專利名稱：一種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)和離體快速繁殖，尤其涉及一種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
獨一味是唇形科(Lamiaceae)獨一味屬多年生無莖草本植物,又名獨步通,藏語亦稱“大巴”、“打布巴”，產(chǎn)于我國青海、西藏、四川、云南西北部、甘肅，生于海拔270(T4500m的高山草甸、河灘草甸。獨一味味苦、微寒，根及根莖或全草入藥，藥材表面枯黃色或黃褐色，質(zhì)堅硬、干枯、氣腥臭，是我國藏、蒙、納西等民族民間常用草藥之一，具有止血、鎮(zhèn)痛、活血化瘀、抗菌消炎、增強(qiáng)免疫力等作用，藏醫(yī)將其用于骨髓炎、關(guān)節(jié)黃水病、骨折、跌傷、槍傷等。在我國一千多年前的藏醫(yī)學(xué)名著《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》中就已有記載。藏藥獨一味生長周期長，隨著奇正炎痛貼、獨一味片及膠囊等國家級新藥的大量生產(chǎn)，獨一味藥材已供不應(yīng)求。而獨一味藥材長期依賴野生采挖來滿足國內(nèi)外市場需求，種質(zhì)資源破壞嚴(yán)重、蘊 藏量急劇減少。尤其是近年來隨著國內(nèi)外對獨一味需求量的增加，大量掠奪性采挖，使獨一味逐漸成為瀕危植物，面臨物種喪失、資源枯竭的危險，因此進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)和擴(kuò)大獨一味繁育勢在必行。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是利用細(xì)胞的全能性(即個體的某個器官或組織已經(jīng)分化的細(xì)胞再生成完整個體的遺傳潛力。)，取植物個體上的細(xì)胞團(tuán)或組織，通過人工配制的培養(yǎng)基，使這些細(xì)胞團(tuán)或組織形成成千上萬個植株。利用組織培養(yǎng)進(jìn)行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內(nèi)均可快速大量繁殖；(2)便于保持優(yōu)良生物學(xué)特性；⑶在保存和繁育優(yōu)良突變體或優(yōu)良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優(yōu)勢的獨一味突變體或一個具明顯優(yōu)勢的后代經(jīng)組織培養(yǎng)后可大面積推廣等等。本發(fā)明首次采用無菌苗幼根為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)方法，開展野生獨一味種質(zhì)離體繁殖研究工作，這為挽救珍稀藏藥獨一味種質(zhì)資源，開展遺傳改良、促進(jìn)獨一味的工廠化育苗提供了一條新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種易于操作、可進(jìn)行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理選顆粒飽滿的獨一味種子，52°C的水浴鍋內(nèi)恒溫浴12min,置于500ppm赤霉素溶液中浸泡Ih后，用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌15 30秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的種子置于質(zhì)量濃度為0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡滅菌51分鐘，并用無菌去離子水沖洗3飛次后接種到MS無激素培養(yǎng)基上，其中每25ml所述MS無激素培養(yǎng)基中接種4粒所述消毒后的種子；3 4天后種子開始萌發(fā)，10天后將萌發(fā)的無菌苗的幼根作為初始培養(yǎng)外植體；
⑵外植體接種將所述外植體切成0. 3^0. 5cm長的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種2小段所述外植體；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30 60 umol m_2. s—1、光照時間為12 14 h cf1的條件下培養(yǎng)10 25天，在幼根兩端切口處膨大形成愈傷組織；
⑶愈傷組織增殖將所述愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織增殖培養(yǎng)基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的條件下愈傷組織增殖2(T35天，長出淺黃色、顆粒狀致密的愈傷組織；
⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將所述步驟⑶所得的愈傷組織接種到誘芽培養(yǎng)基上，其中每 25ml所述誘芽培養(yǎng)基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為25V ±2°C、光照強(qiáng)度為30飛0umol . m_2. s'光照時間為12 14 h cf1的條件下培養(yǎng)30 35天，形成叢生芽；
(5)叢生芽的增殖將所述叢生芽接種到芽增殖培養(yǎng)基上，其中每25ml所述芽增殖培養(yǎng)基中接種I棵所述叢生芽；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . m—2. s—1、光照時間為12 14 h . Cf1的條件下培養(yǎng)3(T35天，形成生長健壯的獨一味苗；
(6)生根誘導(dǎo)將所述叢生獨一味苗進(jìn)行分株，后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml所述生根培養(yǎng)基中接種I棵所述叢生獨一味苗；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的的條件下培養(yǎng)2(T30天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗；
(7)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進(jìn)行高溫消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)；所述育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)；
⑶植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株；所述一棵完整再生小苗種植在所述消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。所述步驟⑴中的獨一味為唇形科獨一味屬多年生草本植物。所述步驟⑴中的MS無激素培養(yǎng)基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，后加雙蒸餾水至1000ml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至
5.8，最后加入瓊脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟⑵中的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液(TlOml，濃度為
0.lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5 10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5 20ml，后加雙蒸餾水至1000ml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟⑶中的愈傷組織增殖培養(yǎng)基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟⑷中的誘芽培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液l(T30ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液(TlOml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121 °C高溫消毒即得。所述步驟(5)中的芽增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，濃度為0. lmg/ml的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉
