專利名稱：具有從磷酸二羥丙酮到甘油的途徑被破壞的酵母細(xì)胞的制作方法
具有從磷酸二羥丙酮到甘油的途徑被破壞的酵母細(xì)胞
本發(fā)明是在與美國能源部合同號DE-FC36-03GO13145下完成 的。美國政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。
本申請要求于2006年3月13日申請的美國臨時(shí)申請?zhí)?60/781,674的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明涉及某種遺傳修飾的酵母，并涉及使用這樣的遺傳修飾酵 母而生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵方法。
酵母在許多工業(yè)發(fā)酵中用作生物催化劑。人們對使用酵母發(fā)酵糖
類以生產(chǎn)有機(jī)酸(例如乳酸)的興趣一直在持續(xù)增加。在這樣的發(fā)酵中， 隨著有機(jī)酸產(chǎn)生得越多，發(fā)酵培養(yǎng)基越來越酸化。大多數(shù)產(chǎn)生這些有 機(jī)酸的細(xì)菌在強(qiáng)酸環(huán)境下表現(xiàn)不良——在這樣的條件下它們要么無 法生存，要么生產(chǎn)產(chǎn)物緩慢，以至于經(jīng)濟(jì)上不可行。所以，有必要緩 沖培養(yǎng)基以維持較高pH。這對回收酸性形式的產(chǎn)品而言會帶來困難。 最好在較低pH下進(jìn)行發(fā)酵，在這種情況下產(chǎn)品部分或全部呈酸性形 式。
已經(jīng)考慮了多種酵母作為這類低pH發(fā)酵的候選者。多種酵母能 天然發(fā)酵己糖而產(chǎn)生乙醇，但是極少(如果有的話)能天然產(chǎn)生高收率 的有機(jī)酸，例如乳酸。因此，已經(jīng)進(jìn)行了許多工作，對各種酵母進(jìn)行 遺傳修飾，插入一個(gè)或多個(gè)能使細(xì)胞產(chǎn)生乳酸的基因。為了使糖代謝 從乙醇生產(chǎn)轉(zhuǎn)向乳酸生產(chǎn)，也對這些細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以破壞或缺 失天然丙酮酸脫羧酶(尸DQ基因。這項(xiàng)工作可參見例如WO 99/14335、 WO 00/71738 Al、 WO 02/42471 A2、 WO 03/049525 A2、 WO 03/102152 A2和WO 03/102201 A2。
在許多這類酵母發(fā)酵中可高收率地產(chǎn)生甘油。甘油可作為細(xì)胞 的滲透壓保護(hù)劑。甘油的形成可有助于在發(fā)酵條件下再生氧化還原輔因子。
許多酵母細(xì)胞都產(chǎn)生甘油，即通過代謝磷酸二羥丙酮(DHAP)。 在多種酵母中，DHAP通過甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD,系統(tǒng)名稱為sn-甘油-3-磷酸:NAD十2-氧化還原酶，EC 1丄1.8)還原，生成甘油-3-磷酸 (G3P)。 G3P作為脂質(zhì)生物合成的前體以及甘油前體。G3P通過甘油-3-磷酸酶(GPP,系統(tǒng)名稱為甘油-l-磷酸磷酸水解酶，EC 3丄3.21)脫去磷 酸，生成甘油。
甘油的產(chǎn)生有一個(gè)替代途徑，該途徑對某些酵母(例如粟酒裂殖 酵母(S. pom&))而言是至關(guān)重要的。在該途徑中，磷酸二羥丙酮通過 磷酸二羥丙酮磷酸酶脫去磷酸，生成二羥丙酮。然后，再通過NADf^ 依賴性甘油脫氪酶(系統(tǒng)名稱為甘油^八0+ 2-氧化還原酶，EC 1.1.1.6) 并伴隨NADH氧化，使二羥丙酮轉(zhuǎn)變?yōu)楦视汀?br> 因?yàn)楫a(chǎn)生甘油會消耗碳，而這些碳原本可用于產(chǎn)生更多所需發(fā) 酵產(chǎn)物，所以這類甘油的產(chǎn)生是收率損失的重要來源。另外，產(chǎn)生甘 油還會消耗ATP和NADH。這消耗了產(chǎn)生生物量或所需產(chǎn)物所需的 能量。因?yàn)檫@些原因，所以最好使細(xì)胞減少或消除甘油的產(chǎn)生。進(jìn)一 步的考慮是，減少或消除甘油的產(chǎn)生還可簡化對所需產(chǎn)物的回收和純 化。
一種釀酒酵母(5Wcc/zaramyc^ cwev/w'ae)菌才朱經(jīng)遺傳工程缺失其 天然GPD基因，因此細(xì)胞喪失GPD酶并能阻止甘油的產(chǎn)生。參見 Nissen等，"Anaerobic and aerobic batch cultivations of 5"acc/zar畫ycas cere由'ae mutants impaired in glycerol synthesis", F"ea^， 2000: 16:463-474。 Nissen等人報(bào)告，當(dāng)兩個(gè)天然GPD基因都被破壞之后， 突變細(xì)胞在厭氧和好氧條件下生長都很差。根據(jù)Nissen等，突變細(xì)胞 的甘油產(chǎn)量比野生型細(xì)胞少得多。Nissen等人假設(shè)，在雙重缺失菌抹 中所觀察的生長不良，是因?yàn)榧?xì)胞NAD+貯庫的缺失，因?yàn)楦视偷漠a(chǎn) 生不能氧化細(xì)胞中的NADH。
最好能提供這樣的酵母細(xì)胞所述細(xì)胞產(chǎn)生所需有機(jī)產(chǎn)物，而不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生甘油，而且在好氧條件、厭氧條件或好氧條件和厭氧 條件下也能生長良好。
一方面，本發(fā)明是全基因組重復(fù)前酵母種(pre-whole genome duplication yeast species)的突變酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞具有從磷酸二羥丙 酮到甘油的天然代謝途徑的缺失或破壞。天然代謝途徑的缺失或破壞 可包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD)基因的缺失或破壞。天 然代謝途徑的缺失或破壞可包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶(GPP)基 因的缺失或破壞。它可包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氬酶(GPD)基 因和至少一個(gè)天然甘油—3-磷酸酶(GPP)基因的缺失或破壞。天然代謝 途徑的缺失或破壞可包括至少一個(gè)天然二羥丙酮磷酸磷酸酶基因的 缺失或破壞、天然甘油脫氫酶基因的缺失或破壞、或這兩個(gè)基因同時(shí) 都缺失或破壞。
另一方面，本發(fā)明是全基因組重復(fù)前酵母種的突變酵母細(xì)胞，所 述突變細(xì)胞當(dāng)在以下標(biāo)準(zhǔn)微好氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生2.0 g/L以下 的甘油
A. 成分確定的含水培養(yǎng)基，其在培養(yǎng)開始時(shí)含有5g/L硫酸銨、 3g/L磷酸二氫鉀、0.5g/L硫酸鎂、痕量元素、維生素、150g/L葡萄 糖；
B. 培養(yǎng)開始時(shí)pH為3.5，培養(yǎng)期間如有必要則緩沖發(fā)酵培養(yǎng)基 以防pH降至3.0以下或升至7.0以上；
C. 接種酵母細(xì)胞培養(yǎng)至OD6oo為1.0;
D. 培養(yǎng)溫度30。C;
E. 持續(xù)培養(yǎng)直到葡萄糖濃度降至10g/L，但不超過120小時(shí)；
F. 通氣和攪拌以達(dá)到才聶氧率為5.0± 1.0mmol/L/hr。 另一方面，本發(fā)明是全基因組重復(fù)前酵母種的突變酵母細(xì)胞，所
述細(xì)胞缺乏產(chǎn)生活性甘油-3-磷酸脫氫酶(GDP)的能力。對于本發(fā)明的 目的，與野生型菌抹酶活性相比，當(dāng)細(xì)胞中某酶的活性降低至少75%、 優(yōu)選至少90%時(shí)，就認(rèn)為細(xì)胞缺乏產(chǎn)生該酶的能力?？梢圆捎煤线m測定方法，檢測任一特定酶的酶活性。市售測定試劑盒可用于測定甘油
-3-磷酸脫氫酶活性。這類產(chǎn)品的一個(gè)實(shí)例稱為MK426 (Takara Bio, Inc.), 得自Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania。
另一方面，本發(fā)明是全基因組重復(fù)前酵母種的突變酵母細(xì)胞，所 述細(xì)胞缺乏產(chǎn)生活性甘油-3-磷酸酶的能力。
另一方面，本發(fā)明是突變酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞缺乏產(chǎn)生活性磷酸 二羥丙酮磷酸酶的能力，而野生型酵母細(xì)胞可天然產(chǎn)生該酶；所述細(xì) 胞缺乏產(chǎn)生活性NADJ^依賴性甘油脫氫酶的能力，而野生型酵母細(xì) 胞可天然產(chǎn)生該酶；或所述細(xì)胞同時(shí)缺乏產(chǎn)生這兩種酶的能力。
另一方面，本發(fā)明是突變酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而產(chǎn) 生有機(jī)酸產(chǎn)物，所述酵母細(xì)胞還具有從磷酸二羥丙酮到甘油的天然代 謝途徑的缺失或破壞和從丙酮酸到乙醇的天然代謝途徑的缺失或破 壞。天然代謝途徑的缺失或破壞可包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氫 酶基因的缺失或破壞。天然代謝途徑的缺失或破壞可包括至少一個(gè)天 然甘油_3-磷酸酶基因的缺失或破壞。它可包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氫酶基因和至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的細(xì)胞在發(fā)酵條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的甘油 水平非常低。在發(fā)酵條件的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)甘油產(chǎn)量低于0.2g/L。令人 吃驚的是，本發(fā)明的細(xì)胞在發(fā)酵條件下生長良好，盡管缺乏甘油產(chǎn)生， 而且在某些實(shí)施方案中盡管缺乏甘油-3-磷酸產(chǎn)生。也發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的細(xì) 胞在某些情況下具有改善的耐酸性。因此，本發(fā)明也是發(fā)酵方法，其 中在發(fā)酵條件下培養(yǎng)本發(fā)明上述方面的任一項(xiàng)的細(xì)胞，產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn) 物，其中碳源至甘油的收率低于2%(重量)。


圖1是描述pBH158質(zhì)粒的圖。 圖2是描述pBH159質(zhì)粒的圖。 圖3是描述pBH160質(zhì)粒的圖。 圖4是描述pBH161質(zhì)粒的圖。圖5是描述pMM28質(zhì)粒的圖。 圖6是描述pMI318質(zhì)粒的圖。 圖7是描述pMI321質(zhì)粒的圖。 圖8是描述pMI355質(zhì)粒的圖。 圖9是描述pMI357質(zhì)粒的圖。
圖10是描述pMI433質(zhì)粒的圖。
圖11是描述pMI449質(zhì)粒的圖。
圖12是描述pMI454質(zhì)粒的圖。
圖13是描述pBH165質(zhì)粒的圖。
圖14是描述pTMC61質(zhì)粒的圖。
-飾而
制備的。當(dāng)宿主酵母細(xì)胞為野生型菌抹時(shí)，能天然代謝至少一種糖產(chǎn) 生甘油。天然代謝途徑可包括從磷酸二羥丙酮至甘油-3-磷酸再至甘油 的代謝途徑。天然途徑可包括從^疇酸二羥丙酮至二羥丙酮再至甘油的 代謝途徑。宿主細(xì)胞可含有這兩種天然代謝途徑。
當(dāng)在本文中用于遺傳材料(例如基因、啟動子、終止子或其它DNA 序列)時(shí)，術(shù)語"天然"是指該種酵母的野生型細(xì)胞基因組內(nèi)存在的遺 傳材料(除了不影響功能的一對一突變之外)。"天然能力"(及其變形 例如"天然能夠")是指野生型細(xì)胞表現(xiàn)指定功能的能力。例如，如果 某種野生型細(xì)胞在任何遺傳修飾之前具有代謝糖產(chǎn)生甘油的能力，則 認(rèn)為這種細(xì)胞具有天然能力。如果某基因在細(xì)胞內(nèi)的功能是產(chǎn)生活性 蛋白，就認(rèn)為該基因在細(xì)胞內(nèi)是"功能"基因。"天然途徑"或"天 然代謝途徑"是指在該種酵母的野生型細(xì)胞中存在并具有活性的代謝 途徑。如果某種酶在該種酵母的野生型細(xì)胞中以活性形式產(chǎn)生的話， 就認(rèn)為該酶是由該種酵母"天然產(chǎn)生的"。
在本發(fā)明中，當(dāng)用于任何遺傳材料時(shí)，"外源"是指對宿主細(xì)胞 而言不是天然的。對本發(fā)明某些實(shí)施方案合適的宿主酵母細(xì)胞包括這樣的酵母
細(xì)胞所述細(xì)胞并非來自經(jīng)歷古代( 1億年前)全基因組重復(fù)事件的細(xì) 月包系,參見Wolf等,"Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome", Nature 387， 708-713 (1997)(在下文稱為"Wolf等 1997" ), Langkjaer等，"Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes", Nature 421, 848-852 (2003)和Merico等,"Fermentative lifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex", FEBS Journal 274, 967-989 (2007)(在下文稱 為"Merico 2007")。這樣的酵母細(xì)胞是來自 一種或多種存在于全基 因組重復(fù)事件時(shí)期的其它酵母細(xì)胞系，在本文中稱為"全基因組重復(fù) 前酵母(pre-whole genome duplication yeast)"。全基因組重復(fù)事件可看 作是來自釀酒酵母CSacc/wrawFas cerev/w'oe)和其它酵母在發(fā)酵能力 進(jìn)化上的關(guān)鍵，這些酵母都來自發(fā)生基因組重復(fù)的共同祖先(Merico 2007)。在基因組重復(fù)中重復(fù)的一組基因包括編碼甘油-3-磷酸脫氫酶 和甘油-3_磷酸酶的基因，以及編碼富馬酸還原酶的基因，富馬酸還原
酶也參與維持氧化還原平衡(Wolfe等1997)。
其中合適的全基因組重復(fù)前酵母細(xì)胞是半子嚢菌酵母細(xì)胞。半子 嚢菌酵母是單細(xì)胞酵母，隸屬于酵母目CS"cc/z"raw_yceto/es)。
其它合適的酵母細(xì)胞包括酵母復(fù)合群(Saccharomyces complex)的 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13或14進(jìn)化枝(clade)的任何成員，參見Kurtzman 和 Robnett， "Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses.", FEMS Yaest Res.第4巻，第417-432頁，圖9 (第430頁)(2003),通 過引用結(jié)合到本文中。這些進(jìn)化枝分別命名為接合酵母屬 (Zygoracc/wrcwyca ) 、 4妄合有孑包圓酵母屬jpora)、有孑包圓酵 母屬(7brw/os; ora)、丄ac/zm7cea、克魯維酵母屬(X/w"growycay)、々支嚢 酵母屬C&^,f/ ec/蘭)、有孑包漢遜酵母屬(//o"化"z'邵ora)和類酵母屬 (/Sacc/zaromycotfes)， 參見Merico 2007,出處同上并參見ATwWzwa""，of/ier mem6ers o/f/ze /Sacc/iaramycetoceae ..." FEMS1 yaes^ T es.第4巻: 第233-245頁(2003)(在下文稱為"Kurtzman 2003")。
