專利名稱：批量凍存動物細胞的裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種在一個凍存單位 中可大批量一步法凍存細胞的裝置及方法。
召 、曰 一 ， 背，技術(shù) 、、人， 、 、，
應(yīng)用于生物技術(shù)研究及生物制品生產(chǎn)行業(yè)。目前，人們對動物細胞及其培
養(yǎng)物的超低溫凍存主要采取如下方法將細胞用專用試劑(如胰蛋白酶、 EDTA等)消化分散，離心收集，再用專用的冷凍保護液稀釋到一定密度， 或直接用專用的冷凍保護液將消化好的細胞分散，分裝入專用凍存管中， 采取規(guī)定的程序?qū)龃婀苤鸺壱迫氩煌蜏靥荻鹊沫h(huán)境中(或使用程序冷 凍儀)，最終使凍存管所處環(huán)境的溫度至少達到-7(TC以下，通常凍存管最 終會投入液氮中長期保存。這種冷凍保存技術(shù)有兩個明顯的缺陷1、對于 需要大批量培養(yǎng)細胞的生物制品企業(yè)來說，每1個凍存單位(1支凍存管) 容積只有l(wèi)-5ml，所能凍存的細胞的量極其有限，每一支凍存管的細胞解 凍后往往只夠1個50-100ml的克氏瓶正常培養(yǎng)所需細胞量，而幾乎所有的 大型生物制品企業(yè)都用1萬ml以上的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞，有些甚至用生物反應(yīng) 器培養(yǎng)細胞，其單次接種1個培養(yǎng)單位所需細胞的量可能相當于幾十到幾 百個100ml克氏瓶培養(yǎng)的細胞量，因此，從一支凍存管的細胞擴繁至接種 1個轉(zhuǎn)瓶所需細胞量，通常至少需要15天的時間，至于擴繁到接種1個生 物反應(yīng)器所需細胞量，則需要時間更長，這么長的等待時間對企業(yè)來說是 極大的浪費；另外，當企業(yè)遭遇到大面積污染，或者偶然間獲得了某個新 產(chǎn)品生產(chǎn)權(quán)，而要想在瞬間將工廠的產(chǎn)能發(fā)揮到極致，靠凍存管的細胞擴 繁是無法達到目的的。因此改進現(xiàn)有的細胞凍存工具，大幅度增加單個凍 存單位的細胞凍存量，將能使生物制品企業(yè)提高效益、節(jié)約資源、減少損 失、搶抓機遇。2、細胞的凍存過程往往需要較復雜的程序，需要在不同溫 度下各放置一段時間，這對操作人員極不方便，往往造成在某一中間溫度 下放置時間過長而使一批凍存細胞報廢。因此，盡量使細胞一步進入超低 溫環(huán)境中保存，將會極大的方便操作人員的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題及缺點，提供批量凍存細胞
4以達到50-200ml,是凍存管的30-150倍；整套裝置在凍存細胞時可直接 投入液氮中或放入-7 (TC以下的冷凍設(shè)備中，無需放置于不同溫度下或使用 程序冷凍儀降溫。
批量凍存細胞的裝置，由細胞凍存袋、細胞凍存盒、細胞架組成，細 胞凍存袋放置在細胞架上，細胞架放置在細胞凍存盒內(nèi)，其特征在于所 述的細胞凍存袋為方形PVC材質(zhì)的塑料袋，細胞凍存袋有四種規(guī)格 5cm*5cm、 7cm*7cm、 9cm*9cm、 llcm*llcm,容納細月包懸液的量分別為50ml、 lOOml、 150ml、 200ml，每個細胞凍存袋的一邊都連接有一內(nèi)徑為0. 5cm、 長10-50cm的細管，為細胞懸液進出凍存袋的通道，與該細管同一壓邊上 留有一孔徑為0. 