專利名稱：桑黃菌中環(huán)二肽c6的高壓反相制備分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Phellinus，子實(shí)體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時(shí)常龜裂，無皮殼，初期有細(xì)微絨毛，后變無毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無子實(shí)層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì).菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個(gè).孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級(jí)沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應(yīng)用最多的當(dāng)屬柱層析法，分為兩類:一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質(zhì)酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本發(fā)明使用多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離度高，應(yīng)用此發(fā)明可以精致到純品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phel linus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中環(huán)二妝 C6 的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進(jìn)行正相硅膠層析，采用氯仿與甲醇洗脫，，然后是甲醇凝膠層析，經(jīng)HPLC檢測(cè)后，進(jìn)行高壓反相制備，經(jīng)HPLC檢測(cè)，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥，即得環(huán)二肽C6，即六氫-7 -羥基-3 - (2 -甲基丙基)吡咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。此化合物目前已報(bào)道具有廣譜抗菌作用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20 35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到
2.5 4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力
0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0.5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；
(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60 90% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。分離環(huán)二肽C6的方法:
桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一甲醇梯度洗脫一HPLC檢測(cè)一高壓反相制備一HPLC檢測(cè)一ID-HNMR —環(huán)二肽 C6。具體方法為:
(1)制備桑黃菌粗提物；
(2)將上述步驟(I)所得的桑黃菌粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次；
(3)收集上述步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；
(4)使用HPLC檢測(cè)收集的步驟(3)得到的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進(jìn)行高壓反相層析，洗脫劑為甲醇與水；
(6)對(duì)步驟(5)得到的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測(cè)，減壓干燥，即為環(huán)二肽C6。本發(fā)明由桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì):本方法采用多種層析技術(shù)相結(jié)合，可以精致到結(jié)構(gòu)明確，純度大于95%的環(huán)二肽C6。技術(shù)路線成熟明確，高效精確。


圖1為環(huán)二肽C6的結(jié)構(gòu)式；
圖2為環(huán)二肽C6的一維核磁共振H譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1:` 桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到3時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量
0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到55% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。稱取粗提物300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=75:1分別洗脫4，5個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2。將Fr_2用甲醇溶解，進(jìn)行甲醇凝膠層析，洗脫劑為甲醇。然后是HPCL檢測(cè)，條件為Omin:0%甲醇，IOmin:100%甲醇，出峰時(shí)間為4.95min。然后，進(jìn)行高壓反相制備，A相為水，B相為甲醇。洗脫濃度為25%_75%的甲醇水溶液。收集洗脫液，減壓蒸干，HPLC檢測(cè)，適當(dāng)合并，進(jìn)行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為 400MHZ，分析結(jié)果為 δ 7.51 (s, 1H), 4.03 (dd, J = 34.9，28.1 Hz, 2H), 3.81-3.33 (m, 2H), 2.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H)，2.15 - 1.68 (m, 5H)，1.60 (dd, J =10.1, 3.8 Hz, 2H), 0.94 (ddd, J = 18.8，17.2, 9.8 Hz, 7H).證明是環(huán)二肽C6，即六氫-7 -羥基-3 - (2 -甲基丙基)卩比咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。實(shí)例2:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以30°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為180r/min，pH6條件下，震動(dòng)培養(yǎng)15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度30°C，發(fā)酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.1vvm,攪拌速度180轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到70% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。

稱取粗提物IOOg與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高0.Sm，直徑10cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=75:1分別洗脫4，5個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2。將Fr_2用甲醇溶解，進(jìn)行甲醇凝膠層析，洗脫劑為甲醇。然后是HPCL檢測(cè)，條件為Omin:0%甲醇，IOmin:100%甲醇，出峰時(shí)間為5.lOmin。然后，進(jìn)行高壓反相制備，A相為水，B相為甲醇。洗脫濃度為25%-70%的甲醇水溶液。收集洗脫液，減壓蒸干，HPLC檢測(cè)，適當(dāng)合并，進(jìn)行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為δ 7.51 (s, 1H)，4.03 (dd, J = 34.9, 28.1Hz, 2H), 3.81 - 3.33 (m, 2H)，2.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H)，2.15 - 1.68 (m, 5H)，1.60 (dd, J = 10.1, 3.8 Hz, 2H)，0.94 (ddd, J = 18.8, 17.2, 9.8 Hz, 7H).證明是環(huán)二肽C6，即六氫-7 -羥基-3 - (2 -甲基`丙基)卩比咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。
權(quán)利要求
1.桑黃菌中環(huán)二肽C6的高壓反相制備分離方法，其步驟順序如下: (1)制備桑黃菌粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的桑黃菌粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次； (3)收集上述步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (4)使用HPLC檢測(cè)收集的步驟(3)得到的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進(jìn)行高壓反相層析，洗脫劑為甲醇與水； (6)對(duì)步驟(5)得到的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測(cè)，減壓干燥，即為環(huán)二肽C6。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得: (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05% (2)如權(quán)利要求1所述桑黃粗提物的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20 35 °C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5 4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0.5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60 90% ； (5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。
3.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于所述的環(huán)二肽C6為六氫-7 -羥基-3 - (2 -甲基丙基)卩比咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。
4.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100目正相硅膠，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
5.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于，步驟(3)中所述的洗脫劑為甲醇。
6.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于，步驟(4)中所述的 HPLC 條件為 Omin:100% 水，IOmin:100% 甲醇。
7.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的反相材料為C-18或者C-8。
8.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的洗脫劑為甲醇:水=25%-75%。
9.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的高壓反相層析次數(shù)為1-3次。
10.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中環(huán)二肽C6的分離方法，其特征在于，步驟(6)所述的HPLC 出鋒時(shí)間為 4.95-5.47m in。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中環(huán)二肽C6的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進(jìn)行正相硅膠層析，采用氯仿與甲醇洗脫，然后是甲醇凝膠層析，經(jīng)HPLC檢測(cè)后，進(jìn)行高壓反相制備，經(jīng)HPLC檢測(cè)，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥，即得環(huán)二肽C6，即六氫-7-羥基-3-(2-甲基丙基)吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4-二酮。
文檔編號(hào)A01G1/04GK103145716SQ20131003653
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者趙晨, 宋愛榮, 孫效樂, 楊松, 張偉鑫 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)