其它合適的酵母細(xì)胞包括(但不限于)隸屬于以下屬的酵母細(xì)胞 假絲酵母屬(Cam//^)、酵母屬(&cc/2aram_ycM)、裂殖酵母屬 (Sc/z/zcwacc/zaramyces)、 克魯維酵母屬(A7wyveramyces)、 畢赤酵母屬 (戶/c/w'a)、 {尹薩酵母屬(/wafc/^"h'")和漢遜酵母屬(7/ame"w/力。
特別感興趣的 一 類宿主細(xì)胞包括東方伊薩酵母(/wa^/^"yb'(3 ^7^似//"/陸生伊薩酵母(/. fem'co/a)進(jìn)化枝中含有的任何物種。使用以 下文獻(xiàn)所述的方法，通過分析酵母26S核糖體DNA的可變Dl/D2區(qū)， 鑒定東方伊薩酵母/陸生伊薩酵母進(jìn)化枝的成員Kurtzman和Robnett， 載于"Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial S叫uences，，， ^"tom'e v朋丄eemve"/70eA: 73:331-371， 1998，通過引用結(jié)合 到本文中(在下文稱為"Kurtzman和Robnettl 998")。具體參見第349 和361頁。對上百種子嚢菌26S核糖體DNA的可變Dl/D2區(qū)進(jìn)行分 析表明，東方伊薩酵母/陸生伊薩酵母進(jìn)化枝含有密切相關(guān)物種。與這 些進(jìn)化枝之外的酵母種類相比，東方伊薩酵母/陸生伊薩酵母進(jìn)化枝與 該進(jìn)化枝內(nèi)的其它成員在26S核糖體DNA的可變Dl/D2區(qū)上表現(xiàn)出 更大的相似性。因此，釆用Kurtzman和Robnett的方法，可通過比較 東方伊薩酵母/陸生伊薩酵母進(jìn)化枝的相應(yīng)核糖體DNA的Dl/D2區(qū)， 并與該進(jìn)化枝的其它成員和進(jìn)化枝以外的密切相關(guān)種類進(jìn)行比較，鑒
定東方伊薩酵母/陸生伊薩酵母進(jìn)化技的其它成員。東方伊薩酵母/陸 生伊薩酵母進(jìn)化枝內(nèi)的酵母都是在更寬的畢赤酵母/伊薩酵
母/&^""/^70^/德克拉酵母(/)^^^)進(jìn)化枝內(nèi)的半子嚢菌酵母。另一
類感興趣的宿主細(xì)胞是東方伊薩酵母/發(fā)酵畢赤酵母(尸./enwewtora)進(jìn) 化枝，參見Kurtzman和Robnett 1998。該進(jìn)化枝是最末端的進(jìn)化枝， 至少含有東方伊薩酵母、尸z'c/^gato/om^、畢赤酵母nW邦(NRRL 命名)、乙醇々i絲酵母(Qz"W(i" d/7fl"o//ca)、戶.afeseW/co/(3、膜醭畢赤酵母(P. we附&ramy^cz'em:)和發(fā)酵畢赤酵母(^P. /er附e"tora)。
特別感興趣的其它宿主細(xì)胞是酵母復(fù)合群的克魯維酵母屬進(jìn)化 枝內(nèi)含有的任何物種，參見(作為進(jìn)化枝11) Kurtzman和Robnett, "Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses.". F￡MS 7kw/1及&s.第4巻: 第417_432頁，圖9(第4!30頁)，(20(B),通過引用結(jié)合到本文中，和 Kurtzmann, "Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other members of the Saccharomycetaceae ...，， F五MS" TeaW 第4巻，第233-245頁，
圖1 (2003)(在下文稱為 "Kurtzman 2003")，通過引用結(jié)合到本文中。使用Kurtzman 2003所 述的多基因序列分析方法，克魯維酵母屬進(jìn)化枝至少包括克魯維酵母 OS. Ww"en')、海尼克魯維酵母(i:. "e^w"o^)、非發(fā)酵克魯維酵母(尤 "o"/wme"to附)、乳酸克魯維酵母(K /""/c)、馬克斯克魯維酵母(尺 ww;da"w力和多布克魯維酵母(K ^fote/wraAr/f)，并且還將包括該進(jìn)化枝 內(nèi)的其它物種。
對這類酵母細(xì)胞特別感興趣的是，當(dāng)經(jīng)遺傳修飾后能產(chǎn)生有機(jī)
酸，尤其是乳酸。 一般而言，優(yōu)選來自假絲酵母屬、克魯維酵母屬和 伊薩酵母屬的宿主細(xì)胞。在突變細(xì)胞產(chǎn)生有^/L酸的實(shí)施方案中，以及
在突變細(xì)胞產(chǎn)生除有機(jī)酸之外的另 一種發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)的情況 下，特別優(yōu)選上述來自克魯維酵母和東方伊薩酵母/發(fā)酵畢赤酵母進(jìn)化 枝的宿主細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是C. ^"o"ra&、馬克斯克魯維 酵母、耐熱克魯維酵母(A". ^z6rwoto/enms)、 C. ,//za/7osor6oraf和東方 伊薩酵母。最優(yōu)選的細(xì)胞是馬克斯克魯維酵母、C. so"o^m^和東方 伊薩酵母。當(dāng)首次表征東方伊薩酵母時(shí)，命名為庫德齊維氏畢赤酵母 (尸/c/z/" fe^n'avzev//)。東方伊薩酵母的無性形式稱為克魯斯氏假絲酵母 yb^w)。馬克斯克魯維酵母和C. ^"w^w^的合適菌纟朱包括 以下文獻(xiàn)中介紹的那些WO 00/71738 Al、 WO 02/42471 A2、 WO 03/049525 A2、 WO 03/102152 A2和WO 03/102201A2。東方伊薩酵母 的合適菌林是ATCC菌抹32196和ATCC菌林PTA-6648。至于代謝途徑的"缺失或破壞"，是指與野生型細(xì)胞相比，該
途徑完全不起作用，或者其活性降低至少75%、優(yōu)選至少90%?？赏?過減少所產(chǎn)生的活性酶的數(shù)量，通過降低所產(chǎn)生的活性酶的活性，或 通過這兩種方式的組合，就可降低某個(gè)途徑的活性。至于基因的"缺 失或破壞"，是指消除(缺失)基因的完整編碼區(qū)，或修飾(例如通過缺 失、插入或突變)基因編碼區(qū)、其啟動子、和/或其終止區(qū)，使得該基 因不再產(chǎn)生活性酶，該基因產(chǎn)生活性酶的數(shù)量急劇減少(至少減少 75%，優(yōu)選至少減少90%)，或該基因產(chǎn)生的酶的活性急劇下降(至少 下降75%,優(yōu)選至少下降90%)。
大多數(shù)情況下，天然代謝途徑的缺失或破壞將會包括至少一個(gè) GPD基因的缺失或破壞、至少一個(gè)GPP基因的缺失或破壞，或這兩 種基因同時(shí)缺失或破壞。在具有基于磷酸二羥丙酮磷酸酶和甘油脫氫 酶的替代代謝途徑的細(xì)胞(例如粟酒裂殖酵母)中，天然代謝途徑的缺 失或破壞通常會包括磷酸二羥丙酮磷酸酶基因的缺失或破壞、甘油脫 氬酶基因的缺失或破壞、或這兩種基因同時(shí)缺失或破壞。在具有這兩 種途徑的細(xì)胞中，這兩種途徑可同時(shí)發(fā)生缺失或破壞。
本文所用的術(shù)語"甘油-3-磷酸脫氫酶基因"和"GPD基因"是 指(a)編碼具有甘油-3 -磷酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的任何基因和/或(b)編 碼與SEQ. ID. NO. 1 、 SEQ. ID. NO. 2、 SEQ. ID. NO. 3 、 SEQ. ID. NO. 4、 SEQ. ID. NO. 5、 SEQ. ID. NO. 6或SEQ. ID. NO. 7所示的任何氨基 酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%和更優(yōu)選至少65%同一性的酶的 任何染色體DNA序列。"甘油-3-磷酸脫氫酶活性"是指蛋白質(zhì)催化 DHAP至甘油-3-磷酸的反應(yīng)的能力。就本發(fā)明的目的而言，DNA、 RNA或蛋白質(zhì)的氨基酸序列的。/。同一性可用BLAST (NCBI Basic Local Alignment Search Tool) 2.2.1版軟件(用默認(rèn)參數(shù))，方便地 計(jì)算出來。用BLAST 2.2.13版算法(用默認(rèn)參數(shù))，認(rèn)為同一性評分為 至少XX。/。的序列就是至少XX。/。同一性。BLAST軟件可得自國立生 物信息中心(National Center for Biological Information, Bethesda,Maryland)-
同樣，本文所用的"甘油-3-磷酸酶基因"和"GPP基因"是指(a) 編碼具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的任何基因和/或(b)編碼與SEQ. ID. N0.8、 SEQ. ID. NO. 9、 SEQ. ID. NO. 10、 SEQ. ID. NO 11或SEQ.
ID. NO 12所示的任何氨基酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%和更 優(yōu)選至少65。/。同一性的蛋白質(zhì)的任何染色體DNA序列。"甘油-3-磷 酸酶活性"是指蛋白質(zhì)催化甘油-3-磷酸脫磷酸而生成甘油的能力。
本文所用的術(shù)語"磷酸二羥丙酮磷酸酶"基因是指編碼具有磷酸 二羥丙酮磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的任何基因。本文所用的"甘油脫氬酶" 基因是指(a)編碼具有甘油脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的任何基因和/或(b)編 碼與SEQ. ID. NO. 13所示的氨基酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60% 和更優(yōu)選至少65%同一性的蛋白質(zhì)的任何染色體DNA序列。"磷酸 二羥丙酮磷酸酶活性"是指蛋白質(zhì)催化磷酸二羥丙酮至二羥丙酮的反 應(yīng)的能力。"甘油脫氫酶活性"是指蛋白質(zhì)催化二羥丙酮至甘油的還 原反應(yīng)的能力。
任何上述基因的缺失或破壞可通過強(qiáng)制進(jìn)化、誘變或基因工程方 法來完成，然后再經(jīng)過合適的選擇或篩選，以鑒定所需突變體。
在誘變方法中，在足以達(dá)到細(xì)胞高死亡率(60-99.9%，優(yōu)選 卯-99.9%)的條件下，將細(xì)胞暴露給紫外輻射或誘變劑。然后將存活細(xì) 胞倒平板并選擇或篩選代謝活性缺失或破壞的細(xì)胞。在產(chǎn)甘油能力下 降的基礎(chǔ)上篩選具有所需突變的細(xì)胞。任何上述基因的破壞或缺失可 通過PCR或DNA印跡分析方法來證實(shí)。
可通過設(shè)計(jì)和構(gòu)建合適的缺失構(gòu)建體并用這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞， 就可通過一個(gè)或多個(gè)步驟，方便地完成缺失或破壞通向甘油的代謝途 徑的遺傳工程。本文所用的術(shù)語"構(gòu)建體"是指用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA 序列。構(gòu)建體可以呈例如環(huán)狀質(zhì)?；蜉d體的形式，線狀質(zhì)粒或載體的 形式，可以是環(huán)狀質(zhì)?；蜉d體的一部分(例如用 一種或多種限制酶消化 質(zhì)粒或載體而得到)，或者可以是用質(zhì)粒或載體作為模板而制備的PCR產(chǎn)物。進(jìn)行選擇或篩選以鑒定成功的轉(zhuǎn)化子?？刹捎秒姶┛缀?或化學(xué)
(例如基于氯化4丐或乙酸鋰)轉(zhuǎn)化方法。
有關(guān)缺失構(gòu)建體的以下討論同樣也可用于任何甘油-3-磷酸脫氫 酶基因、甘油-3-磷酸酶基因、磷酸二羥丙酮磷酸酶基因或甘油脫氬酶 基因的缺失或破壞。
可通過首先克隆靶基因的兩個(gè)DNA序列和/或其上游(5，)或下游 (3')側(cè)翼區(qū)，方便地裝配缺失構(gòu)建體。序列優(yōu)選是不連續(xù)的，但也可 以是連續(xù)的，如果在構(gòu)建體的序列之間插入額外遺傳物質(zhì)(例如選4奪標(biāo) 記盒)的話。在這種情況下，"不連續(xù)"是指DNA序列在野生型基因 組中并非彼此密切鄰接，而是在野生型基因組中彼此被要缺失的區(qū)域 間隔開，以便缺失或破壞基因。"連續(xù)，，序列是在野生型基因組中彼 此直接鄰接的序列。 一個(gè)這樣的序列可包括在5'與靶基因啟動子連接 的區(qū)、全部或部分啟動子區(qū)、全部或部分靶基因編碼區(qū)或其組合。其 它序列可包括在3，與靶基因終止子連接的區(qū)、全部或部分終止區(qū)、和/ 或全部或部分靶基因編碼區(qū)。然后產(chǎn)生缺失構(gòu)建體，其含有方向相同 的兩個(gè)序列，其彼此關(guān)系正如它們在宿主細(xì)胞染色體上天然存在的那 樣。通常，將選擇標(biāo)記克隆在序列之間，以便選擇轉(zhuǎn)化子，詳述如下。 該構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?？刹捎秒姶┛缀?或化學(xué)(例如基于氯化 4丐或乙S臾鋰)轉(zhuǎn)化方法。
在成功的轉(zhuǎn)化子中，靶基因的基因座的同源重組事件31起功能基 因的破壞或缺失。在該重組事件中缺失全部或部分天然靶基因、其啟 動子和/或終止子。如果缺失構(gòu)建體在來自靶基因座的兩個(gè)序列之間含 有遺傳物質(zhì)(例如選擇標(biāo)記盒或結(jié)構(gòu)基因盒)，則遺傳物質(zhì)插入到宿主 細(xì)胞基因組的缺失物質(zhì)的基因座上?？赏ㄟ^PCR分析或DNA印跡分 析證實(shí)發(fā)生了所需缺失。
通常最好是缺失構(gòu)建體也可包含功能性選擇標(biāo)記盒。但使用 一個(gè) 缺失構(gòu)建體時(shí)，標(biāo)記盒處于耙基因座5'序列的載體下游(即在3'方向) 和靶基因座3'序列的上游(即在5'方向)。成功的轉(zhuǎn)化子將會含有選擇標(biāo)記盒，這賦予成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞某些特性，可作為選擇基礎(chǔ)。"選擇標(biāo) 記基因"是編碼轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中存活和/或生長所必需的蛋白
質(zhì)的基因。通常，選擇標(biāo)記基因編碼這樣的蛋白質(zhì)所述蛋白質(zhì)(a)賦 予抗生素抗性或其它毒素抗性，這些抗生素例如零霉素(zeocin)(印度 斯坦鏈異壁菌(S r印toa〃o^'c/zi^ /7/m/ustoww力We博來霉素抗性基因)、 (Tn卯3的卡那霉素抗性基因)或潮霉素(大腸桿菌的氨基糖苷類 抗生素抗性基因)，(b)補(bǔ)充細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷(例如氨基酸亮氨酸缺陷(馬 克斯克魯維酵母基因)或尿嘧啶缺陷(例如馬克斯克魯維酵母或 釀酒酵母的WM3基因))；(c)使細(xì)胞能夠合成無法得自簡單培養(yǎng)基的 關(guān)鍵性營養(yǎng)，或(d)賦予細(xì)胞在特定碳源上生長的能力(例如釀酒酵母 的M五丄5基因，該基因編碼a-半乳糖苷酶(蜜二糖酶)并賦予在唯一石友 源上生長的能力)。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括零霉素(zeocin)抗性基因、G418 抗性基因、M5丄5基因和潮霉素抗性基因。另 一個(gè)優(yōu)選的選擇標(biāo)記是L-乳酸:高鐵細(xì)胞色素c氧化還原酶(Cra2)基因盒，其使宿主細(xì)胞天然缺 乏該基因或其天然CT52基因最初已缺失或破壞。