5cm的系繩孔，有一細繩從該孔中穿出，拴系細胞凍存袋， 細胞凍存袋由專業(yè)廠家生產(chǎn)，生產(chǎn)后做過無菌處理和密封包裝；所述的細 胞凍存盒為立方形聚碳酸酯材質(zhì)的塑料盒，盒壁厚度為2-3mm,其六個面 中的五個面為無縫連《^妄，剩下朝上的面是凍存盒的開口，開口上裝有盒蓋， 其四邊下側(cè)邊沿墊有密封條，盒蓋的一邊與盒體的一邊用活頁連接，其對 邊裝有卡扣，其作用是當盒蓋關(guān)上時保證整個凍存盒密封，以防液氮或冷 凍器具中的冷空氣直接進入冷凍盒內(nèi)，盒蓋上有一個吊耳，吊耳上系有系 繩，用以將細胞凍存盒吊于液氮罐或其他冷凍容器中；所述的細胞架為立 方形鋼架，由不銹鋼鋼絲焊*接而成，鋼架垂直面的四邊由四才艮直徑為4-6mm 的不銹鋼絲構(gòu)成主柱，鋼架水平面是直徑為2-3mm的不銹鋼絲焊接而成的 多層方形架，每個方形架的四個頂點分別與四根主柱焊接構(gòu)成整體，每個 方形架的上表面都鋪蓋一層0. 25,的不銹鋼薄板，是放置細胞凍存袋的地 方；各層方形架間的距離為3-5cm。細胞凍存盒的橫截面大小規(guī)格 7cm*7cm、 9cm*9cm、 llcm*llcm、 13cm*13cm，與之配套的細J包架4黃截面^L 才各分別為5cm*5cm、 7cm*7cm、 9cm*9cm、 llcm*llcm,分別適用于力文置50ml 、 lOOml、 150ml、 200ml的細胞凍存袋，細胞凍存盒的長度可以從6cm到60cm 取值，與之配套的細胞架的方形架層數(shù)可以從l到19層間取值，在實際應(yīng) 用中具體選用何種規(guī)格應(yīng)根據(jù)當時需要凍存的細胞量以及凍存容器的結(jié)構(gòu) 而定，總的原則是細胞凍存盒整體方便進出凍存容器，每個凍存袋所裝細 胞量能滿足解凍后接種一個培養(yǎng)單元(通常是一個轉(zhuǎn)瓶)所需細胞的量。
批量凍存細胞的方法，按以下步驟進行(1)、將轉(zhuǎn)瓶中大批量培養(yǎng)的 細胞用胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基吹打分散細胞或直接用冷凍保護液吹打 分散細胞，將分散后的細胞液分裝入離心管中離心，棄上清液；(2)、用冷 凍保護液重懸細胞，并調(diào)整細胞密度至1*106 -1*107個/1!11; (3)、將細胞 袋上的細管剪開，將細胞懸液從開口分裝入細胞凍存袋中，封住細管口，從細胞凍存袋的系繩孔上系上吊繩，繩的另一端系上標簽卡，卡上記錄細
胞的有關(guān)資料；(4)、然后將所有裝細胞懸液的細胞凍存袋放在細胞架的方 形架上，每個方形架上只能放置一個細胞凍存袋，打開細胞凍存盒的盒蓋， 把裝有細胞凍存袋的細胞架從細胞凍存盒的開口放入細胞凍存盒內(nèi)，蓋上 盒蓋，扣緊卡扣，在細胞凍存盒的系繩的末端系上標簽卡，卡記錄凍存細 胞的有關(guān)資料；(5)、將整個細胞凍存盒直接投入液氮罐或-70。C以下冷凍 設(shè)備中冷凍，24小時后，將細胞凍存袋從細胞凍存盒中取出裝入另外的容 器后(或直接)投入液氮中或-7(TC以下的冷凍設(shè)備中長期凍存，并將細胞 凍存袋的吊繩的另一端拉出液氮罐(或其他冷凍設(shè)備)口外；(6)、當需要 解凍細胞時，通過吊繩上的標簽找到所需細胞，并拉出細胞凍存袋后，立 即放入38。C-39。C的溫水中，溫水必須能浸沒細胞凍存袋，擺動細胞凍存 袋以加快解凍速度，并隨時注意水溫的變化，當水溫下降到36。C以下時應(yīng) 補加熱水使水溫上升到38°C-39°C，當細胞凍存袋中所有凝固物都融化為 液體后，把細胞凍存袋移入無菌操作臺，按無菌操作程序?qū)φ麄€細胞袋消 毒，剪開細胞凍存袋的細管，將細胞凍存袋中的細胞懸液分裝入離心管中， 離心，棄上清液，以后的操作與常規(guī)解凍細胞后的操作一致。
