本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的凍干保存方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
外泌體是一種納米級具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡樣小體，可以來源于多種不同的細(xì)胞，包括肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等等。特別地，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)證明，腫瘤細(xì)胞會比正常細(xì)胞產(chǎn)生和分泌更多數(shù)量的外泌體。外泌體已經(jīng)在大部分的體液中被發(fā)現(xiàn)，不管是處于健康狀態(tài)或者患病狀態(tài)，包括血液、羊水、尿液、惡性腹水、腦脊液、乳汁、唾液、淋巴和膽汁等。
外泌體最早在1987年由johnstone等人在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向紅細(xì)胞的成熟過程中發(fā)現(xiàn)。他們注意到，這些囊泡(后來命名：外泌體)來源于所培養(yǎng)的單層細(xì)胞，并保留了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和許多膜相關(guān)蛋白。起初，人們認(rèn)為外泌體只是一種“細(xì)胞垃圾”，是細(xì)胞為了去除不必要的蛋白質(zhì)和其他分子而釋放出來的。不過，到了上世紀(jì)90年代中期，科學(xué)家們認(rèn)識到了外泌體的免疫功能。進(jìn)一步研究表明，外泌體作為一種細(xì)胞間通訊方式，在正常生理過程中，以及重要的生物學(xué)過程，例如哺乳、炎癥、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)和神經(jīng)功能等，有著非常重要的角色。
不同細(xì)胞來源、不同培養(yǎng)條件，以及不同分離方式收集得到的外泌體，包含不同種類的蛋白質(zhì)、脂肪和mrna等，不但直接影響到其生物活性的多樣化，而且也對保存方式提出了不同的實(shí)際要求。因此，有必要針對一種新型的人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體開發(fā)一種有效的凍干保存方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)的空白瓶頸，從而提出一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的凍干保存方法及其應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的凍干保存方法，步驟如下：
取所得100重量份的外泌體，加入1～15重量份的甘露醇，0.1-1重量份的絲膠蛋白，混勻，過濾，再放置于-50～-80℃的溫度下保存；然后進(jìn)行凍干處理，得到人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉。
優(yōu)選的，所述凍干處理的溫度為-50℃，凍干時間為24h。
優(yōu)選的，所述外泌體的外膜為磷脂雙層結(jié)構(gòu)，所述外泌體內(nèi)部含有micro-rna、所述外泌體源細(xì)胞的mrna、dna和核酸中的至少一種。
優(yōu)選的，所述外泌體為msc分化得到的；所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
優(yōu)選的，所述外泌體的獲取方法步驟如下：
a)對人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)階段在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加干擾素、epo和pdgf-bb；
b)對培養(yǎng)后的干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理；
c)在預(yù)處理后的培養(yǎng)基的上清液中提取所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體。
優(yōu)選的，所述所述預(yù)處理的具體步驟為：
1)將人傳代msc進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml；
2)按照106/150mm大培養(yǎng)皿接種，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度至70-80％，培養(yǎng)時間為2-3天；
3)吸除培養(yǎng)皿中的液體，并用alpha-mem液體培養(yǎng)基對培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌；
4)在150mm培養(yǎng)皿中再次加入20ml的alpha-mem；
5)依次加入重組人干擾素、pdgf-bb和epo；
7)在37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)96小時，收集得到msc培養(yǎng)液。
優(yōu)選的，所述msc培養(yǎng)液中干擾素的濃度為10u/ml～600u/ml、pdgf-bb的濃度為2ng/ml～60ng/ml，epo的濃度為0.1iu/ml～5iu/ml。
優(yōu)選的，所述步驟2)的預(yù)處理的具體為：
1)取所述msc培養(yǎng)液的上清液，進(jìn)行離心處理，去除細(xì)胞碎片；
2)然后將上清液濾膜過濾處理，去除凋亡小體，得到預(yù)處理后的上清液。
優(yōu)選的，所述步驟3)具體為：
1)取容積為5體積份的離心管，加入1體積份的外泌體分離試劑；
2)加入4體積份的經(jīng)過預(yù)處理后的上清液，充分混勻；
3)靜置處理后，再進(jìn)行兩次離心處理，得到所述外泌體。
本發(fā)明還公開了任一項(xiàng)所述凍干保存方法在美容制劑的制備領(lǐng)域中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(1)本發(fā)明所述凍干粉采用甘露醇作為冷凍保護(hù)劑冷凍干燥在低溫下進(jìn)行，可以很好地保持外泌體中的蛋白質(zhì)、dna、rna等生物成分的活力，特別適用于美容制劑。
(2)在低溫下干燥時，物質(zhì)中的一些揮發(fā)性成分損失很小，可以最大程度地保留外泌體的生物活性成分。
(3)在冷凍干燥過程中，微生物的生長和酶的作用無法進(jìn)行，因此能保持外泌體中的生物成分的原始性狀。
