本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種金線蓮叢生苗的組培生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

金線蓮（anoectochilusroxburghiil.）是植物分類學(xué)中隸屬于蘭科開唇蘭屬的一個(gè)種，其廣泛分布于我國東自臺(tái)灣西至云南的多個(gè)南方省區(qū)，作為民間草藥具有重要的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，特別是在福建省的南靖和永安地區(qū)，金線蓮的生產(chǎn)已經(jīng)形成年產(chǎn)值超10億的較大規(guī)模。金線蓮由于起源分布地不同，在形態(tài)上有很多明顯的差別，也因此通常以產(chǎn)地對(duì)金線蓮進(jìn)行區(qū)分，例如，臺(tái)灣金線蓮、福建金線蓮、云南金線蓮等。

在金線蓮的商業(yè)生產(chǎn)中，誘導(dǎo)形成叢生芽是重要的中間環(huán)節(jié)。文獻(xiàn)資料顯示，通過組培技術(shù)生產(chǎn)金線蓮叢生苗已經(jīng)有三十多年的歷史，生產(chǎn)過程除了在培養(yǎng)基成分的細(xì)節(jié)上有某些差異外，都是通過對(duì)野外的材料進(jìn)行滅菌，誘導(dǎo)叢生芽的形成并以叢生芽的狀態(tài)增殖，最后將叢生芽切成單個(gè)芽誘導(dǎo)生根得到可以在瓶外種植的有根單苗。通過國內(nèi)發(fā)明專利檢索可以發(fā)現(xiàn)，迄今已經(jīng)有許多關(guān)于金線蓮組織培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽的技術(shù)方案。中國專利cn103688854b公開了一種峨眉金線蓮的組培快繁方法，該專利提供的方法為選取生長在5～10月份的野生峨眉金線蓮，制作外植體并進(jìn)行消毒處理，然后通過叢生芽的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、生根壯苗培養(yǎng)和移栽溫室大棚培養(yǎng)的措施，通過激素誘導(dǎo)使金線蓮快速繁殖。該發(fā)明中的方法和其他迄今已經(jīng)公開的金線蓮叢生苗組培生產(chǎn)方法一樣，都是在最后誘導(dǎo)生根的階段，將叢生芽切開成單個(gè)芽，形成“單株”并將“單株”轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法在誘導(dǎo)生根時(shí)需要在無菌工作臺(tái)內(nèi)多次切割叢生芽成單個(gè)芽，工作量大、無菌操作效率和隨后的單苗種植勞動(dòng)效率低。此外，單苗的移栽成活率也較低。

因此，仍需研究一種高效、省工、移栽成活率更高的金線蓮組培種苗生產(chǎn)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種金線蓮叢生苗的組培生產(chǎn)方法，本發(fā)明提供的組培生產(chǎn)方法生產(chǎn)的叢生芽的生根率達(dá)到90%以上，有根系的叢生苗的瓶外移栽成活率可達(dá)到98%以上。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種金線蓮叢生苗的組培生產(chǎn)方法，所述方法包括如下步驟：

s1：將無菌的金線蓮瓶苗枝條切割成單個(gè)節(jié)的莖段和具有頂芽的莖端，接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成叢生芽；

s2：將s1所得叢生芽切成單個(gè)芽，接種至單芽生長培養(yǎng)基上形成具有3～5個(gè)節(jié)的枝條；

s3：將s2所得枝條切割成單個(gè)側(cè)芽的莖段和具有頂芽的莖端，接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成叢生芽；

s4：依次循環(huán)s2、s3步驟若干次直至得到預(yù)定數(shù)量的叢生芽，將叢生芽接種至叢生芽生根培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)叢生芽的伸長和生根，生長成為叢生苗。

本發(fā)明提供的金線蓮叢生苗的組培生產(chǎn)方法通過循環(huán)誘導(dǎo)莖段和莖端形成叢生芽、切開叢生芽成為單個(gè)芽、單芽生長培養(yǎng)幾個(gè)步驟來生產(chǎn)預(yù)定數(shù)量的叢生芽，再對(duì)叢生芽接種培養(yǎng)生根實(shí)現(xiàn)叢生芽的伸長和生根，形成適合瓶外種植的叢生苗。