本發(fā)明的設(shè)計原理細胞的冷凍過程需要逐步降溫，為此人們釆取將細 胞懸浮于冷凍保護液之后，放置在不同溫度下分段降溫，或者用程序冷凍 儀按程序降溫。本發(fā)明將細胞懸浮于冷凍保護液后，直接放入密封的冷凍 盒中，由于裝細胞的容器不直接與超低溫環(huán)境接觸，冷凍盒中存留的空氣 起到了緩沖降溫的作用，使其按一定的程序自動降溫，保證了細胞的存活。
本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的裝置，其單個凍存單位也就是細胞凍 存袋凍存細胞懸液的體積可以達到50-200ml，是凍存管的30-150倍；2、 整套裝置在凍存細胞時可直接投入液氮中或放入-7(TC以下的冷凍設(shè)備中， 無需放置于不同溫度下或使用程序冷凍儀降溫。


圖1為本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明的細胞凍存袋結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為本發(fā)明的細胞架結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4為本發(fā)明的細胞凍存盒結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
結(jié)合實施例對本發(fā)明作進 一 步的描述。
如圖1、圖2、圖3、圖4所示，本發(fā)明的裝置由細胞凍存袋1、細胞 凍存盒2、細胞架9組成，細胞凍存袋1放置在細胞架9上，細胞架9放 置在細胞凍存盒2內(nèi)，所述的細胞凍存袋為方形PVC材質(zhì)的塑料袋，細胞凍、存袋有四種-見沖各5cm*5cm、 7cm*7cm、 9cm*9cm、 llcm*llcm，容纟內(nèi)纟田月包 懸液的量分別為50ml、 lOOml、 150ml、 200ml,每個細胞凍存袋的一邊都 連接有一內(nèi)徑為0. 5cm、長30cm的細管13，為細胞懸液進出凍存袋的通道， 與該細管同一壓邊上留有一孔徑為0. 5cm的系繩孔14，以便使用中將細胞 凍存袋投入液氮中時，系上細胞袋吊繩15，細胞凍存袋由專業(yè)無菌醫(yī)用器 材生產(chǎn)廠家生產(chǎn)，生產(chǎn)后做過無菌處理和密封包裝；所述的細胞凍存盒2 為立方形聚碳酸酯材質(zhì)的塑料盒，盒壁厚度為3mm,其六個面中的五個面 為無縫連接，剩下朝上的面是凍存盒的開口，開口上裝有盒蓋3,其四邊 下側(cè)邊沿墊有密封條4,盒蓋3的一邊與盒體的一邊用活頁5連接，其對 邊裝有卡扣6,其作用是當盒蓋關(guān)上時保證整個凍存盒密封，以防液氮或 冷凍器具中的冷空氣直接進入冷凍盒內(nèi)，盒蓋3上有一個吊耳7，吊耳7 上系上系繩8，用以將細胞凍存盒吊于液氮罐或其他冷凍容器中；所述的 細胞架9為立方形鋼架，由不4秀鋼鋼絲焊4妻而成，鋼架垂直面的四邊由四 根直徑為4mm的不銹鋼絲構(gòu)成主柱10,鋼架水平面是直徑為2mm的不銹鋼 絲焊接而成的多層方形架11，每個方形架11的四個頂點分別與四根主柱 10焊接構(gòu)成整體，每個方形架11的上表面都鋪蓋一層0. 25隱的不銹鋼薄 板12，是放置細胞凍存袋1的地方；各層方形架11間的距離為約3cm。細 胞凍存盒2的^黃截面大小^見格7cm*7cm、 9cm*9cm、 llcm*llcm、 13cm*13cm, 與之配套的細胞架4黃截面規(guī)4各分別為5cm*5cm、 7cm*7cm、 9cm*9cm、 llcm*llcm，分別適用于力文置50ml、 lOOml、 150ml、 200ml的細胞凍存袋， 細胞凍存盒的長度可以從6cm到60cm取值，與之配套的細胞架的方形架層 數(shù)可以從1到19層間取值，在實際應(yīng)用中具體選用何種規(guī)格應(yīng)根據(jù)當時需 要凍存的細胞量以及凍存容器的結(jié)構(gòu)而定，總的原則是細胞凍存盒整體方 便進出凍存容器，每個凍存袋所裝細胞量能滿足解凍后接種一個培養(yǎng)單元 (通常是一個轉(zhuǎn)瓶)所需細胞的量。
