本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及4-乙烯基苯酚在制備線蟲殺蟲劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物病原線蟲作為一種常見的寄生線蟲，具有多寄主，防治難度大，抗藥性強等特點，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的危害,其中植物根結(jié)線蟲和植物孢囊線蟲對農(nóng)作物莊稼危害最大，分布范圍也最廣(curtis2007)。根結(jié)線蟲(meloidogynespp.)是一種定植在植物根系的內(nèi)寄生線蟲，屬于墊刃目(tylenchida)，異皮科(heteroderidae)，根結(jié)亞科(meloidogyninae)，根結(jié)線蟲屬(meloidogyne)。在我國，分布最廣、危害最嚴重的是南方根結(jié)線蟲。目前國內(nèi)外線蟲防治技術(shù)主要有以下幾種方法：

(1)農(nóng)業(yè)防治

苗床是線蟲傳播的非常重要的途徑，可以通過對苗床進行消毒或者無土育苗、種植抗線蟲品種等方法，保證種苗的健康成長，避免早期受到根結(jié)線蟲的侵染。清除帶蟲殘體，壓低蟲口密度，帶蟲根曬干后應(yīng)燒毀。深翻土壤。將表土翻至25厘米以下，可減輕蟲害發(fā)生。高(低)溫抑蟲。利用夏季高溫休閑季節(jié)，起壟灌水覆地膜，密閉棚室兩周。利用冬季低溫凍垡等可抑制線蟲發(fā)生。有些地區(qū)可采用輪作，特別是水旱輪作的方法防治根結(jié)線蟲具有較好的效果(曹坳程等2002)。但是這些主要是起輔助性作用，通常使用的防治手段是使用化學農(nóng)藥防治。

(2)化學防治

長期以來，我國對作物病原線蟲的防治主要依靠化學農(nóng)藥，其在保障農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。溴甲烷是最早用于植物病原線蟲防治的一類化學藥劑，隨后，克線丹(cadusafos)、滅線磷(ethoprphos)等殺線蟲劑在黃瓜等農(nóng)作物線蟲病害防治過程中顯示出巨大的潛力，因此得到了廣泛的應(yīng)用(孔祥義等2006)。

但是，高毒性的化學農(nóng)藥在使用過程中造成了非常嚴重的農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染問題。據(jù)衛(wèi)生部和農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計，全國每年因農(nóng)藥中毒人數(shù)已超過5萬，農(nóng)藥殘留對人體造成的不良影響更是難以估量。同時，我國的農(nóng)副產(chǎn)品由于農(nóng)藥殘留量超標，出口受阻，每年造成的外貿(mào)經(jīng)濟損失高達70億美元。與此同時相當部分的化學殺線蟲藥劑進入土壤和地下水中，造成嚴重的環(huán)境污染，特別是地下水污染，直接威脅到生態(tài)安全。目前我國主要化學殺線蟲劑滅線磷、溴甲烷、涕滅威等已被禁用或限制使用，導致可選用的化學殺線蟲劑種類更少，加劇了線蟲防治的困難。所以，殺線蟲劑的應(yīng)用應(yīng)該向低毒、高效、低殘留方向發(fā)展(王新榮等2010)。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(haemonchuscontortus)是一種寄生在反芻動物的主要病原寄生蟲，偶爾也見于人和鼠等非適宜宿主。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲屬直接發(fā)育型的寄生蟲,不需要中間宿主,成蟲排卵量大,嚴重污染草地和水源。該病的發(fā)生呈現(xiàn)出氣候、地理、牧場條件和宿主生理狀態(tài)依賴性。因引起感染動物貧血、消瘦甚至死亡而給畜牧業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。由于沒有商業(yè)化的疫苗,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防控仍然以抗蠕蟲藥治療為主。但是耐藥性的產(chǎn)生和有效疫苗的缺乏給防治工作帶來困難，新的藥物亟待開發(fā)。