6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟(6)中的生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液IOml，有機(jī)成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液(T20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟(7)中的育苗基質(zhì)總孔隙度為70% 75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。所述大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L,硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg/L,氯化鈣(CaCl2_ 2H20)440mg/L 的混合液。所述微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4 7H20)8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(KI) 0. 83mg/L，鑰酸鈉(NaMoO4 2H20)0. 25mg/L，硫酸銅(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化鈷(CoCl2'6H20) 0. 025mg/L 的混合液。所述有機(jī)成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素0. lmg/L,鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,煙酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。所述鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵(FeSO47H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA- 2H20 37. 3 mg/L的混合液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點
I、本發(fā)明首次采用幼葉外植體通過生物工程技術(shù)一組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行組織培養(yǎng)，克服了獨一味育苗周期過長、繁殖系數(shù)低的問題；同時開展野生獨一味種質(zhì)資源離體繁殖研究工作，為挽救珍稀藏藥獨一味種質(zhì)資源，開展遺傳改良、促進(jìn)獨一味的工廠化育苗提供了一條新途徑，提供了一種能進(jìn)行獨一味的人工繁殖、種質(zhì)資源離體保存、利用及選育藥用成分含量高的突變系的組織培養(yǎng)離體繁殖方法。
2、由于本發(fā)明所用培養(yǎng)基中含有植物激素2，4-D和6-BA，2，4_D激素屬細(xì)胞生長素類，此生長素的生理作用主要是促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂，具有誘導(dǎo)受傷的組織表面一至數(shù)層細(xì)胞恢復(fù)分裂能力的特點；6-BA激素屬細(xì)胞分裂素類，具有誘導(dǎo)芽分化的主導(dǎo)作用，促進(jìn)芽的分化和側(cè)芽萌發(fā)生長等特點，因此誘發(fā)時間短、出苗快、增殖頻率高，尤其出苗齊，煉苗后可直接成活，易于操作，可進(jìn)行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。3、本發(fā)明利用組織培養(yǎng)進(jìn)行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內(nèi)均可快速大量繁殖，即啟動快；⑵便于保持優(yōu)良生物學(xué)特性，即同步性好；(3)在保存和繁育優(yōu)良突變體或優(yōu)良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優(yōu)勢的獨一味突變體或一個具明顯優(yōu)勢的后代經(jīng)組織培養(yǎng)后可大面積推廣等等。
具體實施方式
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實施例I 一種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理選顆粒飽滿的獨一味種子，52°C的水浴鍋內(nèi)恒溫浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌15秒，然后以無菌去離子水沖洗2次，再將沖洗后的種子置于質(zhì)量濃度為0. 1%%的升汞中，浸泡滅菌8分鐘，并用無菌去離子水沖洗3次后接種到MS無激素培養(yǎng)基上，其中每25mlMS無激素培養(yǎng)基中接種4粒消毒后的種子；3 4天后種子開始萌發(fā)，10天后將萌發(fā)的無菌苗的幼根作為初始培養(yǎng)外植體。MS無激素培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑵外植體接種將外植體切成0. 3^0. 5cm長的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種2小段外植體；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30 60 umol m_2. s—1、光照時間為12 14 h . cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 25天，在幼根兩端切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液0 ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5 ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . m_2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)愈傷組織增殖2(T35天，長出淺黃色、顆粒狀致密的愈傷組織。愈傷組織增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將步驟⑶所得的愈傷組織接種到誘芽培養(yǎng)基上，其中每25ml誘芽培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . nT2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成叢生芽。
誘芽培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液0ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(5)叢生芽的增殖將叢生芽接種到芽增殖培養(yǎng)基上，其中每25ml芽增殖培養(yǎng)基中接種I棵叢生芽；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol nT2. s—1、光照時間為12^14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成生長健壯的獨一味苗。芽增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(6)生根誘導(dǎo)將叢生獨一味苗進(jìn)行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵叢生獨一味苗；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol .m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2(T30天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進(jìn)行自養(yǎng)生長的幼小植株。生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液0 ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后,加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(7)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進(jìn)行高溫消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為709^75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。(8)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。實施例2 —種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理選顆粒飽滿的獨一味種子，52°C的水浴鍋內(nèi)恒溫浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌20秒，然后以無菌去離子水沖洗2次，再將沖洗后的種子置于質(zhì)量濃度為0. 15%的升汞中，浸泡滅菌6分鐘，并用無菌去離子水沖洗4次后接種到MS無激素培養(yǎng)基上，其中每25mlMS無激素培養(yǎng)基中接種4粒消毒后的種子；3 4天后種子開始萌發(fā)，10天后將萌發(fā)的無菌苗的幼根作為初始培養(yǎng)外植體。