批量凍存細胞的方法，按以下步驟進行(1)、將轉(zhuǎn)瓶中大批量培養(yǎng)的 細胞用胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基吹打分散細胞或直接用冷凍保護液吹打 分散細胞，將分散后的細胞液分裝入離心管中離心，棄上清液；(2)、用冷 凍保護液重懸細胞，并調(diào)整細胞密度至1*106 -l"(T個/ml; (3)、將細胞 袋上的細管剪開，將細胞懸液從開口分裝入細胞凍存袋中，封住細管口， 從細胞凍存袋的系繩孔上系上吊繩，繩的另一端系上標簽卡，卡上記錄細 胞的有關(guān)資料；(4)、然后將所有裝細胞的細胞凍存袋放在細胞架的方形架 上，每個方形架上只能放置一個細胞凍存袋，打開細胞凍存盒的盒蓋，把 裝有細胞凍存袋的細胞架從細胞凍存盒的開口放入細胞凍存盒內(nèi)，蓋上盒蓋，扣緊卡扣，在細月包凍存盒的系繩的末端系上標簽卡，卡記錄凍存細月包
的有關(guān)資料；(5)、將整個細胞凍存盒直接投入液氮罐或-7(TC以下冷凍設(shè) 備中冷凍，24小時后，將細胞凍存袋從細胞凍存盒中取出裝入另外的容器 后或直接投入液氮中或-70。C以下冷凍設(shè)備中長期凍存，并將細胞凍存袋的 吊繩的另一端拉出液氮罐(或-7(TC以下冷凍設(shè)備)口外；(6)、當需要解 凍細胞時，通過吊繩上的標簽找到所需細胞，并拉出細胞凍存袋后立即放 入38。C-39。C的溫水中，溫水必須能浸沒細胞凍存袋，擺動細胞凍存袋以 加快解凍速度，并隨時注意水溫的變化，當水溫下降到36。C以下時應(yīng)補加 熱水使水溫上升到38°C-39°C，當細胞凍存袋中所有凝固物都融化為液體 后，把細胞凍存袋移入無菌操作臺，按無菌操作程序?qū)φ麄€細胞袋消毒， 剪開細胞凍存袋的細管，將細胞凍存袋中的細胞懸液分裝入離心管中，離 心，棄上清液，以后的搡作與常規(guī)解凍細胞后的操作一致。
權(quán)利要求
1、批量凍存細胞的裝置，由細胞凍存袋、細胞凍存盒、細胞架組成，細胞凍存袋放置在細胞架上，細胞架放置在細胞凍存盒內(nèi)，其特征在于所述的細胞凍存袋為方形PVC材質(zhì)的塑料袋，每個細胞凍存袋的一邊都連接有一內(nèi)徑為0.5cm、長10-50cm的細管，與該細管同一壓邊上留有一孔徑為0.5cm的系繩孔，并系上細胞袋吊繩；所述的細胞凍存盒為立方形聚碳酸酯材質(zhì)的塑料盒，盒壁厚度為2-3mm，其六個面中的五個面為無縫連接，剩下朝上的面是凍存盒的開口，開口上裝有盒蓋，其四邊下側(cè)邊沿墊有密封條，盒蓋的一邊與盒體的一邊用活頁連接，其對邊裝有卡扣，盒蓋上有一個吊耳，用以系上吊繩；所述的細胞架為立方形鋼架，鋼架垂直面的四邊由四根直徑為4-6mm的不銹鋼絲構(gòu)成主柱，鋼架水平面是直徑為2-3mm的不銹鋼絲焊接而成的多層方形架，每個方形架的四個頂點分別與四根主柱焊接構(gòu)成整體，每個方形架的上表面都鋪蓋一層0.25mm的不銹鋼薄板；各層方形架間的距離為3-5cm。