4-乙烯基苯酚是白酒和啤酒中發(fā)現(xiàn)的酚類化合物，溶于水，部分溶于酒精，稍溶于油脂，具有苯酚、藥味和辛香風味，2000年，食品添加劑聯(lián)合專家委員會jecfa(thejointfao/whoexpertcommitteeonfoodadditives)評估4-乙烯基苯酚用作調(diào)味劑在當前攝入水平?jīng)]有安全問題；同時4-乙烯基苯酚是一種重要的有機化工原料及醫(yī)藥中間體，廣泛應(yīng)用于合成樹脂、合成橡膠、石油化工、食品香料、醫(yī)藥等行業(yè)。在中草藥中提取到的4-乙烯基苯酚發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤細胞血管生成的作用(gracegar-leeyue等2015)，在chavicolandrelatedcompoundsasnematocides，biosci.biotech.biochem,57(9)，1572-1574,1993中報道了4-乙烯基苯酚的殺秀麗隱桿線蟲活性，本申請首次發(fā)現(xiàn)4-乙烯基苯酚具有殺根結(jié)線蟲和羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了4-乙烯基苯酚在制備線蟲殺蟲劑中的應(yīng)用，所述的4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)的分子量為120.15，分子式為c8h8o，化學式如下：

為了達到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

4-乙烯基苯酚在制備線蟲殺蟲劑中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程包括以4-乙烯基苯酚為主效成分或為有效成分之一制備成線蟲殺蟲劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明首次報道了4-乙烯基苯酚的殺線蟲活性，為新型的動植物線蟲防治制劑的制備提供了新的選擇性。

4-乙烯基苯酚制備的殺線劑具有高效、低毒、持續(xù)性好的優(yōu)點。

附圖說明

圖1為4-乙烯基苯酚殺南方根結(jié)線蟲的效果圖；

圖1中a代表0h的殺蟲效果；圖1中b代表24h的殺蟲效果；圖1中c代表48h的殺蟲效果。

圖2為4-乙烯基苯酚殺羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的效果圖；

圖2中a：對照組線蟲；圖2中b：處理組線蟲。

具體實施方式

下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為報道的微生物學常規(guī)操作方法。所述試劑或材料，如未特別說明，來源于商業(yè)渠道。

實驗例1：

4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)在制備根結(jié)線蟲殺蟲劑中的應(yīng)用，應(yīng)用過程如下：

從番茄根部挑取線蟲感染根結(jié)，將卵塊置于96孔板20℃孵育，觀察根結(jié)線蟲孵化情況。用無菌水沖洗線蟲，在96孔板中加入200μl濃度依次為10,11,12,13,14,15μg/ml的4-乙烯基苯酚溶液，加入2μl氯霉素(30mg/ml)和30頭線蟲，純凈水做對照，每組3個重復。置于20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察實驗結(jié)果(圖1)。

線蟲死亡率＝線蟲死亡數(shù)/供試線蟲數(shù)*100％

校正死亡率＝(處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率)/(1-對照組線蟲死亡率)*100％

表1.4-乙烯基苯酚殺根結(jié)線蟲活性

對照組線蟲生長正常，4-乙烯基苯酚殺根結(jié)線蟲半數(shù)致死濃度lc50為14.96ug/ml(48h)和13.32ug/ml(72h)。

所述的線蟲為南方根結(jié)線蟲。

實驗例2：

4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)在制備秀麗隱桿線蟲殺蟲劑中的應(yīng)用，應(yīng)用過程如下：

在96孔板中加入200μl濃度依次為50,75,100,125,150,175μg/ml的4-乙烯基苯酚溶液，加入2μl氯霉素(30mg/ml)和約30頭j2期秀麗隱桿線蟲線蟲，純凈水做對照，每組3個重復。置于20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察實驗結(jié)果。

線蟲死亡率＝線蟲死亡數(shù)/供試線蟲數(shù)*100％

校正死亡率＝(處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率)/(1-對照組線蟲死亡率)*100％

