本發(fā)明涉及甘薯組培苗病毒檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法。
背景技術(shù)：
甘薯是無性繁殖作物，大田種植容易受羽狀斑駁病毒(spfmv)、花椰菜花葉狀病毒(spclv)、潛隱病毒(splv)和煙草花葉病毒(tmv)的侵染，導(dǎo)致種性退化，抗性降低，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。我國多數(shù)種植區(qū)的田間植株病毒感染率為60％-70％，有的甚至達(dá)90％，每年導(dǎo)致甘薯減產(chǎn)幅度達(dá)29％。目前尚無對病毒完全抗性的品種和徹底免疫的方法，也無特效藥劑，采用莖尖脫毒技術(shù)仍然是防治甘薯病毒病、恢復(fù)優(yōu)良種性、提高產(chǎn)量和品質(zhì)的根本方法。因此對甘薯莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)以及對組培苗的病毒檢測成為防治甘薯病毒的研究重點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案：
一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法，具體步驟為：
(1)材料采集與消毒
于6月份剪取田間生長旺盛的甘薯苗頂芽，切去葉片，自來水沖洗40-50min，用無菌濾紙吸干水分，置于超凈工作臺上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒5min，最后用無菌水沖洗7-8次，備用；
(2)莖尖剝離與培養(yǎng)
在雙目解剖鏡下，將消毒后的甘薯頂芽用注射器針尖剝?nèi)ネ鈱尤~片，僅留1-2個葉原基，將5-6個大小為0.1-0.2mm的莖尖接種在初代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蔗糖為30g/l，瓊脂為6.0g/l，ph為5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度2000-3000lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)40天，得到組培苗；
(3)組培苗病毒檢測
采用指示植物針刺汁液沾接法進(jìn)行病毒檢測：在巴西牽牛初生健康葉上，用滅菌注射器刺孔，然后將待測的甘薯葉片、葉柄及幼莖包扎在一起擠出汁液，沾接在針刺孔上，并以滅菌水及已知帶毒薯液同樣接種作為陰性對照和陽性對照，置于30℃防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮蔭保濕培養(yǎng)；接種后20天連續(xù)觀察記載癥狀，根據(jù)指示植物癥狀，在所有沾接的指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀，該樣品即為陽性；根據(jù)檢測結(jié)果淘汰帶毒苗，保留脫毒苗。
莖尖剝離與培養(yǎng)過程中初代培養(yǎng)基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l。
組培苗病毒檢測過程中沾接的指示植物表現(xiàn)的典型癥狀為新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈、黃脈，以后發(fā)展為花葉或皺縮。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法，甘薯脫毒成功率提高，病毒檢測準(zhǔn)確度高，對防治甘薯病毒病提供了一種有效的檢測手段。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
實施例1：
一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法，具體步驟為：
(1)材料采集與消毒
于6月份剪取田間生長旺盛的甘薯苗頂芽，切去葉片，自來水沖洗40min，用無菌濾紙吸干水分，置于超凈工作臺上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒5min，最后用無菌水沖洗7次，備用；
(2)莖尖剝離與培養(yǎng)
在雙目解剖鏡下，將消毒后的甘薯頂芽用注射器針尖剝?nèi)ネ鈱尤~片，僅留1個葉原基，將5個大小為0.1mm的莖尖接種在初代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蔗糖為30g/l，瓊脂為6.0g/l，ph為5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)40天，得到組培苗；
(3)組培苗病毒檢測
采用指示植物針刺汁液沾接法進(jìn)行病毒檢測：在巴西牽牛初生健康葉上，用滅菌注射器刺孔，然后將待測的甘薯葉片、葉柄及幼莖包扎在一起擠出汁液，沾接在針刺孔上，并以滅菌水及已知帶毒薯液同樣接種作為陰性對照和陽性對照，置于30℃防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮蔭保濕培養(yǎng)；接種后20天連續(xù)觀察記載癥狀，根據(jù)指示植物癥狀，在所有沾接的指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀，該樣品即為陽性；根據(jù)檢測結(jié)果淘汰帶毒苗，保留脫毒苗。