選擇標(biāo)記盒還將包含啟動子和終止序列，其與選擇標(biāo)記基因有效 連接并可在宿主細(xì)胞中操作。 一種合適類型的啟動子是與酵母基因天 然啟動子具有至少50%、 70%、 90%、 95%或99%同一性的啟動子。 更合適的一類啟動子是與酵母基因天然啟動子具有至少50%、 70%、 卯％、 95%或99%同一性的啟動子。特別有用的啟動子包括丙酮酸脫 羧酶(戶Z)C7)、磷酸甘油酸激酶OPGX)、木糖還原酶(義i )、木糖醇脫氫 酶(義D/^)、 L-(+)-乳酸-細(xì)胞色素c氧化還原酶(CT52)、翻譯延伸因子-1 (7EF7)和翻譯延伸因子_2 (:TEi^)基因的啟動子，尤其是來自宿主細(xì)胞 相應(yīng)基因的啟動子。 一個(gè)尤其有用的啟動子包括宿主細(xì)胞天然的 尸DC7、尸G尺、7E^7或7EF2基因的啟動子的功能部分，或與這類 戶ZX7、 PG《、7EF7或7EF2啟動子具有至少80%、 85%、 90%或95% 同一性的序列。
一類合適的終止子是與酵母細(xì)胞天然基因的終止子具有至少50%、 70%、 90°/。、 95%或99°/。同一性的終止子。終止子可以是與宿主 細(xì)胞天然基因的終止子具有至少50%、 70%、 90%、 95%或99%同一 性的終止子。特別有用的終止子包括丙酮酸脫羧酶(尸Z)C7)、木糖還原 酶(^R)、木糖醇脫氫酶(ID/i)、 L-乳酸:高鐵細(xì)胞色素c氧化還原酶 (CT52)或異-2-細(xì)胞色素c (CFC)基因的終止子，或酵母的半乳糖基因 家族的終止子，特別是所謂的Gv!L川終止子。 一個(gè)特別優(yōu)選的終止子 包括宿主細(xì)胞天然的04ZJ0基因的終止子的功能部分，或與這類終止 子具有至少80%、 85%、 90%或95°/。同一性的序列。
可以設(shè)計(jì)缺失構(gòu)建體，使選擇標(biāo)記盒能夠因隨后的同源重組事件 而發(fā)生自發(fā)缺失。要完成這一步的一個(gè)便利方式就是設(shè)計(jì)載體，使結(jié) 構(gòu)基因盒側(cè)接直接重復(fù)序列。直接重復(fù)序列是宿主細(xì)胞天然或非天然 的相同DNA序列，在構(gòu)建體上呈各自相同的方向。直接重復(fù)序列的 長度最好是約50-1500 bp。直接重復(fù)序列不必編碼任何東西。該構(gòu)建 體允許同源重組事件發(fā)生。這樣的事件發(fā)生頻率較低，導(dǎo)致細(xì)胞含有 缺失的選擇標(biāo)記基因和一個(gè)直接重復(fù)序列。有必要將轉(zhuǎn)化子在非選擇 性培養(yǎng)基上培養(yǎng)幾輪，讓一些細(xì)胞中發(fā)生自發(fā)同源重組?？筛鶕?jù)自發(fā) 缺失選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞缺乏選擇標(biāo)記基因所賦予的選擇特性，來選 擇或篩選這樣的細(xì)胞。
靶基因缺失構(gòu)建體也可含有結(jié)構(gòu)基因盒，也位于5'側(cè)翼區(qū)下游和 3，側(cè)翼區(qū)上游，但優(yōu)選不在所具有的任何選擇標(biāo)記盒之內(nèi)。這類構(gòu)建 體允許靶基因的自發(fā)缺失和結(jié)構(gòu)基因的插入。所稱"結(jié)構(gòu)基因"，是 指編碼蛋白質(zhì)的任何基因，而不是如上所述的靶基因或選擇標(biāo)記基 因。各種各樣的結(jié)構(gòu)基因都可使用，但本發(fā)明特別感興趣的基因是賦 予細(xì)胞產(chǎn)生有機(jī)酸能力的基因，或賦予細(xì)胞消耗特定碳源(例如戊糖) 的能力的基因。
在使用選擇標(biāo)記的情況下，可用一對缺失構(gòu)建體(而非一個(gè)缺失 構(gòu)建體)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。構(gòu)建體對中的一個(gè)可含有來自耙基因座的第一序列 和標(biāo)記基因盒的一個(gè)非功能部分。構(gòu)建體對的另 一個(gè)則可含有來自靶基因座的第二序列和標(biāo)記基因盒的另 一個(gè)非功能部分。選擇一起構(gòu)成 完整盒的標(biāo)記基因盒的兩部分。標(biāo)記基因盒的兩部分的每一端都共享 共同序列，即部分盒在兩部分的每一端都重復(fù)。用它們自發(fā)轉(zhuǎn)化細(xì)胞， 形成所需的缺失或破壞，并形成完整的功能性標(biāo)記或結(jié)構(gòu)基因盒。細(xì) 胞比例將會在耙基因座上同源整合兩種缺失構(gòu)建體，并進(jìn)行新的同源 重組事件，以便從兩個(gè)非功能片段重構(gòu)功能性選擇基因盒。根據(jù)選擇 標(biāo)記所賦予的特性，選擇成功的轉(zhuǎn)化子。
當(dāng)細(xì)胞的天然代謝途徑包括磷酸二羥丙酮至甘油-3-磷酸再至甘 油的途徑(通過GDP和GPP酶)時(shí)，無論是GDP基因還是GPP基因都 可發(fā)生缺失或破壞。GDP基因和GPP基因可同時(shí)缺失。在這種情況 下，GDP基因和GPP基因的缺失或破壞可同時(shí)發(fā)生或序貫發(fā)生。如 果細(xì)胞含有多個(gè)GDP基因或GPP基因，或所述基因的多個(gè)多等位基 因，優(yōu)選它們在細(xì)胞中的功能全都缺失。當(dāng)細(xì)胞的天然代謝途徑包括 磷酸二羥丙酮至二羥丙酮再至甘油的途徑(通過磷酸二羥丙酮磷酸酶 和甘油脫氫酶)時(shí)，無論是磷酸二羥丙酮磷酸酶還是甘油脫氬酶基因都 可發(fā)生缺失或破壞。磷酸二羥丙酮磷酸酶或甘油脫氫酶基因都可缺失 或破壞，這可以是同時(shí)發(fā)生或是序貫發(fā)生，這樣的序貫發(fā)生可按任何 順序進(jìn)行。如前所述，所述基因的多功能拷貝或等位基因優(yōu)選都缺失。
在本發(fā)明的某些方面，細(xì)胞能產(chǎn)生所需有機(jī)酸(或其鹽)。這種能 力表現(xiàn)為，在至少一組發(fā)酵條件下培養(yǎng)時(shí)，能將至少5%、至少10%、 至少50%、至少70%、至少80%或至少90%(重量)的碳源轉(zhuǎn)化為所需 有機(jī)酸。因?yàn)閹缀鯖]有酵母細(xì)胞具有產(chǎn)生這些酸的天然能力，所以本 發(fā)明的細(xì)胞在大多數(shù)情況下含有能讓細(xì)胞產(chǎn)生該有機(jī)酸的至少一個(gè) 功能性外源基因。
特別感興趣的細(xì)胞產(chǎn)生乳酸(鹽)，其中這是指乳酸或其鹽。在這 樣的情況下，本發(fā)明的細(xì)胞含有整合到其基因組上的至少 一個(gè)功能性 外源乳酸脫氪酶CLD/Z)基因。丄D/Z基因是編碼功能性乳酸脫氫酶的基 因。功能性丄D/Z酶是催化丙酮酸(鹽)還原成乳酸(鹽)的酶。丄DZ/基因是對L-Z^/Z或D-LD7/的產(chǎn)生具有特異性，這兩種物質(zhì)分別能使細(xì)胞 產(chǎn)生L-或D-乳酸對映體(或其鹽)。本發(fā)明的修飾細(xì)胞可能含有L-和 D-丄D/Z基因，因此能夠產(chǎn)生乳酸對映體。然而，優(yōu)選僅有L-丄Z)Z/基 因或僅有D -ZD/f基因存在，使細(xì)胞產(chǎn)生更多光學(xué)純的乳酸產(chǎn)物。
合適的LD/Z基因包括來源于細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動物的LD// 基因。L-LD7/基因的具體實(shí)例是得自瑞士乳桿菌(丄./^/vWcw)、干酪 乳桿菌(丄.c"化/)、巨大芽孢桿菌(及megWeWwm)、乳酸片球菌(尸. acW/a^d)和牛來源的那些。D-LDZ/基因的具體實(shí)例是得自瑞士乳桿 菌(丄.腸e"面)、約氏乳桿菌(丄.乂o/z腳m7)、保加利亞乳桿菌(丄. 6w/gar/ctw)、德、氏乳4干菌(丄.(ie/Z)rwech7)、才直物享L^干菌(丄./ /awtonw2)牙口 戊糖乳桿菌(丄.； e"toyw力的那些。與這些L-丄P7/或D-丄Dif基因相同或 具有至少80%同一性的功能基因是合適的。必要時(shí)，可對得自這些來 源的天然基因進(jìn)行誘變，以提供用常用真核起始密碼子(ATG)起始的 編碼序列，或?yàn)榱似渌康?。?yōu)選的L-丄D//基因是得自瑞士乳桿菌 的L-丄D7/基因或與所述基因具有至少80%、 85%、 90%或95%同一性 的L-丄DZ/基因。另一個(gè)優(yōu)選的L-丄D//基因是得自巨大芽孢桿菌 的L-丄D/Z基因或與所述基因具有至少80%、 85%、卯％或95%同一性 的L-丄Z)7/基因。 一個(gè)優(yōu)選的D-丄Di/基因是得自瑞士乳桿菌的D-ZZ>// 基因或與所述基因具有至少80%、 85%、 90%或95%同一性的D-丄D// 基因。
特別合適的丄D/Z基因包括這樣的基因其編碼的酶的氨基酸序 列與WO 03/049525的SEQ. ID. NO. 45或與WO 03/049525的SEQ. ID. NO. 49具有至少60%、尤其是至少80%、 85%或95%同一性。特別合 適的丄D/Z基因還包括這樣的基因其編碼的酶的蛋白質(zhì)序列與WO 03/049525的SEQ ID. NO. 46或50具有至少60%、 80%、 85%或95% 同一性。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞可含有單個(gè)丄D/Z基因或多個(gè)丄￡>//基因，例如1-10 個(gè)丄D/Z基因，尤其是1-5個(gè)丄DZ/基因。當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有多個(gè)丄D/7基因時(shí)，每個(gè)基因可以是同一基因的拷貝，或者每個(gè)基因包含兩個(gè)或更
多不同LD7/基因的拷貝。多拷貝的外源丄D/Z基因可以整合在宿主細(xì) 胞基因組的同 一基因座上(這樣它們就彼此鄰接)或在若干基因座上。
外源丄D/7基因處于一個(gè)或多個(gè)啟動子和一個(gè)或多個(gè)終止子的轉(zhuǎn) 錄控制之下，這樣的啟動子和終止子在修飾酵母細(xì)胞中具有功能。對 選擇標(biāo)記基因盒合適的啟動子和終止子如上所述，也可參見WO 99/14335、 WO 00/71738、 WO 02/42471、 WO 03/102201 、 WO 03/102152 和WO 03/049525。 一個(gè)特別有用的啟動子包括宿主細(xì)胞PZX7、戶GK、 7E尸7或7EF2基因的啟動子功能部分或與該啟動子具有至少80%、 85%、 90%或95%同一性。 一個(gè)特別優(yōu)選的終止子包括宿主細(xì)胞PDC 基因的終止子功能部分或與其具有至少80%、 85%、 90%或95%同一 性。
當(dāng)多個(gè)外源丄Di/基因引入宿主細(xì)胞時(shí)，不同LD//基因可能處于 不同類型的啟動子和/或終止子控制之下。
外源丄D//基因可隨機(jī)整合在宿主細(xì)胞基因組中或插入到 一個(gè)或 多個(gè)靶位置上。耙位置的實(shí)例包括希望發(fā)生缺失或破壞的基因的基因 座，例如PDC7基因、甘油-3-磷酸脫氫酶基因、甘油3-磷酸酶基因、 磷酸二羥丙酮磷酸酶基因或甘油脫氫酶基因的基因座。可將外源ZX>// 基因盒放入構(gòu)建體中，用于缺失或破壞甘油-3-磷酸脫氬酶、甘油-3-磷酸酶、磷酸二羥丙酮磷酸酶或甘油脫氫酶的基因，而且其方式是可 以同時(shí)插入到這些基因的基因座上以發(fā)生缺失或破壞它們。
轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以引入外源丄D//基因盒的方法可參見WO 99/14335、 WO 00/71738、 WO 02/42471 、 WO 03/102201 、 WO 03/102152 和WO 03/049525。這類方法可用于本發(fā)明。
也可修飾細(xì)胞，使之產(chǎn)生一種或多種其它有^L酸。例如，用編碼
功能性p-丙氨s吏/丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶的外源基因盒轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使細(xì)胞能
夠產(chǎn)生3-羥基丙酸。達(dá)到該目的的方法可參見WO2005/118719。
本發(fā)明的遺傳修飾酵母細(xì)胞可包含給細(xì)胞提供一個(gè)或多個(gè)所需貢獻(xiàn)的額外遺傳修飾。
在某些實(shí)施方案中，特別感興趣的額外修飾包括丙酮酸脫羧酶基 因的缺失或破壞。這可降低細(xì)胞產(chǎn)生乙醇的能力，這在有機(jī)酸(例如乳
酸)是所需產(chǎn)物的情況下特別有利。如果宿主細(xì)胞含有多個(gè)PZ)C基因， 特別優(yōu)選所有戶Z)C基因都缺失或破壞，盡管也可以缺失更少的這類 尸DC基因。使用以下文獻(xiàn)所述的類似方法，可使尸DC發(fā)生缺失WO 99/14335、 WO 02/42471、 WO 03/049525、 WO 03/102152和WO 03/102201。也可通過同時(shí)插入IZ)/f基因盒或其它結(jié)構(gòu)或選擇標(biāo)記基 因盒，而使尸DC發(fā)生缺失。在特別感興趣的方法中，(l)克隆PDC基 因的基因座的不連續(xù)序列，(2)產(chǎn)生含有不連續(xù)序列的構(gòu)建體，和(3) 用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在部分轉(zhuǎn)化子中，同源重組事件引起功能性 尸DC基因的缺失或破壞。必要時(shí)可重復(fù)該事件，以缺失或破壞多個(gè) 尸DC基因或等位基因。在某些種類的酵母(例如東方伊薩酵母)中，存 在密切同源的多個(gè)PZ)C基因或等位基因。在至少某些這樣的實(shí)例中 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，來自基因或等位基因的基因座的不連續(xù)序列可用于構(gòu)建
體，以缺失或破壞尸zx:基因或等位基因。用于破壞PDC基因的構(gòu)建
體可包含一個(gè)或多個(gè)功能性標(biāo)記或結(jié)構(gòu)基因盒，其插入到天然PDC 基因5'側(cè)接部分的下游和天然尸DC基因3'側(cè)接部分的上游。該方法 允許在一個(gè)轉(zhuǎn)化步驟中缺失尸DC基因并插入功能基因盒。
另一個(gè)感興趣的額外修飾是單獨(dú)或共同賦予細(xì)胞發(fā)酵戊糖而產(chǎn) 生所需發(fā)酵產(chǎn)物的能力。后一類修飾是(l)插入功能性木糖異構(gòu)酶基 因，(2)缺失或破壞能產(chǎn)生催化木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的酶的天然基因，(3) 缺失或破壞功能性木糖醇脫氫酶基因和/或(4)引起細(xì)胞過量表達(dá)功能 性木酮糖激酶的修飾。將這些修飾引入酵母細(xì)胞的方法可參見例如 WO 04/099381，通過引用結(jié)合到本文中。插入功能性木糖異構(gòu)酶基因、 缺失或破壞能產(chǎn)生催化木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的酶的天然基因、缺失或破 壞功能性木糖醇脫氫酶基因、以及修飾細(xì)胞以過量表達(dá)功能性木酮糖 激酶的合適方法，可參見例如WO 04/099381,通過引用結(jié)合到本文中。對本發(fā)明產(chǎn)乳酸細(xì)胞的另一個(gè)特別感興趣的額外修飾包括缺失
或破壞至少一個(gè)L-或D-乳酸:高鐵細(xì)胞色素c氧化還原酶基因。
一般而言，本發(fā)明細(xì)胞的特征是合成甘油的能力下降。評價(jià)細(xì)胞 合成甘油能力的一種有用方法是通過在上述標(biāo)準(zhǔn)微好氧條件下培養(yǎng) 細(xì)胞。使用一種成分確定的含水發(fā)酵培養(yǎng)基，其在培養(yǎng)開始時(shí)含有 5g/L硫酸銨、3g/L磷酸二氫鉀、0.5g/L硫酸鎂、痕量元素、維生素 和150 g/L葡萄糖。培養(yǎng)開始時(shí)將pH調(diào)節(jié)到3.5。培養(yǎng)期間允許pH 在范圍內(nèi)自由變動，除非在培養(yǎng)期間有必要緩沖發(fā)酵培養(yǎng)基，以防pH 降至3.0以下或升至7.0以上。用足量的酵母細(xì)胞接種發(fā)酵培養(yǎng)基， 其經(jīng)評價(jià)產(chǎn)生OD幼。1.0。培養(yǎng)溫度為30°C。持續(xù)培養(yǎng)直到葡萄糖濃度 降至5g/L,但不超過120小時(shí)。培養(yǎng)期間，選4奪通氣和攪拌條件以達(dá) 到攝氧率為5.0±1.0mmol/L/hr。在這些標(biāo)準(zhǔn)條件下，本發(fā)明的細(xì)胞通 常產(chǎn)生不超過2.0g/L的甘油。更通常的是，在這些標(biāo)準(zhǔn)條件下它們產(chǎn) 生不超過0.6g/L的甘油，在大多數(shù)情況下，在這些標(biāo)準(zhǔn)條件下它們產(chǎn) 生不超過0.2g/L的甘油。在這些標(biāo)準(zhǔn)樣i好氧條件下，優(yōu)選的細(xì)胞還產(chǎn) 生至少10 g/L的至少一種所需發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇或有^/L酸(例如乳 酸)。在這些條件下，細(xì)胞更優(yōu)選產(chǎn)生至少40g/L、尤其是至少50g/L 所需發(fā)酵產(chǎn)物。