MS無激素培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑵外植體接種將外植體切成0. 3^0. 5cm長的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種2小段外植體；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30 60 umol nT2. S—1、光照時間為12 14 h . cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 25天，在幼根 兩端切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . m_2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)愈傷組織增殖2(T35天，長出淺黃色、顆粒狀致密的愈傷組織。愈傷組織增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將步驟⑶所得的愈傷組織接種到誘芽培養(yǎng)基上，其中每25ml誘芽培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . nT2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成叢生芽。誘芽培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(5)叢生芽的增殖將叢生芽接種到芽增殖培養(yǎng)基上，其中每25ml芽增殖培養(yǎng)基中接種I棵叢生芽；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol nT2. s—1、光照時間為12^14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成生長健壯的獨一味苗。芽增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(6)生根誘導(dǎo)將叢生獨一味苗進(jìn)行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵叢生獨一味苗；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol .m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2(T30天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進(jìn)行自養(yǎng)生長的幼小植株。 生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(7)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進(jìn)行高溫消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為709^75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。(8)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。實施例3 —種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理選顆粒飽滿的獨一味種子，52°C的水浴鍋內(nèi)恒溫浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌25秒，然后以無菌去離子水沖洗3次，再將沖洗后的種子置于質(zhì)量濃度為0. 2%的升汞中，浸泡滅菌5分鐘，并用無菌去離子水沖洗6次后接種到MS無激素培養(yǎng)基上，其中每25mlMS無激素培養(yǎng)基中接種4粒消毒后的種子；3 4天后種子開始萌發(fā)，10天后將萌發(fā)的無菌苗的幼根作為初始培養(yǎng)外植體。MS無激素培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑵外植體接種將外植體切成0. 3^0. 5cm長的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種2小段外植體；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30 60 umol nT2. S—1、光照時間為12 14 h . cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 25天，在幼根兩端切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液8ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)愈傷組織增殖2(T35天，長出淺黃色、顆粒狀致密的愈傷組織。愈傷組織增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將步驟⑶所得的愈傷組織接種到誘芽培養(yǎng)基上，其中每25ml誘芽培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . nT2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成叢生芽。誘芽培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(5)叢生芽的增殖將叢生芽接種到芽增殖培養(yǎng)基上，其中每25ml芽增殖培養(yǎng)基中接種I棵叢生芽；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol nT2. s—1、光照時間為12^14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成生長健壯的獨一味苗。芽增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(6)生根誘導(dǎo)將叢生獨一味苗進(jìn)行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵叢生獨一味苗；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30飛0 umol .m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2(T30天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進(jìn)行自養(yǎng)生長的幼小植株。生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(7)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進(jìn)行高溫消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為709^75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。
(8)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。實施例4 一種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理選顆粒飽滿的獨一味種子，52°C的水浴鍋內(nèi)恒溫浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌30秒，然后以無菌去離子水沖洗3次，再將沖洗后的種子置于質(zhì)量濃度為0. 2%的升汞中，浸泡滅菌6分鐘，并用無菌去離子水沖洗6次后接種到MS無激素培養(yǎng)基上，其中每25mlMS無激素培養(yǎng)基中接種4粒消毒后的種子；3 4天后種子開始萌發(fā)，10天后將萌發(fā)的無菌苗的幼根作為初始培養(yǎng)外植體。MS無激素培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑵外植體接種將外植體切成0. 3^0. 5cm長的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種2小段外植體；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30 60 umol nT2. S—1、光照時間為12 14 h . cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 25天，在幼根兩端切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . m_2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)愈傷組織增殖2(T35天，長出淺黃色、顆粒狀致密的愈傷組織。