表2.4-乙烯基苯酚殺秀麗隱桿線蟲活性

對照組線蟲生長正常，4-乙烯基苯酚對秀麗隱桿線蟲半數(shù)致死濃度為103.33ug/ml(48h)和70.30ug/ml(72h)。4-乙烯基苯酚對植物病原南方根結(jié)線蟲殺蟲活性強于模式線蟲秀麗隱桿線蟲。

實驗例3：

4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)在制備羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲殺蟲劑中的應(yīng)用，應(yīng)用過程如下：

從感染羊糞便中獲得并孵育捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲，用生理鹽水洗滌線蟲，38℃處理25-30分鐘進行脫鞘處理，然后用lb培養(yǎng)液洗滌線蟲，在96孔板中加入98μl含有100條左右幼蟲的lb溶液，加入2μl4-乙烯基苯酚溶液使其終濃度達到1mg/ml，lb溶液做對照，每組3個重復。置于38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后觀察實驗結(jié)果。

對照組線蟲生長正常，1mg/ml4-乙烯基苯酚處理下，羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲全部死亡。4-乙烯基苯酚對動物病原線蟲羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲具有強烈殺蟲活性(圖2)。

實驗例4：

4-vinylphenol對南方根結(jié)線蟲卵孵化抑制實驗

1)挑取番茄根上的卵塊，收集在一起，放入1％次氯酸鈉溶液消毒3min，用無菌水洗掉次氯酸鈉殘留，在水里搖晃使卵從卵塊中脫落，獲得含卵懸浮液；

2)用無菌水沖洗，將含卵的懸浮液分別通過篩孔尺寸依次為200目、325目、500目的篩子，最后卵保留在500目的篩子上，再次用無菌水小心沖洗篩子上的卵，并收集；

3)在96孔板中加入線蟲卵150個/孔，每孔中加入4-vp溶液，使終濃度分別為5，10,40,100μg/ml，每組處理3個重復，水為對照，觀察結(jié)果。

卵孵化率(％)＝孵化線蟲數(shù)/卵總數(shù)*100％

卵孵化抑制率(％)＝(對照組卵孵化率-處理組卵孵化率)/對照組卵孵化率*100％

表3.根結(jié)線蟲10d卵孵化抑制率

4-vp濃度的提升對卵孵化抑制率升高，而且4-vp濃度達到40ug/ml之后孵化出來的線蟲存在80％-100％的死亡率。

實驗例5：

病原細菌拮抗實驗

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、青枯假單胞菌和丁香假單胞菌劃線活化得到單菌落，挑取單菌落接種到lb液體培養(yǎng)基中活化。采用瓊脂平板擴散法，將1％病原細菌加入培養(yǎng)基中倒入培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿中放置牛津杯，在牛津杯中加入100μl濃度500μg/ml的4-vinylphenol，以水作為陰性對照，3個重復，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌置于37℃培養(yǎng)，青枯假單胞菌和丁香假單胞菌置于28℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

表4

+：表示有效果，-：表示無效果。

實驗例6：

病原真菌拮抗實驗

小麥立枯絲核菌，水稻立枯絲核菌，棉花立枯絲核菌，黑曲霉，油菜灰霉，小麥赤霉，辣椒灰霉，意大利青霉，油菜核盤菌，香蕉尖胞鐮刀菌，棉花尖胞鐮刀菌，稻瘟菌挑取菌絲接種到pda培養(yǎng)基上活化。采用瓊脂平板擴散法，挑取菌塊于pda培養(yǎng)基平板中心，用打孔器等距離打6個孔，加入100μl濃度500μg/ml的4-vinylphenol，以水作為陰性對照，3個重復，置于28℃培養(yǎng)(稻瘟菌和油菜核盤菌置于20℃)，觀察結(jié)果。

表5

+：表示有效果，-：表示無效果。