可在如上所述的標(biāo)準(zhǔn)微好氧條件下或任何其它有用的發(fā)酵條件 下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，以產(chǎn)生一種或多種所需發(fā)酵產(chǎn)物。乙醇是多種 酵母可天然產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物的一個(gè)實(shí)例。如上所述，可修飾細(xì)胞，使 之產(chǎn)生其它所需發(fā)酵產(chǎn)物，包括有機(jī)酸，例如乳酸或3-羥基丙酸。也 可修飾細(xì)胞，以產(chǎn)生其它發(fā)酵產(chǎn)物，包括其它酸或并非酸的其它產(chǎn)物。
在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，在包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培 養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞。碳源可以是己糖(例如葡萄糖)、或葡萄糖 的寡聚物或其它多聚物，例如聚糖、麥芽糖、麥芽三糖或異麥芽三糖。 碳源可以是另一種己糖，其中潘糖、果糖、果糖及其相應(yīng)的寡聚物和 多聚物都是實(shí)例。如果細(xì)胞天然具有或經(jīng)修飾具有發(fā)酵戊糖的能力，則碳源可包括戊糖(例如木糖)或者木糖寡聚物或多聚物(例如木聚糖)。 這類戊糖是含半纖維素生物量的合適水解產(chǎn)物。就寡聚糖而言，有必 要將酶加入到發(fā)酵肉湯中，以將它們消化成相應(yīng)的單糖，用于細(xì)胞發(fā) 酵。
培養(yǎng)基通常含有特定細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)，包括氮源(例如氨基 酸、蛋白質(zhì)、無機(jī)氮源例如氨或銨鹽等)和各種維生素、礦物質(zhì)等?？?使用所謂的"復(fù)合培養(yǎng)基"或所謂的"成分確定"培養(yǎng)基。
認(rèn)為溫度、細(xì)胞密度、底物選擇、營養(yǎng)物選擇等其它發(fā)酵條件都 不是本發(fā)明的關(guān)鍵，通常選擇這些條件以提供經(jīng)濟(jì)的方法。各生長周
期和生產(chǎn)周期的溫度范圍從培養(yǎng)基的冷凍溫度至約50°C,盡管這在某 些程度上取決于菌抹耐受高溫的能力。優(yōu)選的溫度、尤其是在生產(chǎn)周 期中的溫度為約30-45。C。
在生產(chǎn)周期中，發(fā)酵培養(yǎng)基的細(xì)胞濃度通常范圍在0.1-20、優(yōu)選 0.1-5、甚至更優(yōu)選l-3g干細(xì)胞/升發(fā)酵培養(yǎng)基。可以在好氧、孩i好氧 或厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵。如有必要，攝氧率可用于過程控制，參見 WO 03/102200。在攝氧率為4-12 mmol/L/hr、尤其是5-10 mmol/L/hr 的微好氧條件下，本發(fā)明的細(xì)胞表現(xiàn)特別好。
在細(xì)胞產(chǎn)生有機(jī)酸例如乳酸的優(yōu)選情況下，在發(fā)酵生產(chǎn)周期中可 緩沖培養(yǎng)基，使pH維持在約3.5至約9.0、或約4.5至約7.0的范圍 之內(nèi)。合適的緩沖劑是可中和所產(chǎn)生的酸的堿性物質(zhì)，其包括例如氫 氧化鉤、碳酸鉤、氬氧化鈉、氫氧化鐘、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸銨、 氨、氫氧化銨等。 一般而言，常規(guī)發(fā)酵方法所用的緩沖劑也適用于本 發(fā)明。
在緩沖發(fā)酵中，酸性發(fā)酵產(chǎn)物當(dāng)其形成時(shí)就中和成相應(yīng)的鹽。因 此對酸進(jìn)行回收包括再生游離酸。通常通過除去細(xì)胞并用硫酸等強(qiáng)酸 酸化發(fā)酵肉湯而達(dá)到這一目的。形成鹽副產(chǎn)物(在鈣鹽作為中和劑、硫 酸作為酸化劑的情況下，就形成石膏)，將其從肉湯中分離出來。然后 通過液-液萃取、蒸餾、吸附等技術(shù)，從肉湯中回收酸，所述技術(shù)參見仿H口 T.B. Vickroy，第3巻,Cowjwe/zemive 第38章(M.
Moo-Young編著)，Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta等，F(xiàn)EMS Microbiol. Rev" 1995， 16:221-231;美國專利號4,275,234、 4,771,001、 5,132,456、 5,420,304、 5,510,526、 5,641,406和5,831,122以及WO 93/00440。
或者，在培養(yǎng)期間，可允許發(fā)酵培養(yǎng)基的pH從高于酸產(chǎn)物的pKa 的5.5或更高的起始pH下降至低于或等于酸發(fā)酵產(chǎn)物的pKa，例如約 1.5至約3.5、約1.5至約3.0、或約1.5至約2.5的范圍內(nèi)。
也可在發(fā)酵之前或發(fā)酵過程開始時(shí)，將發(fā)酵肉湯的pH調(diào)至低于 或等于產(chǎn)物酸的pKa,進(jìn)行發(fā)酵以產(chǎn)生產(chǎn)物酸。此后整個(gè)培養(yǎng)過程的 pH可維持在低于或等于產(chǎn)物酸的pKa,或可在發(fā)酵過程中升至高于酸 的pKa。在前一種情況下，pH優(yōu)選維持在約1.5至約3.5、約1.5至約 3.2、或約2.0至約3.0的范圍內(nèi)。
在許多發(fā)酵條件下，本發(fā)明細(xì)胞的產(chǎn)甘油能力急劇下降。細(xì)胞產(chǎn) 甘油能力下降表現(xiàn)為低的甘油收率。本發(fā)明的細(xì)胞通常代謝不到2% (重量)的碳源被轉(zhuǎn)化為甘油。在大多數(shù)情況下，以培養(yǎng)中消耗的碳源 重量計(jì)，甘油收率小于1%或甚至小于0.1%。優(yōu)選細(xì)胞代謝至少40%、 例如至少50%、 60%、 70%、 80%或85%的碳源被轉(zhuǎn)化為所需發(fā)酵產(chǎn) 物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的細(xì)胞在發(fā)酵條件下表現(xiàn)出良好的生長能力。 這是令人吃驚的，因?yàn)樵谝吧徒湍讣?xì)胞中，甘油對細(xì)胞有各種用途， 而且認(rèn)為甘油的作用是平衡NADH/NAD+。本發(fā)明的范圍包括將甘油 添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，以補(bǔ)償細(xì)胞自身缺乏的產(chǎn)甘油能力。然而，申 請人發(fā)現(xiàn)，這樣做沒有益處，至少在某些發(fā)酵過程中。
提供以下實(shí)施例來說明本發(fā)明，但不得視為對本發(fā)明范圍的限 制。除非另有說明，否則所有份和百分率都以重量計(jì)。
實(shí)施例1A:馬克斯克魯維酵母菌林CD607的誘變和具有乙醇酸抗性的突變菌林(CD853)的選擇。
馬克斯克魯維酵母菌抹CD607描述于WO 03/102152實(shí)施例3D。 該菌抹缺失其丙酮酸脫羧酶基因并在該基因座上插入外源乳酸脫氫 酶基因。將菌林CD607的細(xì)胞暴露給紫外光進(jìn)行誘變。
將新鮮YP (酵母膏加蛋白胨)+ 20 g/L葡萄糖平板的細(xì)胞重懸于2 mL酵母蛋白胨+ 50 g/L葡萄糖，至約OD600為6。將10份125 pl所 述細(xì)胞懸液的等分試樣吸至10孔300 pl的96孔微量滴定板中。將微 量滴定板暴露給12,500 )iJoule/cn^的紫外光，殺死90-99%的細(xì)胞。然 后將微量滴定板在30。C避光處孵育過夜，同時(shí)攪拌(225rpm),讓細(xì)胞 恢復(fù)，然后接種選擇性平板。
再將100 經(jīng)紫外處理的細(xì)胞懸液接種土豆葡萄糖瓊脂(PDA) + 15g/L乙醇酸平板，選擇乙醇酸抗性菌林。這些平板在30。C孵育幾天 直到出現(xiàn)菌落。分離單菌落用于進(jìn)一步分析。
將約2 x 108誘變處理的細(xì)胞接種到含有15 g/L乙醇酸的PDA 平板并在30°C孵育。將這些平板上生長的菌落在裝有YP (酵母蛋白胨) + 100 g/L葡萄糖(無緩沖劑)的帶擋板搖瓶中在30。C和225 rpm攪拌下 培養(yǎng)過夜。然后從這些搖瓶中取出2 g/L細(xì)胞干重，接種生產(chǎn)瓶。將 生產(chǎn)瓶在YP + 50g/L葡萄糖中、在3(TC和70rpm攪拌下培養(yǎng)。定期 取樣，使用例如WO 03/102201實(shí)施例1M所述方法，通過HPLC,測 定葡萄糖、乳酸、乙醇和丙酮酸。88小時(shí)后產(chǎn)生約26g/L乳酸的菌抹 稱為菌抹CD635。菌林CD635能夠以乳酸(鹽)為唯一碳源而生長。
如上所述，將菌林CD635的細(xì)胞再次進(jìn)行誘變步驟。選擇能夠 在含25 g/L乙醇酸的PDA上生長的所得誘變細(xì)胞的菌落。將乙醇酸 抗性菌落在YP+ 100g/L葡萄糖的搖瓶中在3(TC和250rpm攪拌下分 別培養(yǎng)過夜。離心收集生物量，將2g/L干重的細(xì)胞接種到50mLYP + 50 g/L葡萄糖的帶擋板搖瓶中。將搖瓶在30。C和250 rpm攪拌下培 養(yǎng)約92小時(shí)。與親代菌才朱CD607和CD635相比，產(chǎn)生明顯更高的終 乳酸滴度的突變體稱為菌抹CD853。菌抹CD853不能以乳酸(鹽)為唯一碳源而生長，這表明該突變體 中天然L-乳酸(鹽):高鐵細(xì)胞色素c氧化還原酶基因(〖mCZS2)基因已 經(jīng)沒有功能。因此，使用PCR,用高保真FailSafe酶和基因組DNA 作為模板，自該菌林?jǐn)U增尺mC^B2編碼區(qū)加上《/wCTS2編碼區(qū)上游和 下游 500bp。通過Qiagen柱純化，純化所得~2.75 kbp PCR產(chǎn)物，并 對全和尺wCFS2編碼區(qū)測序。發(fā)現(xiàn)菌株CD853在《mCZB2基因的氨 基酸位62上具有4堿基插入序列，導(dǎo)致移碼突變，在氨基酸位76上 產(chǎn)生終止密碼子并截短該蛋白質(zhì)。
實(shí)施例1B: G^，D/F缺失載體pBH158 (圖l)和pBH159 (圖2)的構(gòu)建。
一個(gè)稱為pVR29的質(zhì)粒(描述于WO 03/102152實(shí)施例1C和圖 4)含有處于丙酮酸脫羧酶啟動子和終止子控制之下的Tn903的 卡那霉素抗性基因(G418基因)。質(zhì)粒pVR29用廁w/和尸W/消化，將 由此得到的含G418基因盒的5.1 kbp片段通過凝膠純化并脫去磷酸。 使用稱為SEQ.ID.NO. 14和SEQ. ID. NO. 15的引物，并使用馬克斯 克魯維酵母基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增馬克斯克魯維酵母 GPD (i^wGPDJF)基因DNA上游的1.2 kbp區(qū)。將PCR產(chǎn)物通過凝膠 純化，用廁w/和尸W/消化，然后與來自質(zhì)粒pVR29的5.1 kbp片段連 接起來，產(chǎn)生質(zhì)粒pBH158(
圖1)。按照轉(zhuǎn)錄順序，質(zhì)粒pBH158含有 KmG尸D/F基因的1.2 kbp上游側(cè)翼和G418表達(dá)盒。
對于第二缺失載體，質(zhì)粒pVR29用7VgoM/r和消化，將含 有G418表達(dá)盒的4.7kbp片段通過凝膠純化，然后脫去磷酸。使用稱 為SEQ. ID. NO. 16和SEQ. ID. NO. 17的引物，并再次4吏用馬克斯克 魯維酵母基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增KmG尸D7F基因的 DNA下游0.7 kbp區(qū)。PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，用7VgoMT和 消化，然后與pVR29的4.7 kbp片段連接起來，產(chǎn)生質(zhì)粒pBH159 (圖 2)。按照轉(zhuǎn)錄順序，質(zhì)粒pBH159含有G418表達(dá)盒和KmG尸D7F基 因0.7 kbp下游側(cè)翼。實(shí)施例1C:用質(zhì)粒pBH158和pBH159 (實(shí)施例1B，
圖1和圖2)轉(zhuǎn)化 菌林CD853 (實(shí)施例1A)，得到具有外源LDH基因、缺失天然PDC 基因、具有破壞的天然CYB2基因并缺失天然GPD1F基因的轉(zhuǎn)化子 (菌林CD1606)。
質(zhì)粒pBH158用^ "/和//!>^///消化。這些限制酶切割質(zhì)粒，產(chǎn) 生含有《wG^"/F基因的1.2 kbp上游側(cè)翼和部分G418表達(dá)盒的2.6 kbp片段。該片段通過瓊脂糖凝膠分離。質(zhì)粒pBH159用lo/和 A^oMT消化。這些限制酶切割質(zhì)粒，產(chǎn)生含有部分G418表達(dá)盒和 《wG尸D7F基因0.7 kbp下游側(cè)翼的2.0 kbp片段。該片段通過瓊脂糖 凝膠分離。這兩個(gè)分離的片段一起含有完整G418表達(dá)盒，其中在片 段兩端有一些重疊。
將菌林CD853在YP + 60 g/L葡萄糖+ 0.2M MES + 1%乙醇 (pH6.5)中培養(yǎng)過夜，然后與來自質(zhì)粒pBH158的2.6 kbp片段和來自 pBH159的2.0 kbp片段同時(shí)進(jìn)行電穿孔。在YP + 20 g/L葡萄糖+ 300 |Lig/mL G418平板上在30。C選擇轉(zhuǎn)化子，接著培養(yǎng)2天。挑取15個(gè)轉(zhuǎn) 化子，在YP + 20g/L葡萄糖+0418平板上重新劃線，并培養(yǎng)過夜。 只有共轉(zhuǎn)化這兩個(gè)片段、而且這兩個(gè)片段都同源整合在XmG尸D7F基 因座上的細(xì)胞，才會對G418具有抗性。
使用稱為SEQ.ID.NO. 18和SEQ. ID.NO. 19的引物，通過PCR 證實(shí)《wG尸Z)IF基因發(fā)生了缺失。7個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR表現(xiàn)出單一的3.4 kbp條帶，表明這些轉(zhuǎn)化子缺失《wG尸D/F基因。這些轉(zhuǎn)化子中的一 個(gè)稱為菌抹CD1606。
實(shí)施例2A: GPP基因缺失載體pBH160 (圖3)和pBH161 (圖4)的構(gòu)建。
質(zhì)粒pVR29用Mw/和尺;w/消化，由此得到的含有G418基因盒 的5.1 kbp片段通過凝膠純化并脫去磷酸。使用稱為SEQ. ID. NO. 20和SEQ.ID.N0.21的引物，并使用馬克斯克魯維酵母基因組DNA作 為模板，通過PCR擴(kuò)增天然GPP基因(^2報(bào))i 2基因)上游緊靠著的 0.9kbpDNA區(qū)。PCR產(chǎn)物通過凝月交純化，用Mw/和A^"/消化，然 后與來自質(zhì)粒pVR29的5.1 kbp片段連接起來，得到質(zhì)粒pBH160(圖 3)。按照轉(zhuǎn)錄順序，質(zhì)粒pBH160含有尺w/ZC^2基因的0.9 kbp上游 側(cè)翼和G418表達(dá)盒。