愈傷組織增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將步驟⑶所得的愈傷組織接種到誘芽培養(yǎng)基上，其中每25ml誘芽培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . nT2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成叢生芽。誘芽培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液30ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
(5)叢生芽的增殖將叢生芽接種到芽增殖培養(yǎng)基上，其中每25ml芽增殖培養(yǎng)基中接種I棵叢生芽；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol nT2. s—1、光照時間為12^14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成生長健壯的獨一味苗。芽增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(6)生根誘導(dǎo)將叢生獨一味苗進(jìn)行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵叢生獨一味苗；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol .m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2(T30天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進(jìn)行自養(yǎng)生長的幼小植株。生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液IOml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(7)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進(jìn)行高溫消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為709^75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。(8)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。實施例5 —種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理選顆粒飽滿的獨一味種子，52°C的水浴鍋內(nèi)恒溫浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌30秒，然后以無菌去離子水沖洗3次，再將沖洗后的種子置于質(zhì)量濃度為0. 2%的升汞中，浸泡滅菌8分鐘，并用無菌去離子水沖洗6次后接種到MS無激素培養(yǎng)基上，其中每25mlMS無激素培養(yǎng)基中接種4粒消毒后的種子；3 4天后種子開始萌發(fā)，10天后將萌發(fā)的無菌苗的幼根作為初始培養(yǎng)外植體。MS無激素培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克， 后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑵外植體接種將外植體切成0. 3^0. 5cm長的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種2小段外植體；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30 60 umol nT2. S—1、光照時間為12 14 h . cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 25天，在幼根兩端切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . m_2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)愈傷組織增殖2(T35天，長出淺黃色、顆粒狀致密的愈傷組織。愈傷組織增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將步驟⑶所得的愈傷組織接種到誘芽培養(yǎng)基上，其中每25ml誘芽培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . nT2.s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成叢生芽。誘芽培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液30ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液IOml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(5)叢生芽的增殖將叢生芽接種到芽增殖培養(yǎng)基上，其中每25ml芽增殖培養(yǎng)基中接種I棵叢生芽；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol nT2. s—1、光照時間為12^14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3(T35天，形成生長健壯的獨一味苗。芽增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(6)生根誘導(dǎo)將叢生獨一味苗進(jìn)行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口
膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵叢生獨一味苗；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol .m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2(T30天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進(jìn)行自養(yǎng)生長的幼小植株。生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液20ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(7)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進(jìn)行高溫消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為709^75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。(8)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。上述實施例1 5中的獨一味為唇形科獨一味屬多年生草本植物獨一味(Lamiophlomis rotate (Benth. ) Kudo);超凈工作臺，型號為BCM-1000A,由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)。MS無激素培養(yǎng)基、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、愈傷組織增殖培養(yǎng)基、誘芽培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L，硝酸鉀(KNO3)1900mg/L,硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg/L,氯化鈣(CaCl2_ 2H20)440mg/L的混合液；微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L,硫酸鋅(ZnSO4 7H20) 8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(KI) 0. 83mg/L，鑰酸鈉(NaMoO4 2H20)0. 25mg/L，硫酸銅(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化鈷(CoCl2_ 6H20) 0. 025mg/L 的混合液；有機(jī)成分母液是指含有甘氨酸2mg/L,鹽酸硫胺素0. lmg/L,鹽酸批卩多醇0. 5mg/L,煙酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液；鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵(FeSO4 7H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA 2H2037. 3 mg/ L的混合液。
權(quán)利要求