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的批量凍存細胞的裝置，其特征在于所述細 月包凍存袋的*見才各有5cm*5cm、 7cm*7cm、 9cm*9cm或llcm*llcm，只于應(yīng)的纟田 胞架橫截面頭見才各分別為5cm*5cm、 7cm*7cm、 9cm*9cm或llcm*llcm,對應(yīng) 的細胞凍存盒的才黃截面大小夫見才各7cm*7cm、 9cm*9cm、 llcm*llcm、或 13cm*l3cm。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的批量凍存細胞的裝置，其特征在于細胞 架的方形架層數(shù)為1-19,對應(yīng)的細胞凍存盒的長度在6cm-60cm。
4、批量凍存細胞的方法，按以下步驟進行(1)、將轉(zhuǎn)瓶中大批量培 養(yǎng)的細胞用胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基吹打分散細胞或直接用冷凍保護液 吹打分散細胞，將分散后的細胞液分裝入離心管中離心，棄上清液；(2)、 用冷凍保護液重懸細胞，并調(diào)整細胞密度至1*1 06 -1*1 07個/1111; (3)、將 細胞袋上的細管剪開，將細胞懸液從開口分裝入細胞凍存袋中，封住細管 口，從細胞凍存袋的系繩孔上系上吊繩，繩的另一端系上標簽卡，卡上記 錄細胞的有關(guān)資料；(4)、然后將所有裝細胞的細胞凍存袋放在細胞架的方 形架上，每個方形架上只能放置一個細胞凍存袋，打開細胞凍存盒的盒蓋， 把裝有細胞凍存袋的細胞架從細胞凍存盒的開口放入細胞凍存盒內(nèi)，蓋上 盒蓋，扣緊卡扣，在細胞凍存盒的吊繩的末端系上標簽卡，卡記錄凍存細 胞的有關(guān)資料；(5)、將整個細胞凍存盒直接投入液氮罐或-7(TC以下冷凍 設(shè)備中冷凍，24小時后，將細胞凍存袋從細胞凍存盒中取出裝入另外的容器后(或直接)投入液氮中或-7(TC以下冷凍設(shè)備中長期凍存，并將細胞凍 存袋的吊繩的另一端拉出冷凍器口外；(6)、當需要解凍細胞時，通過吊繩 上的標簽找到所需細胞，拉出細胞凍存袋后，立即放入38。C-39。C的溫水 中，溫水必須能浸沒細胞凍存袋，擺動細胞凍存袋以加快解凍速度，并隨 時注意水溫的變化，當水溫下降到36。C以下時應(yīng)補加熱水^使水溫上升到38 °C-39°C，當細胞凍存袋中所有凝固物都融化為液體后，把細胞凍存袋移入 無菌操作臺，按無菌操作程序?qū)φ麄€細胞袋消毒，剪開細胞凍存袋的細管， 將細胞凍存袋中的細胞懸液分裝入離心管中離心，棄上清液，以后的操作 與常規(guī)解凍細胞后的操作 一致。
全文摘要
本發(fā)明涉及批量凍存細胞的裝置及方法，本發(fā)明的裝置由細胞凍存袋、細胞凍存盒、細胞架組成，細胞凍存袋置于細胞架上，細胞架置于細胞凍存盒內(nèi)。批量凍存細胞的方法將細胞懸液裝入細胞凍存袋中置于細胞架上，再將細胞架放入細胞凍存盒內(nèi)，將細胞凍存盒投入液氮罐或-70℃以下冷凍設(shè)備冷凍24小時，將細胞凍存袋取出投入液氮中或-70℃以下冷凍設(shè)備長期凍存，當需解凍細胞時，拉出細胞凍存袋放入38℃-39℃的溫水中解凍，當凝固物都融化為液體后，移入無菌操作臺，按無菌操作程序操作將細胞凍存袋中的細胞懸液分裝入離心管中離心，棄上清液，按常規(guī)解凍細胞來操作。本發(fā)明的細胞凍存袋凍存細胞體積達50-200ml，整套裝置直接投入液氮中或放入-70℃以下冷凍設(shè)備。
文檔編號A01N1/02GK101543210SQ200910061909
公開日2009年9月30日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者敏 向, 尹建文, 云 汪, 溫文生, 漆世華, 舒銀輝, 陶弼菲, 高其雙 申請人:武漢中博生化有限公司