本發(fā)明提供的方法減少了在誘導(dǎo)生根時(shí)切割叢生芽成為單個(gè)芽的工作量，從而減少了無菌操作環(huán)節(jié)的用工量，提高了無菌操作效率；本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的是叢生苗，叢生苗在種植時(shí)更加省工，種植的勞動(dòng)效率可得到成倍的提高。本發(fā)明培養(yǎng)得到的叢生苗具有3～5個(gè)甚至更多枝條和更發(fā)達(dá)的根系，使得叢生苗在種植后更容易適應(yīng)環(huán)境的變化，總體活力和抗性得到了顯著提高，由此提高叢生苗的移栽成活率。

基于組培常識(shí)，本發(fā)明中的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、單芽生長培養(yǎng)基、叢生芽生根培養(yǎng)基的成分及其用量可采用本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加0.5～2.5mg/l芐基腺嘌呤和0.5～1.5mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基；更為優(yōu)選地，所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加1.0～2.5mg/l芐基腺嘌呤和1.0mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述單芽生長培養(yǎng)基為添加0.1～0.3mg/l芐基腺嘌呤和0.5～1.5mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基；更為優(yōu)選地，所述單芽生長培養(yǎng)基為添加0.1mg/l芐基腺嘌呤和1.0～1.5mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基。

所述叢生芽生根培養(yǎng)基為添加0.5～1.5mg/l萘乙酸和0.1～0.3%活性炭的ms培養(yǎng)基；更為優(yōu)選地，所述叢生芽生根培養(yǎng)基為添加1mg/l萘乙酸和0.2%活性炭的ms培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，芐基腺嘌呤（benzyladenine，ba）和萘乙酸（naphthaleneaceticacid，naa）的具體濃度需要根據(jù)金線蓮的品種以及所形成的芽體的數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)行隨時(shí)調(diào)整，當(dāng)芽體數(shù)量偏少時(shí)采用上限或接近上限的濃度，反之采用下限濃度。

本發(fā)明s4獲得的叢生苗的枝條數(shù)量以適合瓶外種植為宜，優(yōu)選地，s4獲得的叢生苗的枝條數(shù)量為3～5個(gè)。

優(yōu)選地，所述金線蓮為臺(tái)灣金線蓮、云南金線蓮或福建金線蓮。

本發(fā)明中提供的金線蓮叢生苗的組培生產(chǎn)方法不僅適用于上述品種的金線蓮，還可應(yīng)用于其它金線蓮品種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明組培得到的叢生芽的生根率達(dá)到90%以上，所培養(yǎng)的叢生芽生長得到的叢生苗相對(duì)于通常技術(shù)生產(chǎn)的單苗具有更發(fā)達(dá)的根系，叢生苗在種植后更容易適應(yīng)環(huán)境的變化，并且各枝條之間相互作用使得總體活力和抗性得到了顯著提高，叢生苗的瓶外移栽成活率可達(dá)到98%以上。

本發(fā)明提供的方法減少了在誘導(dǎo)生根時(shí)切割叢生芽成為單個(gè)芽的工作量，減少了無菌操作環(huán)節(jié)的用工量，提高了無菌操作效率；本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的是叢生苗，種植一叢叢生苗相當(dāng)于種植3～5棵單苗，叢生苗在種植時(shí)更加省工，種植的勞動(dòng)效率可得到成倍的提高。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

以臺(tái)灣金線蓮瓶苗為材料（常規(guī)方法取得，或通過向眾多生產(chǎn)廠家購買）。確認(rèn)沒有菌類污染后，在無菌工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行合適的切割操作，得到帶有單個(gè)節(jié)（側(cè)芽、腋芽）的莖段和帶有頂芽的莖端材料。

將帶有單個(gè)節(jié)的莖段和帶有頂芽的莖端材料分別接種培養(yǎng)到含有不同濃度ba的“叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基”上，誘導(dǎo)叢生芽的形成，結(jié)果如表1所示。

表1ba對(duì)臺(tái)灣金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的作用

注：ba每個(gè)濃度培養(yǎng)5瓶，每瓶5個(gè)莖段或莖端，培養(yǎng)時(shí)間為60天；培養(yǎng)基中naa濃度為1.0mg/l；表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)的莖段或莖端數(shù)量。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，通過改變ba濃度可以有效地取得一定數(shù)量的叢生芽，當(dāng)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的ba濃度為1.0～2.5mg/l時(shí)，才能夠誘導(dǎo)更多的叢生芽。

將所得叢生芽切割成為單個(gè)芽，接種到含有不同濃度naa的單芽生長培養(yǎng)基上，可以促使這些單芽生長成為枝條，結(jié)果如表2所示。

表2naa對(duì)臺(tái)灣金線蓮單芽生長的作用

注：naa每個(gè)濃度培養(yǎng)5瓶，每瓶6個(gè)單芽，培養(yǎng)時(shí)間為60天；培養(yǎng)基中ba濃度為0.1mg/l；表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)的單芽數(shù)量。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，naa濃度在0.5mg/l時(shí)的效果明顯較差，而1.0和1.5之間沒有明顯的差別，據(jù)此或可認(rèn)為單芽的生長對(duì)naa濃度有一定但不嚴(yán)格的要求。