1.ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟 ⑴外植體的選擇和消毒處理選顆粒飽滿的獨一味種子，52°C的水浴鍋內(nèi)恒溫浴12min,置于500ppm赤霉素溶液中浸泡Ih后，用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌15 30秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的種子置于質(zhì)量濃度為0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡滅菌51分鐘，并用無菌去離子水沖洗3飛次后接種到MS無激素培養(yǎng)基上，其中每25ml所述MS無激素培養(yǎng)基中接種4粒所述消毒后的種子；3 4天后種子開始萌發(fā)，10天后將萌發(fā)的無菌苗的幼根作為初始培養(yǎng)外植體； ⑵外植體接種將所述外植體切成0. 3^0. 5cm長的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種2小段所述外植體；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為30 60 umol m_2. s—1、光照時間為12 14 h cf1的條件下培養(yǎng)10 25天，在幼根兩端切ロ處膨大形成愈傷組織； ⑶愈傷組織増殖將所述愈傷組織接種到愈傷組織増殖培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織増殖培養(yǎng)基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的條件下愈傷組織増殖2(T35天，長出淺黃色、顆粒狀致密的愈傷組織； ⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將所述步驟⑶所得的愈傷組織接種到誘芽培養(yǎng)基上，其中每25ml所述誘芽培養(yǎng)基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為25V ±2°C、光照強(qiáng)度為30飛0umol . m_2. s'光照時間為12 14 h cf1的條件下培養(yǎng)30 35天，形成叢生芽； (5)叢生芽的増殖將所述叢生芽接種到芽増殖培養(yǎng)基上，其中每25ml所述芽增殖培養(yǎng)基中接種I棵所述叢生芽；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol . m—2. s—1、光照時間為12 14 h . Cf1的條件下培養(yǎng)3(T35天，形成生長健壯的獨一味苗； (6)生根誘導(dǎo)將所述叢生獨一味苗進(jìn)行分株，后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml所述生根培養(yǎng)基中接種I棵所述叢生獨一味苗；在溫度為25°C ±2°C、光照強(qiáng)度為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 14 h .Cf1的的條件下培養(yǎng)2(T30天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗； (7)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進(jìn)行高溫消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)；所述育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)； ⑶植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株；所述ー棵完整再生小苗種植在所述消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑴中的獨一味為唇形科獨一味屬多年生草本植物。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑴中的MS無激素培養(yǎng)基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機(jī)成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加雙蒸餾水至1000ml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
4.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑵中的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為o. lmg/ml的2，4- ニ氯苯氧こ酸母液(TlOml,濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液5 10ml，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液5 20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
5.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑶中的愈傷組織增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4-ニ氯苯氧こ酸母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液IOml,濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，カロ入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
6.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步 驟⑷中的誘芽培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml，有機(jī)成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-節(jié)氨基腺嘌呤母液l(T30ml,濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液(TlOml,后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
7.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟(5)中的芽增殖培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液IOOml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液5ml，濃度為0.lmg/ml的2，4-ニ氯苯氧こ酸母液2ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后,加入ImMNaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經(jīng)121 °C高溫消毒即得。
8.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟(6)中的生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有機(jī)成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液(T20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
9.如權(quán)利要求I所述的ー種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟(7)中的育苗基質(zhì)總孔隙度為709^75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種獨一味組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，該方法包括以下步驟⑴外植體的選擇和消毒處理將獨一味種子經(jīng)浸泡滅菌、沖洗、接種，得初始培養(yǎng)外植體；⑵外植體接種將外植體切段，接種形成愈傷組織；⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種進(jìn)行增殖，形成致密的愈傷組織；⑷愈傷組織的芽誘導(dǎo)將致密的愈傷組織接種形成叢生芽；⑸叢生芽的增殖將叢生芽接種形成生長健壯的獨一味苗；⑹生根誘導(dǎo)將叢生獨一味苗進(jìn)行分株后接種培養(yǎng)，得完整再生小苗；⑺育苗基質(zhì)消毒；⑻植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常獨一味植株。本發(fā)明克服了獨一味育苗周期過長、繁殖系數(shù)低的問題，易于操作、可進(jìn)行工廠化快速育苗。
文檔編號A01H4/00GK102657086SQ20121014378
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者周國英, 孫菁, 宋文珠, 徐文華 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所