(4)由于在凍結(jié)的狀態(tài)下進(jìn)行干燥，因此體積幾乎不變，不會發(fā)生濃縮現(xiàn)象。
(5)干燥后的外泌體疏松多孔，加水后溶解迅速而完全，幾乎立即恢復(fù)原來的性狀，適合即用即配。
(6)由于干燥在真空下進(jìn)行，氧氣極少，因此一些易氧化的物質(zhì)得到了保護(hù)。
(7)干燥能排除95～99％以上的水份，使干燥后產(chǎn)品能長期保存而不致變質(zhì)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1本實(shí)施例公開了一種外泌體凍干粉的制備方法
取所得外泌體，加入1～15重量份的甘露醇，0.1-1重量份的絲膠蛋白，混勻，過濾(0.22μm)，分裝，再放置于超低溫冰箱(-80℃)10h。然后，在10pa的真空度下進(jìn)行凍干(-50℃，24h)，得到人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉。
實(shí)施例2本實(shí)施公開了實(shí)施例1所述外泌體的制備流程：
一、人msc的培養(yǎng)及預(yù)處理
1.材料及試劑
1)人臍帶、胎盤、骨髓、脂肪或其它來源的msc，傳代次數(shù)在6代以內(nèi)均可。
2)人msc無血清培養(yǎng)基
3)alpha-mem
4)重組人干擾素
5)重組人epo
6)重組人pdgf-bb
7)培養(yǎng)皿(直徑150mm)
8)其它耗材
本實(shí)施例公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的凍干保存方法
2、細(xì)胞培養(yǎng)
1)將人傳代msc消化后計(jì)數(shù)，使用msc無血清完全培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml。
2)按照106/150mm大培養(yǎng)皿接種，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度至70-80％。一般需要2-3天。
3)吸除培養(yǎng)皿中的液體，并用alpha-mem液體培養(yǎng)基對培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌。
4)加入alpha-mem20ml/150mm培養(yǎng)皿。
5)首先加入重組人干擾素、pdgf-bb，在37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)24小時；然后，再加入epo，在37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)72小時。
干擾素(終濃度為10u/ml～600u/ml)、pdgf-bb(2ng/ml～60ng/ml)及epo(0.1iu/ml～5iu/ml)。
7)37℃，5％co2條件下培養(yǎng)96小時。
8)收集上清進(jìn)行以下處理。如不能及時處理，將上清置于-80℃保存。
二、人msc培養(yǎng)上清的預(yù)處理
1.材料與試劑
1)離心管等耗材。
2)孔徑為1μm，0.45μm及0.22μm的濾器。
2.操作步驟
1)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫或4℃條件下離心2000g，10分鐘，去除細(xì)胞碎片。
2)將培養(yǎng)上清或體液分別經(jīng)過直徑為1μm，0.45μm及0.22μm濾膜過濾，以去除其中可能存在的凋亡小體。
三、外泌體的收獲
1)取50ml離心管，加入外泌體分離試劑10ml。或取250ml離心管，加入外泌體試劑50ml。
2)加入經(jīng)過處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml，充分混勻?；蚣尤肱囵B(yǎng)上清200ml。
3)置于4℃過夜，或至少6小時。
4)離心，2000g，30分鐘。
5)移除液體，再次離心，2000g，5分鐘。
6)用pipette小心吸除殘留液體。
7)加入pbs或生理鹽水500μl至1ml?；蚣尤雙bs或生理鹽水2.5ml至5ml。
8)測定蛋白質(zhì)濃度，或進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)等儀器分析。
實(shí)驗(yàn)例
實(shí)驗(yàn)例1流式細(xì)胞儀分析：
采用常規(guī)方法，檢測在不同保存時間以后，外泌體的cd29及cd73表達(dá)。結(jié)果表明，在六個月之后，所得外泌體的cd29及cd73表達(dá)基本維持不變。這表明了，所用凍干保存方法可以有效地維持所得外泌體的生物活性。
2、進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)
采用常規(guī)方法，將臍帶內(nèi)皮細(xì)胞接種于matrigel中，體系中加入不同成分(包括：dmem培養(yǎng)基、1μg/ml外泌體、10μg/ml外泌體、50μg/ml外泌體、100μg/ml外泌體、b-成纖維細(xì)胞生長因子)，24小時后計(jì)管網(wǎng)結(jié)構(gòu)數(shù)量。在六個月之后，實(shí)施例1所得的外泌體仍然保留良好的內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性。
對比例
對照組1取所得外泌體，加入海藻糖(10％)，混勻，過濾(0.22μm)，分裝，再放置于超低溫冰箱(-80℃)10h。然后，在10pa的真空度下進(jìn)行凍干(-50℃，24h)，得到人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉，該方法為現(xiàn)有技術(shù)。
對照組2取所得外泌體，加入葡萄糖(10％)，混勻，過濾(0.22μm)，分裝，再放置于超低溫冰箱(-80℃)10h。然后，在10pa的真空度下進(jìn)行凍干(-50℃，24h)，得到人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉，該方法為現(xiàn)有技術(shù)。
檢測對照組1、對照組2中的外泌體的cd29及cd73表達(dá)。結(jié)果表明，在六個月之后，所得外泌體的cd29及cd73表達(dá)有明顯的變化。這表明了，本技術(shù)方案，在人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的凍干保存方面，優(yōu)于對照組1和對照組2所得的凍干粉，即優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。
顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。