莖尖剝離與培養(yǎng)過程中初代培養(yǎng)基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l。
組培苗病毒檢測過程中沾接的指示植物表現(xiàn)的典型癥狀為新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈、黃脈，以后發(fā)展為花葉。
實施例2：
一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法，具體步驟為：
(1)材料采集與消毒
于6月份剪取田間生長旺盛的甘薯苗頂芽，切去葉片，自來水沖洗50min，用無菌濾紙吸干水分，置于超凈工作臺上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒5min，最后用無菌水沖洗8次，備用；
(2)莖尖剝離與培養(yǎng)
在雙目解剖鏡下，將消毒后的甘薯頂芽用注射器針尖剝?nèi)ネ鈱尤~片，僅留2個葉原基，將6個大小為0.2mm的莖尖接種在初代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蔗糖為30g/l，瓊脂為6.0g/l，ph為5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度3000lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)40天，得到組培苗；
(3)組培苗病毒檢測
采用指示植物針刺汁液沾接法進(jìn)行病毒檢測：在巴西牽牛初生健康葉上，用滅菌注射器刺孔，然后將待測的甘薯葉片、葉柄及幼莖包扎在一起擠出汁液，沾接在針刺孔上，并以滅菌水及已知帶毒薯液同樣接種作為陰性對照和陽性對照，置于30℃防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮蔭保濕培養(yǎng)；接種后20天連續(xù)觀察記載癥狀，根據(jù)指示植物癥狀，在所有沾接的指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀，該樣品即為陽性；根據(jù)檢測結(jié)果淘汰帶毒苗，保留脫毒苗。
莖尖剝離與培養(yǎng)過程中初代培養(yǎng)基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l。
組培苗病毒檢測過程中沾接的指示植物表現(xiàn)的典型癥狀為新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈、黃脈，以后發(fā)展為皺縮。
實施例3：
一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法，具體步驟為：
(1)材料采集與消毒
于6月份剪取田間生長旺盛的甘薯苗頂芽，切去葉片，自來水沖洗45min，用無菌濾紙吸干水分，置于超凈工作臺上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒5min，最后用無菌水沖洗8次，備用；
(2)莖尖剝離與培養(yǎng)
在雙目解剖鏡下，將消毒后的甘薯頂芽用注射器針尖剝?nèi)ネ鈱尤~片，僅留1個葉原基，將6個大小為0.2mm的莖尖接種在初代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蔗糖為30g/l，瓊脂為6.0g/l，ph為5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)40天，得到組培苗；
(3)組培苗病毒檢測
采用指示植物針刺汁液沾接法進(jìn)行病毒檢測：在巴西牽牛初生健康葉上，用滅菌注射器刺孔，然后將待測的甘薯葉片、葉柄及幼莖包扎在一起擠出汁液，沾接在針刺孔上，并以滅菌水及已知帶毒薯液同樣接種作為陰性對照和陽性對照，置于30℃防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮蔭保濕培養(yǎng)；接種后20天連續(xù)觀察記載癥狀，根據(jù)指示植物癥狀，在所有沾接的指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀，該樣品即為陽性；根據(jù)檢測結(jié)果淘汰帶毒苗，保留脫毒苗。
莖尖剝離與培養(yǎng)過程中初代培養(yǎng)基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l。
組培苗病毒檢測過程中沾接的指示植物表現(xiàn)的典型癥狀為新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈、黃脈，以后發(fā)展為花葉。
本發(fā)明提供了一種甘薯莖尖離體培養(yǎng)及組培苗病毒檢測的方法，甘薯脫毒成功率提高，病毒檢測準(zhǔn)確度高，對防治甘薯病毒病提供了一種有效的檢測手段。
上面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。