shù)量增加，相互纏繞的機(jī)會(huì)增多，形成更加致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使得超分子凝膠體系的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而使超分子凝膠體系的相轉(zhuǎn)變溫度隨之增加。

實(shí)施例2

復(fù)合低溫凍存體系的制備及其性能：

取實(shí)施例1所得bdt加入到1mlrpmi1640培養(yǎng)基中，置于60℃水浴中溶解，待其完全溶解后滴加一定量含有復(fù)合冷凍保護(hù)劑的rpmi1640培養(yǎng)基溶液，制備成復(fù)合低溫凍存體系待用。配置的復(fù)合體系的最終濃度為1.5g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖，并在冰水浴(0～4℃)中使用光學(xué)顯微鏡觀察其微觀形貌，如圖3所示。凝膠因子在含有復(fù)合冷凍保護(hù)劑的rpmi1640培養(yǎng)基溶液中形成的超分子凝膠的微觀結(jié)構(gòu)有所不同，但仍呈現(xiàn)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在滲透性冷凍保護(hù)劑滲透時(shí)，由于細(xì)胞被超分子凝膠包裹住，滲透保護(hù)劑的滲透速度會(huì)大大降低，從而減小的滲透性冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞造成的損傷。

取3mg實(shí)施例1所得bdt加入到1mlrpmi1640培養(yǎng)基中，置于60℃水浴中溶解，待其完全溶解后分別滴加等體積(1ml)含有16vol％dmso和16vol％dmso、0.1mol/l海藻糖的rpmi1640培養(yǎng)基溶液，制備成最終濃度為1.5g/lbdt、8vol％dmso和1.5g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖的兩種低溫凍存體系，用于dsc測試。

測試結(jié)果如圖4，表明1.5g/lbdt、8vol％dmso低溫凍存體系和1.5g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖低溫凍存體系的冰點(diǎn)分別為-18.9℃和-19.8℃，說明海藻糖的添加可以降低整個(gè)體系的冰點(diǎn)。

實(shí)施例3

雪旺細(xì)胞的冷凍過程：

1.細(xì)胞培養(yǎng)基體系的配置：細(xì)胞培養(yǎng)基體系的配置：在rpmi1640培養(yǎng)基，加入10vol％胎牛血清和1vol％雙抗，制備成細(xì)胞的全培養(yǎng)基。將全培養(yǎng)基分為兩份，一份中加入實(shí)施例1所得bdt凝膠因子(濃度為1.5g/l)在60℃下溶解，待其完全溶解后過濾除菌，另一份不做任何處理，分別分裝后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.冷凍保護(hù)劑體系的配置：在全培養(yǎng)基中分別加入16vol％dmso、32vol％dmso、0.2mol/l海藻糖，0.22μm濾膜過濾除菌，分別分裝后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

3.雪旺細(xì)胞的冷凍過程：將處于對數(shù)期的細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化，分為三組1000r/m離心8min后去上清，對照組用全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，取0.5ml細(xì)胞懸浮液置于2ml凍存管中，在冰水浴(4℃)中平衡5min，待細(xì)胞懸浮液變?yōu)槟z態(tài)后滴加等體積(0.5ml)的含16vol％dmso的全培養(yǎng)基，每滴加一兩滴凍存管需晃動(dòng)幾下使dmso分散均勻，防止局部dmso濃度過大和溶解放熱過多對細(xì)胞造成損傷。實(shí)驗(yàn)組分為兩組，一組用含1.5g/lbdt的全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，取0.5ml細(xì)胞懸浮液置于2ml凍存管中，在冰水浴(4℃)下平衡5min，待細(xì)胞懸浮液變?yōu)槟z態(tài)后滴加等體積(0.5ml)的含16vol％dmso的培養(yǎng)基；另一組在冰水浴(4℃)下平衡5min，待細(xì)胞懸浮液變?yōu)槟z態(tài)后先滴加0.25ml含0.2mol/l海藻糖的全培養(yǎng)基，滴加完畢后再滴加0.25ml含32vol％dmso的全培養(yǎng)基，其他操作均相同，三組的凍存體系的最終濃度為對照組8vol％dmso，實(shí)驗(yàn)組0.75g/lbdt、8vol％dmso(bdt-dmso組)和0.75g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖(bdt-dmso-trehalose組)，凍存的細(xì)胞密度為1×10⁶cells/ml。在滴加完冷凍保護(hù)劑凍存體系達(dá)到溶脹平衡后將凍存管放置于程序降溫盒中，降溫盒置于-80℃的冰箱中，程序降溫盒可以使降溫速率保持在1℃/min。在-80℃冰箱中放置24h后，取出凍存盒，將三組凍存管移入到液氮中繼續(xù)冷凍3天。

