專利名稱：一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于線蟲人工飼養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法。
背景技術(shù)：
松材線蟲Bursaphelenchus xylophiIus屬螺形動物門，線蟲綱，墊刃目，滑刃總科，傘刃屬。線蟲成蟲蟲體細(xì)長，體長約1_，雌蟲尾部近圓錐形，末端圓。雄蟲尾部似鳥爪，向腹面彎曲。松材線蟲病又稱松枯萎病，是一種毀滅性病害。國家林業(yè)局在2009年第3號公告，松材線蟲病疫區(qū)為江蘇、浙江、安徽、江西、山東、福建、湖北、湖南、廣東、重慶、云南、廣西、重慶、四川等15個省、區(qū)、市的193個縣(市、區(qū))。據(jù)統(tǒng)計，2008年全國松材線蟲病發(fā)生面積96. 42萬畝，病死松樹106. 17萬株。不僅直接破壞了自然景觀及生態(tài)環(huán)境，給國民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，更對我國松林資源，尤其是對我國南方廣泛栽植的330多萬hm2松林和重要生態(tài)區(qū)域構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，同時，也嚴(yán)重地影響著我國外貿(mào)出口競爭力。根據(jù)植物病理學(xué)的經(jīng)典柯赫氏法則，要對由松材線蟲引起的松材線蟲病進(jìn)行研究，獲得松材線蟲的培養(yǎng)方法是整個研究的關(guān)鍵。因此，要對松材線蟲進(jìn)行研究，首先就要獲得大量的線蟲。前人對松材線蟲的培養(yǎng)方法歸納起來主要有2大類3種方法①單異活體培養(yǎng)——人工培養(yǎng)基培養(yǎng)松材線蟲，又分為2種，一種是用人工培養(yǎng)基先培養(yǎng)真菌，然后利用真菌培養(yǎng)；另一種則利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)松樹愈傷組織，然后以松樹愈傷組織為食料培養(yǎng)。②無異活體培養(yǎng)——人工合成培養(yǎng)基直接培養(yǎng)松材線蟲。目前無菌松材線蟲的人工培養(yǎng)方法主要有單異活體培養(yǎng)和無異活體法，但也有學(xué)者指出這兩種方法的主要缺點是操作過程較為繁瑣，得到的無菌線蟲數(shù)量較少，難以滿足研究需要，食料真菌培養(yǎng)法其操作過程較為繁雜，易污染，難以排除食料真菌或消毒劑對實驗的影響；無異活體培養(yǎng)法其培養(yǎng)周期較長，產(chǎn)量較低，而且長期培養(yǎng)還可能會改變松材線蟲原有的生物學(xué)特性。在黑松愈傷組織上培養(yǎng)無菌松材線蟲既克服了食料真菌法的缺點，又較無異活體培養(yǎng)法所用培養(yǎng)周期短，產(chǎn)量要高；但是幾次繼代后的線蟲體型較小，保藏不方便。所以不管是單異活體培養(yǎng)還是無異活體法，建立一套科學(xué)完整的松材線蟲人工飼養(yǎng)體系，是以后松材線蟲人工培養(yǎng)的研究方向和關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法的技術(shù)方案，具有飼養(yǎng)成本低，操作簡便，應(yīng)用范圍廣，線蟲產(chǎn)量高，同時不會改變松材線蟲原有的生物學(xué)特性。所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于包括以下步驟
1)按照松木屑15-20%、黃瓜15-20%、香蕉15-20%、蘋果15_20%、豌豆15_20%、麥芽糖15-20%的比例稱取上述物質(zhì)，均粉碎至150-200目，備用；
2)將松木屑粉碎物用三層紗布包好放入盛滿清水的漏斗中，漏斗下接一段8-15cm長的橡皮管，橡皮管上裝一個截流彈簧夾，13-17h后打開彈簧夾，用離心管接取橡皮管中水樣；靜置15-30 min，然后在轉(zhuǎn)速1500_2000r/min下離心2_5 min，除去離心管內(nèi)上層清液后，即獲得濃度較高的松材線蟲懸浮液，備用；
3)將黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物Ig加水量4-7ml的比例加水，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入真菌，真菌的加入重量為粉碎混合物重量的O. 08-0. 2倍，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?6 - 30°C下靜置2_3h，然后取步驟I)中的松材線蟲懸浮液1-2滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，即得松材線蟲人工飼養(yǎng)液。所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟I)中松木屑的含量為16-18%，黃瓜的含量為16-18%，香蕉的含量為16-18%，蘋果的含量為16_18%，豌豆的含量為16-18%，麥芽糖的含量為16-18%。
所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟2)中橡皮管的長度為10-12 cm，截流彈簧夾夾住的時間為14-16h，靜置時間20-25 min，轉(zhuǎn)速1600_1800r/min,離心時間3-4 min。所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟3)中黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物在水中浸泡時間3. 5-4. 5h。所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟3)中靜置溫度27 — 29°C，時間為 2. 2-2. 8h。所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟3)中所述的真菌為長喙殼菌、酵母菌、毛殼菌、鐮刀菌、灰葡萄胞菌中的一種或一種以上混合物。上述一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，以松材疫木上分離得到的松材線蟲為培養(yǎng)對象，通過人工飼養(yǎng)，獲得研究所需的合格松材線蟲，其操作過程簡便，長期飼養(yǎng)也不會改變松材線蟲原有的生物學(xué)特性。其飼養(yǎng)方法簡單易行，周期短，線蟲產(chǎn)量高，效果好，生產(chǎn)成本低廉，品種優(yōu)良，能顯著提高松材線蟲飼養(yǎng)的存活率和繁殖率。本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，其它的均為純物質(zhì)的重量百分含量。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并結(jié)合試驗進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。實施例I
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各20g，均粉碎至200目，然后加入IOOml的水浸泡5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入長喙殼菌2g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0°C下靜置3h，然后取松材線蟲懸浮液2滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，最后置于溫度為26°C，濕度為85%的恒溫恒濕箱中正常飼養(yǎng)。實施例2