質(zhì)粒pVR29用iVgoM/r和消化，將含有G418表達(dá)盒的4.7 kbp片段通過凝膠純化并脫去磷酸。使用稱為SEQ. ID. NO. 22和SEQ. ID.NO.23的引物，并使用馬克斯克魯維酵母基因組DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增《w/ZO/^基因下游緊靠著的0.8 kbp DNA區(qū)。PCR產(chǎn) 物通過凝月交純化，用A^ M/F和5^/消化，然后與pVR29的4.7 kbp 片段連接起來，得到質(zhì)粒pBH161 (圖4)。按照轉(zhuǎn)錄順序，質(zhì)粒pBH161 含有G418表達(dá)盒和Xm//6^2基因的0.8 kbp下游側(cè)翼。
實(shí)施例2B:用質(zhì)粒pBH160和pBH161 (實(shí)施例2A,圖3和圖4)轉(zhuǎn)化 菌抹CD853 (實(shí)施例1A),得到具有外源丄2W7基因、缺失天然尸Z)C 基因、具有破壞的天然CTB2基因和缺失天然G尸戶基因的轉(zhuǎn)化子(菌 林CD1608)。
質(zhì)粒pBH160用廁"/和///"^7//消化。這些限制酶切割質(zhì)粒，產(chǎn) 生含有馬克斯克魯維酵母GPP (Km/Z(9i^)基因0.9 kbp上游側(cè)翼和部 分G418表達(dá)盒的2.3 kbp片段。該片段通過瓊脂糖凝膠分離。質(zhì)粒 pBH161用和A^ M/F消化。這些限制酶切割質(zhì)粒，產(chǎn)生含有 i^7/7CW2基因0.8 kbp上游側(cè)翼和部分G418表達(dá)盒的2.0 kbp片段。 該片段通過瓊脂糖凝膠分離。這兩個(gè)分離的片段一起含有完整G418 表達(dá)盒，其中在片段兩端有一些重疊。
將菌林CD853在YP + 60 g/L葡萄糖+ 0.2M MES + 1%乙醇 (pH6.5)中培養(yǎng)過夜，然后與來自質(zhì)粒pBH160的2.3 kbp片段和來自 質(zhì)粒pBH161的2.0kbp片段同時(shí)進(jìn)行電穿孑L。在YP + 20g/L葡萄糖+300 (ig/mL G418平板上在30。C選擇轉(zhuǎn)化子，接著培養(yǎng)2天。挑取15 個(gè)轉(zhuǎn)化子，在YP + 20 g/L葡萄糖+ 300 jig/mL G418平板上重新劃線， 并培養(yǎng)過夜。所有轉(zhuǎn)化子在該培養(yǎng)基上都能生長。只有共轉(zhuǎn)化這兩個(gè) 片段、而且這兩個(gè)片段都同源整合在Xw/ZC^2基因座上的細(xì)胞，才會 對G418具有抗性。
使用稱為SEQ. ID. NO. 20和SEQ. ID. NO. 21的引物，通過PCR 證實(shí)尺m/Z(9i^基因發(fā)生了缺失。3個(gè)轉(zhuǎn)化子得到單一3.8 kbp條帶， 表明缺失《mHOR2基因。這些轉(zhuǎn)化子中的一個(gè)稱為菌抹CD1608。
實(shí)施例3:菌林CD853 (實(shí)施例1A)、CD1606 (實(shí)施例1C)和CD1608 (實(shí) 施例2B)的微好氧分批培養(yǎng)。
在微好氧條件下，分別培養(yǎng)CD853、 CD1606和CD1608菌株。 在菌株CD1606和CD1608的情況下，重復(fù)進(jìn)行發(fā)酵。在每種情況下， 使用單級分批反應(yīng)器。發(fā)酵培養(yǎng)基是成分確定培養(yǎng)基，包含硫酸銨、 磷酸二氫鉀和硫S吏鎂、痕量元素、維生素、消泡劑和約90g/L葡萄糖。 通過添加氳氧化鉀，將培養(yǎng)基的pH調(diào)至約3.0。將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至30°C， 接種1 mL細(xì)胞。細(xì)胞在攪拌和通氣條件(攝氧率為5-6 mmol/L/hr)下 在3(TC培養(yǎng)。按照WO 03/102,200所述的方法測定攝氧率。
定時(shí)對發(fā)酵肉湯取樣，測定乳酸、乙酸、甘油和丙酮酸。二氧化 碳產(chǎn)量是通過測定反應(yīng)器排放氣體中二氧化碳含量而確定。
菌林CD853 (并非本發(fā)明的實(shí)例)在發(fā)酵早期的乳酸收率為 0,85 g/L隱hr，直到乳酸滴度為約20 g/L。此時(shí)的乳酸收率為約70%。 然后，乳酸產(chǎn)量放緩至約0.76 g/L-hr,乳酸收率略微有所下降。該菌 抹在86小時(shí)后停止產(chǎn)酸，此時(shí)發(fā)酵肉湯含有l(wèi)l g/L葡萄糖。乳酸滴 度為59 g/L。乳酸總產(chǎn)率為0.65 g/L-hr,乳酸總收率為70%。菌抹CD853 的丙酮酸、乙酸、甘油和二氧化^^的收率分別為0.6%、 0%、 5.1%和 14%。生物量收率為6.4%。
菌株CD1606在發(fā)酵早期的乳酸產(chǎn)率為0.77-0.84 g/L-hr，直到乳酸滴度為約20g/L。到這時(shí)的乳酸收率為約72-80°/。。然后，乳酸產(chǎn)量 放緩至約0.39-0.41 g/L-hr，乳酸收率略微有所下降。該菌林在137小 時(shí)后停止產(chǎn)酸，此時(shí)發(fā)酵肉湯含有14-19 g/L葡萄糖。乳酸滴度為 43-45 g/L。乳酸總產(chǎn)率為0.32-0.34 g/L-hr,乳酸總收率為60-63%。菌 株CD1606的丙酮酸、乙酸、甘油和二氧化碳的收率分別為0.1%、 0.5%、 0°/。和26-29%。生物量收率為7.9°/。。這些結(jié)果表明，缺失天然 《wG尸D7F基因能有效破壞細(xì)胞產(chǎn)甘油的能力。令人吃驚的是，該基 因的缺失(和由此而來的甘油產(chǎn)量的缺失)對細(xì)胞生長沒有或很少有影 響。
菌林CD1608在發(fā)酵早期的乳酸產(chǎn)率為0.66 g/L-hr,直到乳酸滴 度為約20g/L。到這時(shí)的乳酸收率為約70-75%。然后，乳酸產(chǎn)量放緩 至約0.37 g/L-hr，乳酸收率略微有所下降。該菌林在137小時(shí)后停止 產(chǎn)酸，此時(shí)發(fā)酵肉湯含有19g/L葡萄糖。乳酸滴度為42g/L。乳酸總 產(chǎn)率為0.31 g/L-hr，乳酸總收率為59-60%。菌抹CD1608的丙酮酸、 乙酸、甘油和二氧化碳的收率分別為0.0-0.1%、 0.8%、 0%和26-28%。 生物量收率為7.9-8.2%。這些結(jié)果表明，缺失天然《w7/CW2基因也能 有效破壞細(xì)胞產(chǎn)甘油的能力。另外，該基因的缺失(和由此而來的甘油 產(chǎn)量的缺失)對細(xì)胞生長沒有影響。
實(shí)施例4A:東方伊薩酵母的天然GPD1基因及其上游和下游側(cè)翼區(qū) 的克隆。
對來自幾種酵母(釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、解脂西洋蓍霉(r.
/*o/j^ca)、尸.j'a&w7、漢遜德巴利酵母(D. /za"化m7)和光滑假絲酵母 (C g/Wrato))的已知甘油-3-磷酸脫氫酶基因進(jìn)行比對，鑒定不同基因 中的高度保守區(qū)。在高度同源的這些區(qū)域中設(shè)計(jì)兩組簡并引物。這些 引物組經(jīng)鑒定分別為SEQ. ID. NO. 24和SEQ. ID. NO, 25 ，以及SEQ. ID. NO. 26和SEQ. ID. NO. 27。用第一組引物和東方伊薩酵母基因組 DNA作為;f莫板，進(jìn)行PCR，如期得到 200 bp產(chǎn)物。再用第二組引物和東方伊薩酵母基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR，如期得到 400bp 產(chǎn)物。這兩種PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，再用相同引物進(jìn)行測序。用所 得的部分序列，設(shè)計(jì)引物，用于基因組步測。用BD Clontech基因組 步測試劑盒并按制造商的說明，使用稱為SEQ. ID. NO. 28和SEQ. ID. NO. 29的最初PCR引物以及稱為SEQ. ID. NO. 30和SEQ. ID. NO. 31 的嵌套PCR引物，進(jìn)行基因組步測。將得自上游和下游基因組步測 的序列進(jìn)行比對，然后與先前得到的部分序列一起構(gòu)建東方伊薩酵母 的甘油-3-磷酸脫氫酶基因。
實(shí)施例4B:在耐熱克魯維酵母直接重復(fù)序列之間含有fwCT52基因 盒的質(zhì)粒(pMM28，圖5)的構(gòu)建。
使用稱為SEQ. ID. NO. 32和SEQ. ID. NO. 33的引物，從稱為 CD21的野生型馬克斯克魯維酵母菌4朱基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增完 整馬克斯克魯維酵母(《wC1^2)基因盒，包括啟動子和終止子 區(qū)，并引入5ami//和S"http://限制位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物與經(jīng)過Saw///和 Sa//消化的市售載體pUCl8 (來自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA) 連接在一起。所得質(zhì)粒稱為pMM25。
使用稱為SEQ. ID. NO. 35和SEQ. ID. NO. 36的引物，自耐熱克 魯維酵母基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增稱為SEQ.ID.NO.34的705 bp 序列，并引入Sp/z/和5^/限制位點(diǎn)。該耐熱克魯維酵母序列不編碼任 何活性蛋白質(zhì)。質(zhì)粒pMM25用5^/z/和5W/消化，再將耐熱克魯維酵 母序列與KmCT52盒上游(5，)連接起來，形成質(zhì)粒pMM27。
使用稱為SEQ. ID. NO. 37和SEQ. ID. NO. 38的引物，通過PCR 擴(kuò)增相同的耐熱克魯維酵母序列，并添加Sam///和Ima/限制位點(diǎn)。 質(zhì)粒pMM27用3flw///和Xma/消化，再將耐熱克魯維酵母序列與 《wCTB2盒下游(3，)連接起來，形成質(zhì)粒pMM28(圖5)。質(zhì)粒pMM28 含有側(cè)接耐熱克魯維酵母直接重復(fù)序列的尺wCTS2盒，這兩者方向相 同。實(shí)施例4C:含有潮霉素基因盒和瑞士乳桿菌LDH基因盒的質(zhì)粒 (pMI321，圖7)的構(gòu)建。
按照WO 02/042471實(shí)施例22所述的同樣方式，使用稱為SEQ. ID. NO. 39和SEQ. ID. NO. 40的引物，自C. so"orm^基因組DNA，得 到C. sowwe"^PGia基因的920bp探針片段。從培養(yǎng)的東方伊薩酵 母菌林中分離基因組DNA，重懸于10mM Tris-HCl + lmM EDTA (pH8) (TE)。東方伊薩酵母基因組DNA用T7/"Jin切割，再用標(biāo)準(zhǔn)方法，用 C. so"orm^ PGX 基因作為探針，進(jìn)行DNA印跡和雜交。從瓊脂糖 凝膠分離出 2kb大小的片段，并克隆到/Z/wffll切割的質(zhì)粒上，產(chǎn)生 按大小分級的文庫(size-fractionated library),再用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將 按大小分級的文庫與尸Gi^探針進(jìn)行菌落雜交，從而分離出含有 ///w/III片段以及大部分東方伊薩酵母PG《/ (7o尸G^"蛋白編碼序列、 但沒有啟動子序列的質(zhì)粒(通過測序證實(shí))。
用連接介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增，得到含有/oPG《7啟動子區(qū)的基因組片 段(Mueller， P.R.和Wold, B. 1989, "In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR." 5"c/ewce 246:780-786)。 用 T4 DNA連才矣酶(New England BioLabs)，將稱為SEQ. ID. NO. 41的4妄 頭和稱為SEQ. ID. NO. 42的接頭的混合物，與//"elll消化的東方伊 薩酵母基因組DNA連接。連接混合物樣品用作模板，用于50plPCR 反應(yīng)，其中含有O.l(iM稱為SEQ. ID. NO. 43的引物和lpM稱為SEQ. ID. NO. 44的引物。加入2U的Dynazyme EXT之后，將反應(yīng)混合物 在94。C加熱3分鐘。如下進(jìn)行30次循環(huán)的反應(yīng)94°C 1分鐘，68°C 2分鐘，72°C 2分鐘；最后在72。C延伸10分鐘。在含有0.05pM稱為 SEQ. ID. NO. 45的引物和0.5稱為SEQ. ID. NO. 46的引物的嵌套 PCR反應(yīng)物(50pl)中，將這個(gè)第一PCR擴(kuò)增的稀釋樣品用作模板。力口 入2U的Dynazyme EXT之后，將反應(yīng)混合物在94。C加熱3分鐘。然 后，如下進(jìn)行30次循環(huán)的反應(yīng)94°C l分鐘，67°C 2分鐘，72°C 2分鐘；最后在72'C延伸IO分鐘。
分離~600 bp PCR片段并測序。設(shè)計(jì)稱為SEQ. ID. NO. 47和SEQ. ID.NO.48的嵌套引物，與類似于以上的經(jīng)鑒定為SEQ. ID. NO. 49和 SEQ. ID. NO. 50的寡核苷酸一起，用于連接介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增，只是 使用&/7I消化的東方伊薩酵母DNA，采用65。C的退火溫度進(jìn)行PCR。
使用稱為SEQ. ID.NO. 51和SEQ.ID.NO. 52的引物，并使用東 方伊薩酵母基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增東方伊薩酵母尸GX7 啟動子區(qū)。用Klenow酶填補(bǔ)片段，再用力al消化。通過凝膠分離出 633 bp片段，與用lol消化質(zhì)粒pMI270所得到的4428 bp片段連接(參 見WO 03/049525圖4)，用Klenow酶和O.lmM dNTP填補(bǔ)片段，再 用消化。質(zhì)粒pMI270含有與C. ^worem^ PG/"啟動子和釀酒 酵母終止子連接的大腸桿菌潮霉素基因。所得質(zhì)粒稱為 pMI318 (圖6)。質(zhì)粒pMI318含有處于東方伊薩酵母尸(7A7啟動子和 釀酒酵母O4ZJ0終止子控制之下的大腸桿菌潮霉素基因。
使用稱為SEQ. ID. NO. 53和SEQ. ID. NO. 54的引物，并使用東 方伊薩酵母基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增東方伊薩酵母PGK7 啟動子。用Klenow酶和O.lmM dNTP填補(bǔ)片段，再用TVcoI切割。通 過凝膠分離出633 bp片段。質(zhì)粒pVRl (參見WO 03/102152圖7)含 有處于釀酒酵母7EF7啟動子和釀酒酵母C7C7終止子控制之下的瑞 士乳桿菌￡0//基因。質(zhì)粒pVRl用iol消化，用Klenow酶填補(bǔ)， 再用iVcol切割。將來自質(zhì)粒pVRl的7386 bp片段與633 bp的ToPGX7 啟動子片段連接起來。所得質(zhì)粒稱為pMI320。質(zhì)粒pMI320含有處于 /o尸G"啟動子和釀酒酵母CTC 終止子控制之下的瑞士乳桿菌ID// 基因。
質(zhì)粒pMI318和pMB20用4t al和消化。將來自質(zhì)粒pMI318 的5008 bp片段與來自質(zhì)粒pMI320的1995 bp片段連接起來，形成質(zhì) 粒pMI321 (圖7)。
潮霉素基因(及其終止子)位于質(zhì)粒pMI321的兩個(gè)拷貝的/aPG7a啟動子之間，作為直接重復(fù)序列。
實(shí)施例4D:具有大腸桿菌潮霉素基因盒、瑞士乳桿菌LDH基因盒和 /oPi)CL4 5，側(cè)翼區(qū)的質(zhì)粒(pMI355，圖8)的構(gòu)建。