此外，各組都存在少量生長欠佳，高度在5厘米以下的枝條，究其原因，可能和出發(fā)材料的質(zhì)量不太均勻，少量單芽在操作過程中受到物理性質(zhì)的損傷有關(guān)。

將上述誘導(dǎo)形成的叢生芽接種到叢生芽生根培養(yǎng)基上，所述叢生芽生根培養(yǎng)基為添加1mg/l萘乙酸和0.2%活性炭的ms培養(yǎng)基。經(jīng)過大約75天的培養(yǎng)，不低于95%的叢生芽能夠形成根系，有根系的叢生苗的瓶外移栽成活率可達(dá)到98%以上，得到的叢生苗的枝條數(shù)為3～5個(gè)甚至更多。

實(shí)施例2

以云南金線蓮瓶苗為材料（本材料從云南勐臘當(dāng)?shù)夭杉囊吧贩N以常規(guī)組培方法培育而成）。在無菌工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行合適的切割操作，得到帶有單個(gè)節(jié)（側(cè)芽、腋芽）的莖段和帶有頂芽的莖端材料。將帶有單個(gè)節(jié)的莖段和帶有頂芽的莖端材料分別接種培養(yǎng)到含有不同濃度ba的“叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基”上，誘導(dǎo)叢生芽的形成，結(jié)果如表3所示。

表3ba對(duì)云南金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的作用

注：ba每個(gè)濃度培養(yǎng)5瓶，每瓶5個(gè)莖段或莖端，培養(yǎng)時(shí)間為60天；培養(yǎng)基中naa濃度為1.0mg/l；表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)的莖段或莖端數(shù)量。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，通過改變ba濃度可以有效地取得一定數(shù)量的叢生芽。不過，與臺(tái)灣金線蓮相比，云南金線蓮需要稍高些的ba濃度才能夠達(dá)到誘導(dǎo)更多的叢生芽的目的。

將這些叢生芽切割成為單個(gè)芽后，接種到含有不同濃度naa的單芽生長培養(yǎng)基上，可以促使單芽生長成為枝條，結(jié)果如表4所示。

表4naa對(duì)云南金線蓮單芽生長的作用

注：naa每個(gè)濃度培養(yǎng)5瓶，每瓶6個(gè)單芽，培養(yǎng)時(shí)間為60天；培養(yǎng)基中ba濃度為0.3mg/l；表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)的單芽數(shù)量。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，naa濃度在0.5-1.5mg/l的范圍內(nèi)對(duì)于云南金線蓮單芽生長的作用的差別并不明顯。與臺(tái)灣金線蓮相比，云南金線蓮有顯著更高的達(dá)到大于8厘米的高度的比例。究其原因，很可能與云南金線蓮的個(gè)頭較大，生長速度較快有密切關(guān)系。

將上述誘導(dǎo)形成的叢生芽接種到叢生芽生根培養(yǎng)基上，所述叢生芽生根培養(yǎng)基為添加1mg/l萘乙酸和0.2%活性炭的ms培養(yǎng)基。經(jīng)過大約75天的培養(yǎng)，不低于90%的叢生芽能夠形成根系，有根系的叢生苗的瓶外移栽成活率達(dá)到98%以上，得到的叢生苗的枝條數(shù)為3～5個(gè)甚至更多。

以上實(shí)施例提供的組培生產(chǎn)方法減少了在誘導(dǎo)生根時(shí)切割叢生芽成為單個(gè)芽的工作量，減少了無菌操作環(huán)節(jié)的用工量，提高了無菌操作效率；本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的是叢生苗，種植一叢叢生苗相當(dāng)于種植3～5棵單苗，叢生苗在種植時(shí)更加省工，種植的勞動(dòng)效率可得到成倍的提高。

本發(fā)明所提供的金線蓮叢生苗的組培生產(chǎn)方法除可應(yīng)用于臺(tái)灣金線蓮和云南金線蓮品種之外，還可應(yīng)用于其它品種的金線蓮，包括目前產(chǎn)量靠前的福建金線蓮。因此，以上兩實(shí)施的例子并不意味著本案所公開的方法僅限于臺(tái)灣和云南金線蓮兩品種。