實(shí)施例4

雪旺細(xì)胞的復(fù)溫過程：

在液氮中保存3天后，取出凍存管，在37℃恒溫水浴中震蕩5min，保證凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)。將凍存管中細(xì)胞懸浮液移到離心管中，加入適量培養(yǎng)基1000r/m離心8min去上清，為了徹底除去細(xì)胞懸浮液中的凝膠因子和冷凍保護(hù)劑，此步驟重復(fù)兩次。復(fù)溫后，調(diào)整細(xì)胞密度為6000cells/ml，將細(xì)胞接種到96孔板中，置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。上述所有操作均在潔凈工作臺(tái)中進(jìn)行，保證嚴(yán)格的無菌環(huán)境。

實(shí)施例5

雪旺細(xì)胞的檢測：

細(xì)胞存活率：使用細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒檢測。對復(fù)溫后的細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，并在熒光顯微鏡下觀察，可以直觀的看出細(xì)胞的存活情況。本實(shí)驗(yàn)采用hoechst33342和碘化丙啶(pi)雙染色方法。hoechst33342可以穿透正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞均可被染色，染色后凋亡細(xì)胞的熒光反應(yīng)會(huì)比正常細(xì)胞明顯。碘化丙啶(pi)不能穿透細(xì)胞膜，因此正常細(xì)胞不能被pi染色，而對于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，碘化丙啶(pi)可以進(jìn)入細(xì)胞將其染色。因此正常細(xì)胞表現(xiàn)為藍(lán)色熒光，壞死細(xì)胞表現(xiàn)為藍(lán)色熒光+紅色熒光，可以明顯的區(qū)分細(xì)胞的死活。

復(fù)溫后將雪旺細(xì)胞密度調(diào)整為6000cells/ml，每孔100μl接種到96孔板中，每組按冷凍方式不同分別接種六個(gè)孔，隨后將96孔板置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，吸走96孔板中的上清液，用pbs洗滌兩次，然后每孔加入200μl配制好的染色液，放置于4℃的環(huán)境中孵育20-30min后在熒光顯微鏡下觀察紅色和藍(lán)色熒光并拍照記錄，雪旺細(xì)胞存活率結(jié)果如圖5。

細(xì)胞的活性及增值：使用mtt比色法測試。mtt實(shí)驗(yàn)是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，mtt是一種顯色劑，具體結(jié)構(gòu)為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽，其顯色原理為mtt能氧化活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，自身變?yōu)椴蝗苡谒乃{(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。甲瓚能被二甲基亞砜(dmso)溶解，用酶標(biāo)儀在特定波長下測定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在細(xì)胞數(shù)量及檢測波長適宜時(shí)，吸光值的大小與細(xì)胞數(shù)成正比。

復(fù)溫后將雪旺細(xì)胞密度調(diào)整為6000cells/ml，每孔100μl接種到96孔板中，每組按冷凍方式不同分別接種六個(gè)孔，接3塊96孔板，隨后將96孔板置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)12h、1天、2天、3天、5天時(shí)取出一塊96孔板，每孔加入20μl配置好的mtt溶液，接著放入37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h后取出96孔板，吸走上清液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，待紫色結(jié)晶充分溶解后，將96孔板置于酶標(biāo)儀中，先用連續(xù)波長測定一個(gè)孔吸收曲線，找出吸收的峰值對應(yīng)的波長，接著用該波長測定吸光度。在培養(yǎng)過程中，若96孔板中培養(yǎng)基顏色變成黃色需要及時(shí)換液保證細(xì)胞的生長環(huán)境。

測試結(jié)果如圖6所示，在-80℃下冷凍24h后轉(zhuǎn)移至液氮中繼續(xù)冷凍3天復(fù)蘇后細(xì)胞在12h、1天、2天、3天、5天的mtt檢測結(jié)果。該方法凍存的雪旺細(xì)胞的形態(tài)與新鮮的雪旺細(xì)胞基本無差別，且存活率高達(dá)98.59％并能正常增殖，證明利用該新型復(fù)合低溫凍存體系凍存的雪旺細(xì)胞能夠保持其原有的生物學(xué)特性。采用本發(fā)明所提供的方法冷凍雪旺細(xì)胞后，在凍存過程中不僅減少了凍存保護(hù)劑的使用，降低了有毒試劑對細(xì)胞的毒害，而且改變了冷凍保護(hù)劑的添加方式，在形成凝膠后滴加冷凍保護(hù)劑使其達(dá)到溶脹平衡，減少了冷凍保護(hù)劑所造成的滲透損傷，同時(shí)凍存體系冰點(diǎn)的降低，減少了雪旺細(xì)胞受到的冷凍損傷；在復(fù)溫過程中，由于氨基酸類凝膠因子自組裝形成的超分子凝膠具有熱可逆性，凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，易于除去冷凍保護(hù)劑和氨基酸類凝膠因子，保證了雪旺細(xì)胞的完整性。