按照制造商的說明，將野生型東方伊薩酵母菌林ATCC PTA-6658 的基因組文庫構(gòu)建到SuperCosl (Stratagene)粘粒載體中。使用稱為 SEQ. ID. NO. 55和SEQ. ID. NO. 56的引物，自該菌株的基因組DNA 通過PCR擴(kuò)增PDC樣序列。擴(kuò)增PDC基因的700 bp片段。按照WO 03/049525所述，用雜交技術(shù)，用帶標(biāo)記的PCR片段作為探針，篩選 基因組文庫，然后分離含有尸DC基因的粘?？寺〔y序。用稱為SEQ. ID. NO. 57和SEQ. ID. NO. 58的引物，并使用東方伊薩酵母PDCL4 粘粒DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增東方伊薩酵母可讀框起始上游的 1000 bp至167 bp的尸DC" 5，區(qū)。該片段用和&cl切割。通過 凝膠分離836 bp片段，然后與用& /1和5^1消化質(zhì)粒pMI321 (圖7，實(shí) 施例4C)所得到的6992 bp片段連接起來。所得質(zhì)粒稱為pMI355 (圖 8)。
實(shí)施例4E:含有/^P"CX4 5，側(cè)翼區(qū)、大腸桿菌潮霉素基因盒、瑞士 乳桿菌LDH基因盒和/0戶"CX4 3'側(cè)翼區(qū)的質(zhì)粒(pMI356和pMI357 (圖9))的構(gòu)建。
使用稱為SEQ. ID. NO. 59和SEQ. ID. NO. 60的引物，并使用東
方伊薩酵母粘粒DNA (實(shí)施例4D)作為模板，通過PCR擴(kuò)增 對應(yīng)于尸DC翻i,終止密碼子的524 bp上游至217 bp下游序列的東方 伊薩酵母尸Z)CL4 3，區(qū)。片段用J; al和5Vwal切割。通過凝膠分離630 bp片段，與用j/ al和Swal消化質(zhì)粒pMI355 (圖8,實(shí)施例4D)所得 到的7809 bp片段連接起來。所得質(zhì)粒稱為pMI357 (圖9)。其在 /oPDCL4基因的5'側(cè)翼與部分3'側(cè)翼之間含有來自質(zhì)粒pMI355的潮 霉素和LDH盒。以同樣方式構(gòu)建質(zhì)粒pMB56,除了使用不同部位的東方伊薩酵 母尸DCL4 3'區(qū)以外。
實(shí)施例4F:含有A iV)CL4 5，側(cè)翼區(qū)、5WVf^X5基因盒、瑞士乳桿菌 丄"好基因盒和/oPDCX4 3，側(cè)翼區(qū)的質(zhì)粒pMI433 (圖IO)的構(gòu)建。
使用稱為SEQ. ID. NO. 61和SEQ. ID. NO. 62的引物，并使用東
方伊薩酵母基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增東方伊薩酵母 啟動子。用Klenow酶和O.lmM dNTP填補(bǔ)該片段，然后用Sp/;I切割。 通過凝膠分離669 bp片段。質(zhì)粒pMI233 (參見WO 03/049525圖23C) 用lol切割。用Klenow酶填補(bǔ)該片段，再用切割。將4534 bp 和669 bp片段連接起來，所得質(zhì)粒稱為pMI319。質(zhì)粒pMI319含有釀 酒酵母ME丄5 (ScM五丄5)基因和/o戶GK/啟動子區(qū)。
質(zhì)粒pMI319質(zhì)粒用jpal切割，用T4聚合酶產(chǎn)生平端，再用iVM 切割。通過凝膠分離2317bp片段。將其與用消化質(zhì)粒pMD57(實(shí) 施例4E)所得到的6498bp片段連接起來，用Klenow酶產(chǎn)生平端，再 用iVM切割。所得質(zhì)粒含有5bM五丄5基因(具有其天然終止子)，其位 置在質(zhì)粒pMI357的潮霉素基因。所得質(zhì)粒稱為pMI433 (
圖10)。
實(shí)施例4G:含有東方伊薩酵母CT^2 5，側(cè)翼區(qū)、ScAffil5基因盒(位 于耐熱克魯維酵母直接重復(fù)序列之間)和東方伊薩酵母CrB2 3，側(cè)翼 區(qū)的質(zhì)粒pMI449 (圖ll)和pMI454 (圖l"的構(gòu)建。
質(zhì)粒pMNG8 (圖5，實(shí)施例4B)用5amHI消化，用Klenow酶填 補(bǔ)，再用M消化。將由此得到的4077 bp片段與p廳33 (
圖10，實(shí) 施例4F)的2317 bp (用Klenow酶填補(bǔ))-5"a/1片段連接起來。所得 質(zhì)粒稱為pMI445。
使用稱為SEQ. ID. NO. 63和SEQ. ID. NO. 64的引物，并使用 粘?？寺∽鳛槟０澹ㄟ^PCR擴(kuò)增東方伊薩酵母L-乳酸:高鐵 細(xì)胞色素c氧化還原酶(/oCFS24)基因3'側(cè)翼區(qū)(對應(yīng)于預(yù)測可讀框起始90-676 bp下游的序列)。所得PCR產(chǎn)物用Sacl和5"mal消化，將所 得607 bp片段與質(zhì)粒pMI445的6386 bp 片段連接在一起。
所得質(zhì)粒稱為pMI448。
使用稱為SEQ. ID. NO. 65和SEQ. ID. NO. 66的引物，并再次使 用CK52-2粘?？寺∽鳛椴拍猑1,通過PCR擴(kuò)增/oCTBZ4 5'側(cè)翼區(qū)(對 應(yīng)于預(yù)測可讀框起始913-487 bp上游的序列)。所得PCR產(chǎn)物用 消化，將所得454 bp片段與部分消化質(zhì)粒pMI448所得到的6993 bp S/^I片段連接在一起。所得質(zhì)粒稱為pMI449(
圖11)。
使用稱為SEQ. ID. NO. 67和SEQ. ID. NO. 68的引物，并再次使 用CTS2-2粘?？寺∽鳛槟０?，通過PCR擴(kuò)增/oCTB24 5'側(cè)翼區(qū)(對 應(yīng)于預(yù)測可讀框466-7 bp上游)。所得PCR產(chǎn)物用Sp/zl消化，將所得 493 bp片段與部分消化質(zhì)粒pMI448所得到的6993 bp 片段連接 在一起。所得質(zhì)粒稱為pMI453。
使用稱為SEQ. ID. NO. 69和SEQ. ID. NO. 70的引物，并使用 2粘粒作為模板，通過PCR擴(kuò)增/oC7BZ4 3，側(cè)翼區(qū)(對應(yīng)于預(yù)測 終止密碼子402 bp上游至77 bp下游)。所得PCR產(chǎn)物用J/ "I和Swal 消化，再將所得506 bp片段與質(zhì)粒pMI453的6886 bp 片段
連接在一起。所得質(zhì)粒稱為pMI454 (
圖12)。
實(shí)施例4H:含有/0G戶"/基因上游片段、第一耐熱克魯維酵母直接 重復(fù)部分、Affi丄5基因盒、第二耐熱克魯維酵母直接重復(fù)部分和 "GPiX 基因下游片段的質(zhì)粒(pBH165，
圖13)的構(gòu)建。
質(zhì)粒pMI449用AWe/和幼/7消化，切下5' CyBZ4側(cè)翼同源序列。 6.8 kbp片段通過凝膠純化并脫去磷酸。使用稱為SEQ. ID. NO. 71和 SEQ. ID. NO. 72的引物，通過PCR擴(kuò)增實(shí)施例4A的/oGPD7基因的 302 bp片段(對應(yīng)于該基因起始密碼子的堿基對1-302)。 PCR產(chǎn)物通過 凝膠純化，用Mfe/和幼#消化，然后與質(zhì)粒pMI449的6.8 kbp片段 連接起來，得到質(zhì)粒pBH164。質(zhì)粒pBH164再用Xma/和五coi 7消化，切下3， 側(cè)翼同源序列。所得6.5 kbp片段通過凝膠純化并脫去
磷酸。使用稱為SEQ. ID. NO. 73和SEQ. ID. NO. 74的引物，通過PCR 擴(kuò)增實(shí)施例4A的JoG戶D7基因的346 bp片段(對應(yīng)于起始密碼子的堿 基對322-668)。所得PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，用Xma/和五coi 7消化， 然后與得自PBH164的6.5 kbp片段連接起來，產(chǎn)生pBH165 (
圖13)。 按照轉(zhuǎn)錄順序，質(zhì)粒pBH165含有/oG戶Z)7基因的302 bp片段、 第一耐熱克魯維酵母直接重復(fù)部分、M￡ZJ基因盒、第二耐熱克魯維 酵母直接重復(fù)部分和/oGPD7基因的346 bp片段。設(shè)計(jì)該質(zhì)粒，用于 在天然/oG尸D7基因的基因座進(jìn)行插入(以破壞該基因)，然后環(huán)出 (loop-out) ME丄5基因盒。
實(shí)施例41:通過用質(zhì)粒pMI356 (實(shí)施例4F)轉(zhuǎn)化野生型東方伊薩酵母 菌林， 一步產(chǎn)生具有缺失的/o戶Z)CX4基因和iW)"CTB基因以及整合 的丄^LW7基因的東方伊薩酵母突變體(CD1184)。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法，用質(zhì)粒pMI356轉(zhuǎn)化野生型東方伊薩酵母菌抹 ATCCPTA-6658。轉(zhuǎn)化菌株在潮霉素平板上培養(yǎng)。選擇一個(gè)不產(chǎn)乙醇 的轉(zhuǎn)化子，用于DNA印跡分析，證實(shí)其同時(shí)缺失兩個(gè)/oPDCL4等位 基因并插入至少一個(gè)拷貝的ZALD/f基因。該菌林稱為CD1184。
實(shí)施例4J:通過用質(zhì)粒pMI449 (實(shí)施例4G，圖ll)和pMI454 (實(shí)施 例4G，
圖12)相繼轉(zhuǎn)化菌林CD1184 (實(shí)施例41)，然后進(jìn)行誘變，產(chǎn) 生東方伊薩酵母突變菌林(CD1496)。
用乙酸鋰方法，用質(zhì)粒pMI449轉(zhuǎn)化菌抹CD1184,然后根據(jù)在 YPD X-a-gal平板上的蜜二糖酶活性選擇轉(zhuǎn)化子(藍(lán)色菌落)。在一些轉(zhuǎn) 化子上，通過菌落PCR和DNA印跡分析，證實(shí)菌抹CD1184的 /oCTS24基因被取代。通過同源重組事件，通過耐熱克魯維酵母重復(fù) 序列，從這些轉(zhuǎn)化子中環(huán)出M五Z^標(biāo)記(通過DNA印跡分析證實(shí))。然 后用質(zhì)粒pMI454，從該轉(zhuǎn)化子中缺失第二CTSZ4等位基因。通過菌落PCR分析轉(zhuǎn)化子中缺失1000 bp 特異性PCR產(chǎn)物。從具有
通過上述重組而缺失的第二 CTBZ4等位基因的轉(zhuǎn)化子中，環(huán)出來自質(zhì) 粒pMI454的ME丄5標(biāo)記。該轉(zhuǎn)化子稱為菌林CD1436。菌抹CD1436 同時(shí)缺失兩個(gè)尸Z)C7基因(被功能性L-丄D/Z基因盒取代)并同時(shí)缺失其 兩個(gè)天然/oCKS2基因。
使用實(shí)施例1A所提出的條件(除了暴露條件為8 達(dá)1小時(shí)之 外)，對菌抹CD1436進(jìn)行EMS誘變。讓誘變細(xì)胞在200 YP + 20 g/L 葡萄糖培養(yǎng)基中再培養(yǎng)6小時(shí)，然后倒在PDA + 35 g/L乳酸平板上， 3(TC孵育l周。比菌林CD1436產(chǎn)生較多乳酸和較少甘油的菌抹稱為 菌抹CD1496。
實(shí)施例4K:用質(zhì)粒pBH165 (實(shí)施例4H，
圖13)轉(zhuǎn)化菌林CD1184 (實(shí) 施例4I)和CD 1496 (實(shí)施例4J)，接著環(huán)出選擇標(biāo)記，分別得到轉(zhuǎn)化 菌林CD1667和CD1671,其具有單個(gè)GPD1等位基因缺失。
培養(yǎng)菌抹CD1184,用經(jīng)A/"tfe/和￡caR/消化質(zhì)粒pBH165所得的 5嗎4.4 kbp片段轉(zhuǎn)化該菌抹。在覆蓋X-a-gal (5-溴4-氯-3-吲哚基-a-D-吡喃半乳糖苷)的酵母氮基礎(chǔ)(YNB) + 2%蜜二糖平板上選擇轉(zhuǎn)化子。 在3(TC生長 4天后可見藍(lán)色轉(zhuǎn)化子。挑取8個(gè)轉(zhuǎn)化子，接種含有 X-ot-gal的YP + 20 g/L葡萄糖平板，以得到單菌落。挑取各轉(zhuǎn)化子的 藍(lán)色單菌落，在YP + 20 g/L葡萄糖平板上重新劃線。從轉(zhuǎn)化子中分 離基因組DNA。使用稱為SEQ. ID. NO. 75和SEQ. ID. NO. 76的引物， 通過PCR證實(shí)/oG尸Z)7基因中有一個(gè)等位基因被破壞。5個(gè)轉(zhuǎn)化子表 現(xiàn)出預(yù)期的 2kb產(chǎn)物。這些轉(zhuǎn)化子中的一個(gè)稱為菌株CD1655。使用 稱為SEQ. ID. NO. 77和SEQ. ID. NO. 78的引物，通過PCR進(jìn)一步證 實(shí)天然/oG尸D/基因中有一個(gè)拷貝被破壞。
將菌抹CD1655在YP+100g/L葡萄糖上、在30。C生長幾輪。將 系列稀釋液倒在覆蓋X-a-gal的YP + 20 g/L平板上，在3(TC生長過夜。 選擇白色菌落(這表明MEL 5標(biāo)記盒的環(huán)出)，并重新劃線在YP +20 g/L葡萄糖+ X-a-gal平板上。選擇白色菌落。使用稱為SEQ. ID. NO. 69和SEQ. ID. NO. 80的引物，通過PCR證實(shí)天然/oG尸D7基因中有 一個(gè)等位基因被破壞。該轉(zhuǎn)化子稱為菌林CD1667。
以同樣方式轉(zhuǎn)化菌林CD1496。在PCR時(shí)顯示出預(yù)期~2 kbp條帶 的轉(zhuǎn)化子稱為菌抹CD1657。通過如上所述用于菌林CD1655的PCR， 證實(shí)天然/oGPD/基因中有一個(gè)等位基因被破壞。再將菌株CD1657 培養(yǎng)幾輪,選擇具有ME丄5標(biāo)記基因盒缺失的菌落,稱為菌林CD1671 。 通過如上所述的PCR，證實(shí)天然/oG尸D7基因中有一個(gè)等位基因被破 壞。
實(shí)施例4L:用質(zhì)粒pBH165 (實(shí)施例4H，
圖13)轉(zhuǎn)化菌林CD1667 (實(shí) 施例4K)和CD1671 (實(shí)施例4K)，分別得到轉(zhuǎn)化菌林CD1688和 CD1690，其兩個(gè)/0G尸/X 等位基因都缺失。
用經(jīng)A^fe/和五coR7消化質(zhì)粒pBH165所得的5嗎4.4 kbp片段轉(zhuǎn) 化菌抹CD1667。在覆蓋X-a-gal的YNB + 2%蜜二糖平板上選擇轉(zhuǎn)化 子。在30'C生長 4天后可見藍(lán)色轉(zhuǎn)化子。挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子，接種含 有X-a-gal的YP + 20 g/L葡萄糖平板，以得到單菌落。挑取各轉(zhuǎn)化子 的藍(lán)色單菌落，在YP + 20 g/L葡萄糖平板上重新劃線。從轉(zhuǎn)化子中 分離基因組DNA。使用稱為SEQ. ID. NO 81和SEQ. ID. NO. 82的引 物，在三個(gè)轉(zhuǎn)化子中，通過PCR證實(shí)/oG尸D7基因中的第二等位基因 被破壞。這些轉(zhuǎn)化子中的一個(gè)稱為菌抹CD1688。
:接照同樣方式轉(zhuǎn)化菌4朱CD1671。 PCR顯示，在一個(gè)稱為菌才朱 CD 1690的轉(zhuǎn)化子中，/oG尸D7基因的第二等位基因被破壞。
實(shí)施例5:菌抹CD1184 (實(shí)施例41)和CD1688 (實(shí)施例4L)在OUR為 5.5-5.6時(shí)的微好氧分批培養(yǎng)。
向含成分確定培養(yǎng)基(包含硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂、痕量 元素、維生素、消泡劑和約50g/L葡萄糖)的單級分批培養(yǎng)反應(yīng)器中，接種1 mL菌抹CD1688。將培養(yǎng)基的pH調(diào)至約3.5,然后再加入細(xì) 胞。在細(xì)胞生長和開始產(chǎn)乳酸時(shí)，讓培養(yǎng)物的pH降至3.0。此后，通 過加入氫氧化鉀，使pH維持在約3.0。向發(fā)酵物中添加葡萄糖約 1-2 g/L/hr,直到總共加入136.1 g/L葡萄糖。在攝氧率為約5.5-5.6 mmol/L/hr的通氣條件下于30。C培養(yǎng)細(xì)胞。