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各15g，均粉碎至170目，然后加入IOOml的水浸泡4h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入酵母菌2g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0°C下靜置2. 4h，然后取松材線蟲懸浮液I滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，最后置于溫度為24°C，濕度為79%的恒溫恒濕箱中正常飼養(yǎng)。
實施例3
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各16g，均粉碎至190目，然后加入IOOml的水浸泡3. 5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入長喙殼菌O. 4g、酵母菌O. 4g、毛殼菌O. 4g、鐮刀菌O. 4g、灰葡萄胞菌O. 4g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?9°C下靜置2. 8h，然后取松材線蟲懸浮液2滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，最后置于溫度為26°C，濕度為85%的恒溫恒濕箱中正常飼養(yǎng)。實施例4
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各17g，均粉碎至160目，然后加入IOOml的水浸泡4. 5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入毛殼菌2g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?8°C下靜置2. 5h，然后取松材線蟲懸浮液I滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，最后置于溫度為24°C，濕度為78%的恒溫恒濕箱中正常飼養(yǎng)。實施例5
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各18g，均粉碎至180目，然后加入IOOml的水浸泡5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入鐮刀菌、灰葡萄胞菌各lg，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?7°C下靜置2. 2h，然后取松材線蟲懸浮液2滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，最后置于溫度為25°C，濕度為80%的恒溫恒濕箱中正常飼養(yǎng)。實施例6
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各20g，均粉碎至150目，然后加入IOOml的水浸泡3h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入酵母菌、灰葡萄胞菌各lg，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?6°C下靜置2h，然后取松材線蟲懸浮液I滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，最后置于溫度為23°C，濕度為75%的恒溫恒濕箱中正常飼養(yǎng)。以下通過試驗說明上述松材線蟲飼養(yǎng)方法的良好效果。表I實施例1-6對松材線蟲在不同飼養(yǎng)天數(shù)下存活率的試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)按照松木屑15-20%、黃瓜15-20%、香蕉15-20%、蘋果15_20%、豌豆15_20%、麥芽糖15-20%的比例稱取上述物質(zhì)，均粉碎至150-200目，備用； 2)將松木屑粉碎物用三層紗布包好放入盛滿清水的漏斗中，漏斗下接一段8-15cm長的橡皮管，橡皮管上裝一個截流彈簧夾，13_17h后打開彈簧夾，用離心管接取橡皮管中水樣；靜置15-30 min，然后在轉(zhuǎn)速1500_2000r/min下離心2_5 min，除去離心管內(nèi)上層清液后，即獲得濃度較高的松材線蟲懸浮液，備用； 3)將黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物Ig加水量4-7ml的比例加水，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入真菌，真菌的加入重量為粉碎混合物重量的O. 08-0. 2倍，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?6 - 30°C下靜置2_3h，然后取步驟I)中的松材線蟲懸浮液1-2滴，接種到上述飼養(yǎng)液中，即得松材線蟲人工飼養(yǎng)液。
2.如權(quán)利I所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟I)中松木屑的含量為16-18%，黃瓜的含量為16-18%，香蕉的含量為16-18%，蘋果的含量為16_18%，豌豆的含量為16-18%，麥芽糖的含量為16-18%。
3.如權(quán)利I所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟2)中橡皮管的長度為10-12 cm，截流彈簧夾夾住的時間為14-16h，靜置時間20-25 min，轉(zhuǎn)速1600-1800r/min,離心時間 3-4 min。
4.如權(quán)利I所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟3)中黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物在水中浸泡時間3. 5-4. 5h。
5.如權(quán)利I所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟3)中靜置溫度 27 — 29°C，時間為 2. 2-2. 8h。
6.如權(quán)利I所述的一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，其特征在于步驟3)中所述的真菌為長喙殼菌、酵母菌、毛殼菌、鐮刀菌、灰葡萄胞菌中的一種或一種以上混合物。
全文摘要
一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，屬于線蟲人工飼養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于包括以下步驟1)按照比例稱取原料粉碎備用；2)獲得濃度較高的松材線蟲懸浮液；3)部分粉碎混合物加入水中浸泡過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入真菌，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?6－30℃下靜置2-3h，然后再加入松材線蟲懸浮液1-2滴，即得松材線蟲人工飼養(yǎng)液。上述一種松材線蟲人工飼養(yǎng)液的制備方法，以松材疫木上分離得到的松材線蟲為培養(yǎng)對象，通過人工飼養(yǎng)，獲得研究所需的合格松材線蟲，其操作過程簡便，長期飼養(yǎng)也不會改變松材線蟲原有的生物學(xué)特性。其飼養(yǎng)方法簡單易行，周期短，線蟲產(chǎn)量高，效果好，生產(chǎn)成本低廉，品種優(yōu)良。
文檔編號A23K1/18GK102613406SQ20121008508
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者胡加付, 蘇秀, 郭愷, 黃小娟 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)