菌抹CD1688產(chǎn)生乳酸的速率為1.02g/L-hr，直到乳酸滴度為約 70g/L。此時(shí)的乳酸收率約74%。在77小時(shí)后，該菌4朱4f止生產(chǎn)，此 時(shí)的發(fā)酵肉湯含有15.3 g/L葡萄糖。乳酸總產(chǎn)率為1.06 g/L-hr,乳酸 總收率為70%。菌抹CD1688的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分別 為1.9%、 0%和23.7%。生物量收率為3.5%。
為了進(jìn)行比較，在類似條件下培養(yǎng)菌株CD1184 (并非本發(fā)明的實(shí) 施例)。菌林CD1184產(chǎn)生乳酸的速率為1.24g/L-hr，直到乳酸滴度為 約70g/L。此時(shí)的乳酸收率約74%。在77小時(shí)后，該菌4^停止生產(chǎn)， 此時(shí)的發(fā)酵肉湯含有15.3 g/L葡萄糖。乳酸總產(chǎn)率為1.06 g/L-hr，乳 酸總收率為70%。菌林CD1184的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分 別為2.1%、 9.3%和15.9%。生物量收率為3.2%。
這些結(jié)果表明，在這些發(fā)酵條件下，天然/oG尸D7基因的缺失阻 止細(xì)胞產(chǎn)生可檢測量的甘油。如上所述，該基因的缺失(以及由此而來 的甘油產(chǎn)量的缺失)對細(xì)胞生長沒有或很少有影響。
實(shí)施例6:菌株CD1184 (實(shí)施例41)和CD1688 (實(shí)施例4L)在OUR為 9.9-10時(shí)的微好氧分批培養(yǎng)。
」換照實(shí)施例5所述的類似方法，分別培養(yǎng)菌一朱CD1688和 CD1184，除了選擇通氣條件使攝氧率為9.9-10.0 mmol/L/hr，而且在 培養(yǎng)期間不向系統(tǒng)中添加葡萄糖之外。將酵母外殼添加到菌林
CD1688培養(yǎng)物中。
在這些條件下，菌抹CD1184產(chǎn)生乳酸的速率為1.87 g/L-hr,直 到乳酸滴度為約70g/L。此時(shí)的乳酸收率約73%。在67.5小時(shí)后，該菌林停止生產(chǎn)，此時(shí)發(fā)酵肉湯中的葡萄糖濃度從60 g/L降至2.1 g/L。 乳酸總產(chǎn)率為1.43 g/L-hr,乳酸總收率為70%。菌抹CD1184的丙酮 酸、甘油和二氧化碳的收率分別為2.1%、 5.7%和21.5%。生物量收率 為4.4%。
菌林CD1688產(chǎn)生乳酸的速率為1.68 g/L-hr，直到乳酸滴度為約 70g/L。此時(shí)的乳酸收率約80%。在78小時(shí)后，該菌抹停止生產(chǎn)，此 時(shí)發(fā)酵肉湯中的葡萄糖濃度從53.5 g/L降至4.8 g/L。乳酸總產(chǎn)率為 1.26 g/L-hr,乳酸總收率為77%。菌抹CD1688的丙酮酸、甘油和二 氧化碳的收率分別為1.2%、 0%和23.2%。生物量收率為5.95%。如上 所述，這些結(jié)杲表明，在這些發(fā)酵條件下，天然/oG尸D/基因的缺失 阻止細(xì)胞產(chǎn)生可檢測量的甘油，而且該基因的缺失(以及由此而來的甘 油產(chǎn)量的缺失)對細(xì)胞生長沒有影響。另外，/oG尸D7的缺失改善了乳 酸的總收率。
實(shí)施例7:菌林CD16卯(實(shí)施例4L)在OUR為5-6時(shí)的孩t好氧分批培 養(yǎng)。
按照實(shí)施例5所述的類似方法，培養(yǎng)菌4朱CD1690，除了選擇通 氣條件使攝氧率為5.75 mmol/L/hr,而且發(fā)酵培養(yǎng)基為YP + 70 g/L葡 萄糖之外。
在這些條件下，菌抹CD1690產(chǎn)生乳酸的速率為0.66 g/L-hr，直 到乳酸滴度為約70g/L。此時(shí)的乳酸收率約78%。在121小時(shí)后，該 菌林停止生產(chǎn)，此時(shí)發(fā)酵肉湯中的葡萄糖濃度降至23.8 g/L (從培養(yǎng)開 始時(shí)的127.9 g/L)。乳酸總產(chǎn)率為0.61 g/L-hr，乳酸總收率為77%。丙 酮酸、甘油和二氧化^ 友的收率分別為0%、 0%和31.1%。生物量收率 為2.4%。另夕卜，這些結(jié)果表明，在這些發(fā)酵條件下，兩個(gè)天然/oG尸D7 等位基因的同時(shí)缺失阻止細(xì)胞產(chǎn)生可檢測量的甘油，而且對細(xì)胞生長 沒有或很少有影響。
按照實(shí)施例5所述的一般性方法(使用其中所述的成分確定培養(yǎng)基)，培養(yǎng)菌株CD1690多兩次，除了 OUR為5.2mmol/L/hr且向發(fā)酵 肉湯中添加甘油之外。第 一輪加入0.1 g/L甘油，第二輪加入1.0 g/L 甘油。
當(dāng)加入0.1 g/L甘油時(shí)，菌抹CD1690產(chǎn)生乳酸的速率為 0.74 g/L-hr，直到乳酸滴度為約70 g/L。此時(shí)的乳酸收率約78%。在 121小時(shí)后，該菌株停止生產(chǎn)，此時(shí)發(fā)酵肉湯中的葡萄糖濃度降至 10.2g/L(從培養(yǎng)開始時(shí)117.8 g/L)。乳酸總產(chǎn)率為0.68g/L-hr，乳酸總 收率為76%。丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分別為0.2%、 0%和 25.3%。生物量收率為4.1%。
當(dāng)加入1.0g/L甘油時(shí)，得到非常類似的結(jié)果。
這些結(jié)果出乎意料地表明，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘油，對這些轉(zhuǎn) 化子生長和產(chǎn)生乳酸的能力沒有或很少有影響，盡管細(xì)胞產(chǎn)甘油的天 然能力被破壞。
實(shí)施例8A:含有IoGPD15，側(cè)翼區(qū)、位于直接重復(fù)序列之間的大腸桿 菌潮霉素基因盒和IoGPD13，側(cè)翼區(qū)的質(zhì)粒(pTMC61 (
圖14))的構(gòu)建。 使用稱為SEQ. ID. NO. 83和SEQ. ID. NO. 84的引物，用質(zhì)粒 pMI356 (實(shí)施例4E,參見圖9)作為模板，通過PCR擴(kuò)增潮霉素基因盒。 PCR條件是95°C 5分鐘(一次)，30次循環(huán)(95。C (30秒)、56°C (30 秒)和72。C (2分鐘))，然后72。C IO分鐘一次循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物用 ^e/和5W/消化，連接在經(jīng)同樣消化的質(zhì)粒pBH165 (實(shí)施例4H，圖 13)上，得到質(zhì)粒pTMC61(
圖14)。
實(shí)施例8B:轉(zhuǎn)化所選擇的具有質(zhì)粒pBH165 (實(shí)施例4H，
圖13)的野 生型東方伊薩酵母菌林，然后環(huán)出選擇標(biāo)記，得到單個(gè)(7尸D/等位基 因缺失的轉(zhuǎn)化菌林CD2624。
野生型東方伊薩酵母菌抹ATCC PTA-6658在含有低濃度葡萄糖 和高濃度乳酸的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)多代。分離出在這些條件下生長良好的細(xì)胞，稱為菌抹CD1822。在含有葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 時(shí)，菌抹CD1822產(chǎn)生乙醇和甘油。培養(yǎng)菌林CD1822，按照實(shí)施例 4K所述的類似方法，用質(zhì)粒pBH165轉(zhuǎn)化。按照實(shí)施例4K所述，在 覆蓋X-a-gal (5-淡-4-氯-3-吲哚基-a-D-吡喃半乳糖苷)的酵母氮基礎(chǔ) (YNB) + 2。/。蜜二糖平板上選擇轉(zhuǎn)化子，挑取藍(lán)色菌落，在YP + 20g/L 葡萄糖平板上重新劃線。從轉(zhuǎn)化子中分離基因組DNA,并通過兩組 PCR反應(yīng)，分析缺失構(gòu)建體的整合。第一組使用的引物稱為SEQ.ID. NO. 85和SEQ. ID. NO. 86，第二組使用的引物稱為SEQ. ID. NO. 87 和SEQ. ID. NO, 88。由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物分別為2.0 kbp和1.4 kbp， 表明已有一個(gè)G尸Z)7等位基因被破壞。使用稱為SEQ. ID. NO. 85和 SEQ.ID.NO. 88的引物，完成第三組PCR反應(yīng)；其產(chǎn)生0.8kbp產(chǎn)物， 表明未被破壞的G尸D7等位基因依然存在于轉(zhuǎn)化子中。該轉(zhuǎn)化子稱為 菌林CD2624。
實(shí)施例8C:用質(zhì)粒pTMC61 (實(shí)施例8A，
圖14)轉(zhuǎn)化菌林CD2624 (實(shí) 施例8B)，得到轉(zhuǎn)化菌林CD2627,其兩個(gè)/oGPD/等位基因都同時(shí)缺 失。
用稱為SEQ. ID. NO. 89和SEQ. ID. NO. 90的引物并用質(zhì)粒 pTMC61作為模板，進(jìn)行PCR。得到4.1 kbp片段，用于轉(zhuǎn)化菌抹 CD2624。在YPD + 300嗎/ml潮霉素上選擇轉(zhuǎn)化子。從100個(gè)轉(zhuǎn)化子 中分離基因組DNA，并在三組PCR反應(yīng)中用作模板。第一組使用的 引物稱為SEQ. ID. NO. 91和SEQ. ID. NO. 88,在30個(gè)轉(zhuǎn)化子中產(chǎn)生 1.5 kbp產(chǎn)物。第二組PCR反應(yīng)在來自這30個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組DNA 上進(jìn)行，使用稱為SEQ. ID. NO. 85和SEQ. ID. NO. 92的引物。10個(gè) 菌4^表現(xiàn)出預(yù)期的2.5 kbp產(chǎn)物。然后，用稱為SEQ. ID. NO. 85和SEQ. ID.NO. 88的引物，分析這10個(gè)菌抹的基因組DNA。不產(chǎn)生0.8kbp 片段的2個(gè)菌株的兩個(gè)(7尸D7等位基因同時(shí)被破壞。這些是在YNB + 2.0%蜜二糖平板上培養(yǎng)物進(jìn)行檢測的。 一個(gè)菌林能夠生長，稱為菌林CD2627。
實(shí)施例8D:菌林CD1822、菌林CD2624 (實(shí)施例8B)和菌林CD2627 (實(shí) 施例8C)的微好氧培養(yǎng)。
菌林CD1822、 CD2624和CD2627在微好氧搖弁復(fù)酵中培養(yǎng)，一 式兩份。菌株在裝有25 mL成分確定培養(yǎng)基(含 100 g/mL葡萄糖)的 250 mL帶擋板搖瓶中，在30。C和250 rpm攪拌下培養(yǎng)過夜。成分確 定;咅養(yǎng)基4姿照以下文獻(xiàn)戶斤述Peter M. Bruinenberg, Johannes P. Van Dijken和W. Alexander Schefferes， 1983， An Enzymatic Analysis of NADPH Production and Consumption in C朋(i油 w"7/s, J! Ge"era/ M/cra&o/ogv第129巻，第965-971頁，除了視需要存在額外葡萄糖、 而且煙酸增加至5m g/L之外。
所得培養(yǎng)物用于接種裝有50 mL成分確定培養(yǎng)基(含100 g/L葡萄 糖)的250 mL帶擋板搖瓶中，至OD,為0.2。然后，將這些搖瓶在 30°C以100 rpm孵育22小時(shí)。然后通過HPLC分析培養(yǎng)基中的葡萄糖、 甘油和乙醇。也測定生物量收率。
菌抹CD1822在22小時(shí)培養(yǎng)期間消耗所有葡萄糖，產(chǎn)生6.0g/kg 甘油、34.54g/kg乙醇，生物量達(dá)OD600 14.8。
一個(gè)G尸Z)7等位基因被破壞的菌林CD2624消耗所有葡萄糖，產(chǎn) 生5.88g/kg甘油和35.25g/kg乙醇。產(chǎn)生生物量達(dá)00600 14.5。
兩個(gè)GPD1等位基因同時(shí),皮石皮壞的菌4朱CD2627在22小時(shí)期間 消耗大約12.39g/kg葡萄糖。甘油產(chǎn)量為0.34g/kg。乙醇產(chǎn)量為 23.06g/kg,產(chǎn)生生物量達(dá)OD6。0 11.5。這些結(jié)果表明，在這些條件下， 東方伊薩酵母中G尸D7等位基因的破壞，使葡萄糖消耗率有少量下降， 乙醇產(chǎn)量和生物量產(chǎn)量有少量下降。然而，菌抹CD2627生長良好， 產(chǎn)生乙醇良好，甘油產(chǎn)量最少。這些結(jié)果還表明，G尸D7缺失體的生 長和生產(chǎn)能力并不依賴于PDC活性的破壞或從丙酮酸到乳酸途徑的 添力口。
權(quán)利要求
1. 一種全基因組重復(fù)前酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而缺失或破壞了從磷酸二羥丙酮到甘油的天然代謝途徑。
2. 權(quán)利要求1的細(xì)胞，所述細(xì)胞是半子嚢菌。
3. 權(quán)利要求2的細(xì)胞，所述細(xì)胞在其可代謝的碳源存在下進(jìn)行培 養(yǎng)時(shí)，代謝以重量計(jì)2%以下碳源并由所述細(xì)胞消耗用以產(chǎn)生甘油。
4. 權(quán)利要求3的細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而產(chǎn)生有機(jī)酸。
5. 權(quán)利要求4的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有功能性丄D7/基因盒，而且 所述細(xì)胞產(chǎn)生乳酸。
6. 權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包括 至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氪酶基因的缺失或^L壞。
7. 權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包括 至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
8. 權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包括 至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氫酶基因的缺失或破壞以及至少一個(gè)天 然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
9. 權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞可包 括至少一個(gè)天然二羥丙酮磷酸酶基因的缺失或^^壞、天然甘油脫氳酶 基因的缺失或破壞、或者天然二羥丙酮磷酸酶基因和天然甘油脫氫酶 基因兩者同時(shí)缺失或破壞。
10. 權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有從丙酮酸到乙 醇的天然代謝途徑的缺失或破壞。
11. 一種屬于酵母復(fù)合群的接合酵母屬(Zj;go^cc/wramycM)、接 合有孢圓酵母屬(Z嫂otonJflspora)、 有孢圓酵母屬 (Tbrw/aspora)、丄ac/z""cea、克魯維酵母屬(尺/wyweramyc&s)、 4i嚢酵母 屬(￡>emof/2ec/w w)或有孑包、;又遜酵母屬(T/a"sem'ospon3)進(jìn)4匕才支(Kurtzman 2003)的細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而缺失或破壞了從磷酸二羥丙酮到甘油的天然代謝途徑。
12. 權(quán)利要求12的細(xì)胞，所述細(xì)胞在其可代謝的碳源存在下進(jìn)行 培養(yǎng)時(shí)，代謝以重量計(jì)2%以下碳源并由所述細(xì)胞消耗用以產(chǎn)生甘油。
13. 權(quán)利要求12的細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而產(chǎn)生有機(jī)酸。
14. 權(quán)利要求13的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有功能性ZZ)Z/基因盒，而 且所述細(xì)胞產(chǎn)生乳酸。
15. 權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中所述天然代i射途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氬酶基因的缺失或破壞。
16. 權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
17. 權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氫酶基因的缺失或破壞以及至少一個(gè) 天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
18. 權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞可 包括至少一個(gè)天然二羥丙酮磷酸酶基因的缺失或破壞、天然甘油脫氫 酶基因的缺失或破壞、或者天然二幾丙酮磷酸酶基因和天然甘油脫氫 酶基因兩者同時(shí)缺失或破壞。
19. 權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有從丙酮酸到 乙醇的天然代謝途徑的缺失或破壞。
20. 克魯維酵母屬(幻w"eram;/c")、假絲酵母屬(Ca"&Vfo)或伊薩 酵母屬(/^flfc/^"^")的細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而缺失或破壞了 從磷酸二羥丙酮到甘油的天然代:射途徑。
21. 權(quán)利要求20的細(xì)胞，所述細(xì)胞在其可代謝的碳源存在下進(jìn)行 培養(yǎng)時(shí)，代謝以重量計(jì)2%以下>^友源并由所述細(xì)胞消耗用以產(chǎn)生甘油。
22. 權(quán)利要求21的細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而產(chǎn)生有機(jī)酸。
23. 權(quán)利要求22的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有功能性LD/Z基因盒，而 且所述細(xì)胞產(chǎn)生乳酸。
24. 權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氬酶基因的缺失或破壞。
25. 權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
26. 權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氬酶基因的缺失或破壞以及至少一個(gè) 天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
27. 權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有從丙酮酸到 乙醇的天然代謝途徑的缺失或破壞。
28. —種屬于酵母復(fù)合群的東方伊薩酵母(Z^Wc/z^7A^ oWewtofe)/ 發(fā)酵畢赤酵母(尸/c/^ /enwe"/"m)進(jìn)化枝(Kurtzman和Robnett, 1998) 或克魯維酵母屬(X/w"eraw少ce力進(jìn)化技(Kurtzman 2003)的細(xì)胞，所述 細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而缺失或破壞了從磷酸二羥丙酮到甘油的天然代 謝途徑。
29. 權(quán)利要求28的細(xì)胞，所述細(xì)胞在其可代謝的碳源存在下進(jìn)行 培養(yǎng)時(shí)，代謝以重量計(jì)2%以下碳源并由所述細(xì)胞消耗用以產(chǎn)生甘油。
30. 權(quán)利要求29的細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而產(chǎn)生有機(jī)酸。
31. 權(quán)利要求30的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有功能性丄Di/基因盒，而 且所述細(xì)胞產(chǎn)生乳酸。
32. 權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氬酶基因的缺失或破壞。
33. 權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
34. 權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述天然代謝途徑的缺失或破壞包 括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氳酶基因的缺失或破壞以及至少一個(gè) 天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
35. 權(quán)利要求31的細(xì)胞，所述細(xì)胞是馬克斯克魯維酵母)細(xì)胞。
36. 權(quán)利要求35的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有從丙酮酸到乙醇的天然代謝途徑的缺失或破壞。
37. 權(quán)利要求31的細(xì)胞，所述細(xì)胞是東方伊薩酵母細(xì)胞。
38. 權(quán)利要求37的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有/人丙酮酸到乙醇的天然代 謝途徑的缺失或破壞。
39. —種經(jīng)遺傳修飾的全基因組重復(fù)前酵母種細(xì)胞，所述細(xì)月包當(dāng) 在以下標(biāo)準(zhǔn)微好氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生小于2.0 g/L甘油A. 成分確定的含水培養(yǎng)基，其在培養(yǎng)開始時(shí)含有5g/L硫酸銨、 3g/L磷酸二氫鉀、0.5g/L硫酸鎂、痕量元素、維生素、150g/L葡萄 糖；B. 培養(yǎng)開始時(shí)pH為3.5，培養(yǎng)期間如有必要則緩沖發(fā)酵培養(yǎng)基 以防pH降至3.0以下或升至7.0以上；C. 接種酵母細(xì)胞培養(yǎng)至OD咖為1.0;D. 培養(yǎng)溫度30。C;E. 持續(xù)培養(yǎng)直到葡萄糖濃度降至10 g/L，但不超過120小時(shí)；F. 通氣和攪拌以滿足4i氧率為5.0± 1.0mmol/升/小時(shí)。
40. 權(quán)利要求39的細(xì)胞，所述細(xì)胞是半子嚢菌。
41. 權(quán)利要求39的細(xì)胞，所述細(xì)胞屬于酵母復(fù)合群的接合酵母 屬、接合有孢圓酵母屬、有孢圓酵母屬、丄ac/wwcea、克魯維酵母屬、 假嚢酵母屬或有孢漢遜酵母屬進(jìn)化枝(Kurtzman 2003)。
42. 權(quán)利要求40的細(xì)胞，所述細(xì)胞屬于克魯維酵母屬、假絲酵母 屬或伊薩酵母屬。
43. 權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)的細(xì)胞，所述細(xì)胞當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)微好氧 條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生不超過0.6g/L甘油。
44. 權(quán)利要求43的細(xì)胞，所述細(xì)胞當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)微好氧條件下進(jìn)行培 養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生至少10g/L所需發(fā)酵產(chǎn)物。
45. —種經(jīng)遺傳修飾的全基因組重復(fù)前酵母種細(xì)胞，所述經(jīng)遺傳 修飾的細(xì)胞缺乏產(chǎn)生活性甘油-3-磷酸脫氳酶的能力，而所述酶是由其 野生型酵母種細(xì)胞天然產(chǎn)生的。
46. 權(quán)利要求45的細(xì)胞，所述細(xì)胞是半子嚢菌。
47. 權(quán)利要求45的細(xì)胞，所述細(xì)胞屬于酵母復(fù)合群的接合酵母 屬、接合有孢圓酵母屬、有孢圓酵母屬、￡"c/^"cea、克魯維酵母屬、 假嚢酵母屬或有孢漢遜酵母屬進(jìn)化枝(Kurtzman 2003)。
48. 權(quán)利要求45的細(xì)胞，所述細(xì)胞屬于克魯維酵母屬、假絲酵母 屬或伊薩酵母屬。
49. 權(quán)利要求44-48中任一項(xiàng)的細(xì)胞，所述細(xì)胞還缺乏產(chǎn)生活性 甘油-3-磷酸酶的能力，而所述酶是由其酵母種細(xì)胞天然產(chǎn)生的。
50. —種全基因組重復(fù)前酵母種細(xì)胞，所述細(xì)胞缺乏產(chǎn)生活性甘 油-3-磷酸酶的能力，而所述酶是由其酵母種野生型細(xì)胞天然產(chǎn)生的。
51. 權(quán)利要求50的細(xì)胞，所述細(xì)胞是半子嚢菌。
52. 權(quán)利要求50的細(xì)胞，所述細(xì)胞屬于酵母復(fù)合群的接合酵母 屬、接合有孢圓酵母屬、有孢圓酵母屬、丄"c/w"cea、克魯維酵母屬、 假嚢酵母屬或有孢漢遜酵母屬進(jìn)化枝(Kurtzman 2003)。
53. 權(quán)利要求50的細(xì)胞，所述細(xì)胞屬于克魯維酵母屬、假絲酵母 屬或伊薩酵母屬。
54. —種經(jīng)遺傳修飾的酵母種細(xì)胞，所述細(xì)胞缺乏產(chǎn)生活性磷酸 二羥丙酮磷酸酶的能力，而所述磷酸酶是由其酵母種野生型細(xì)胞天然 產(chǎn)生的；所述細(xì)胞還缺乏產(chǎn)生活性NADlT依賴性甘油脫氫酶的能力， 而所述脫氫酶是由其酵母種野生型細(xì)胞天然產(chǎn)生的；或者所述細(xì)胞同 時(shí)缺乏產(chǎn)生這兩種酶的能力。
55. —種酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而產(chǎn)生有機(jī)酸產(chǎn)物， 所述酵母細(xì)胞還具有從磷酸二羥丙酮到甘油的天然代謝途徑的缺失 或破壞以及從丙酮酸到乙醇的天然代謝途徑的缺失或破壞。
56. 權(quán)利要求55的酵母細(xì)胞，其中從磷酸二羥丙酮到甘油的天然 代謝途徑的缺失或破壞包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸脫氫酶基因的 缺失或破壞。
57. 權(quán)利要求55的酵母細(xì)胞，其中從磷酸二羥丙酮到甘油的天然代謝途徑的缺失或破壞包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失 或破壞。
58. 權(quán)利要求57的酵母細(xì)胞，其中從磷酸二羥丙酮到甘油的天然 代謝途徑的缺失或破壞包括至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶脫氫酶基因 的缺失或破壞和至少一個(gè)天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破壞。
59. 權(quán)利要求57的酵母細(xì)胞，其中從磷酸二羥丙酮到甘油的天然 代謝途徑的缺失或破壞包括至少一個(gè)天然磷酸二羥丙酮磷酸酶基因 的缺失或破壞、天然甘油脫氫酶基因的缺失或破壞、或者天然磷酸二 羥丙酮磷酸酶基因和天然甘油脫氫酶基因兩者同時(shí)缺失或破壞。
60. 權(quán)利要求55-59中任一項(xiàng)的酵母細(xì)胞，其中所述有機(jī)酸是乳酸。
61. —種發(fā)酵方法，其中權(quán)利要求l-3、 11-12、 20-21或28-29中 任一項(xiàng)的細(xì)胞在發(fā)酵條件下、在碳源存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生所需發(fā)酵 產(chǎn)物，其中以所述細(xì)胞所消耗的碳源重量計(jì)，甘油收率小于2%。
62. 權(quán)利要求61的發(fā)酵方法，其中以所述細(xì)胞所消耗的碳源重量 計(jì)，所需發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率至少為40%。
63. 權(quán)利要求62的方法，其中以所述細(xì)胞所消耗的碳源重量計(jì)， 甘油收率小于0.5%。
64. 權(quán)利要求63的方法，其中所述所需發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。
65. —種發(fā)酵方法，其中權(quán)利要求4、 13、 22或30中任一項(xiàng)的細(xì) 胞在發(fā)酵條件下、在碳源存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生至少一種有機(jī)酸，其 中以所述細(xì)胞所消耗的碳源重量計(jì)，甘油收率小于2%。
66. 權(quán)利要求66的發(fā)酵方法，其中所述有機(jī)酸的產(chǎn)率以所述細(xì)胞 所消耗的碳源重量計(jì)至少為40%，甘油收率以所述細(xì)胞所消耗的碳源 重量計(jì)小于0.5%。
67. —種發(fā)酵方法，其中權(quán)利要求5-9、 14-18、 23-26或31-38中 任一項(xiàng)的細(xì)胞在發(fā)酵條件下、在碳源存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生乳酸，其 中以所述細(xì)胞所消耗的碳源重量計(jì)，甘油收率小于2%。
68. 權(quán)利要求67的發(fā)酵方法，其中乳酸的產(chǎn)率以所述細(xì)胞所消耗 的碳源重量計(jì)至少為40°/。，甘油收率以所述細(xì)胞所消耗的碳源重量計(jì) 小于0.5%。
69. 一種發(fā)酵方法，其中權(quán)利要求l-3、 11-12、 20-21或28-29中 任一項(xiàng)的細(xì)胞在發(fā)酵條件下、在碳源存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生乙醇，其 中以所述細(xì)胞所消耗的碳源重量計(jì)，甘油收率小于2%。
全文摘要
酵母細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾而破壞了從二羥丙酮到甘油的天然代謝途徑。在某些方面，所述酵母細(xì)胞屬于克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)或伊薩酵母屬(Issatchenkia)。在其它方面，所述酵母細(xì)胞能夠產(chǎn)生至少一種有機(jī)酸，例如乳酸。所述酵母細(xì)胞的甘油產(chǎn)量明顯低于其野生型菌株，并且所述酵母細(xì)胞的所需發(fā)酵產(chǎn)物的收率通常較高。本發(fā)明的酵母細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)通常生長良好，盡管它們的甘油產(chǎn)量下降。
文檔編號A01N63/04GK101442910SQ200780016783
公開日2009年5月27日 申請日期2007年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者A·阿里斯蒂多, B·J·拉什, B·M·豪斯, C·A·鄧頓, K·科伊武蘭塔, K·羅伯格-佩雷斯, P·蘇米寧, T·W·麥馬琳 申請人:卡吉爾公司