專利名稱：：源自野甘菊的不含有小白菊內(nèi)酯的生物活性成分及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物活性成分，該生物活性成分包括源自野甘菊(r朋^e加m;^W/2em^w)植物的鮮生物量的細(xì)胞汁的分離的生物活性組分。所述生物活性組分不含有或基本不含有(x-不飽和Y-內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)，并具有抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明還涉及所述生物活性成分的制備方法。本發(fā)明還涉及一種生物活性組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明分離的生物活性組分的混合物。
背景技術(shù)：
：野甘菊L.Schulz國Bip(另廿名C7z^waw^zewwm/aW/7ew.wm、丄e/cawf/2emww/arf/2ew/w附、MaWc<3W<3paW/7em'w附、P,d/zn/附/art7zem'ww)是~^禾中屬于菊禾斗(Compay/toe、Jsferaceae、或雛菊)的植物。已知野甘菊具有以下通用名阿爾塔米拉(altamisa)、amargosa、矢車菊(bachelor'sbuttons)、盛夏雛菊(featherfew)、featherfoil、退熱植物(febrifbgeplant)、野甘菊(feverfew)、flirtwort、grandecamomille、曼薩尼禾U亞草(manzanilla)、母菊(matricaria)、仲夏維菊(midsummerdaisy)、moederkruid、圣5馬麗亞(SantaMaria)、禾口varadika。在這些通用名中，名稱"野甘菊"是最常用的。野甘菊是一種矮多年生植物，高15-80厘米。莖直立，具溝且多毛。葉片為具有鋸齒邊緣的雙分裂的羽毛狀綠色葉片D花具有白色輻射狀花瓣和扁6平的黃色芯。打碎時(shí)，所述植物的氣味強(qiáng)烈、芳香且具有苦味。野甘菊存活了至少2000年，是巴爾干半島和高加索山脈的當(dāng)?shù)刂参?。目前，野甘菊生長在歐洲、北美、南美、北非、中國、日本和澳大利亞。適于野甘菊栽培的最適條件為？1^二6.0...6.7(最適？11二6.3)的排水良好的土壤；全日照或部分蔭蔽；在未保護(hù)的情況下，適合于美國農(nóng)業(yè)部溫度帶9-5的鍛煉。適于野甘菊的最佳氣候條件為5帶和7帶。雖然在大陸性氣候下(例如，堪薩斯州，美國；薩克其萬，加拿大)野甘菊通常被認(rèn)為是一年生植物，在有保護(hù)的情況下，野甘菊也可以種植在3帶和4帶。遠(yuǎn)古的希臘人和早期的歐洲人使用野甘菊治療發(fā)熱、發(fā)炎和腫脹，并用于驅(qū)除昆蟲以及治療叮咬和蟄傷。在過去的20年中，野甘菊在偏頭痛、關(guān)節(jié)炎、和炎性疾病的治療方面引起了相當(dāng)大的興趣。所述被利用的的部分為干的或新鮮的葉以及地上的開花部分。野甘菊的使用形式為粗制草藥、干粉、鮮葉、冷凍干燥的葉膠囊、干葉膠囊、軟凝膠膠囊、釘齊[J(tincture)、浸劑(infbsion)(例如，茶)、提取物、和功能飲料成分?？雌饋?，野甘菊全株的作用與非類固醇類抗炎藥相似。然而，野甘菊提取物的作用與腎上腺皮質(zhì)素更相4以(見，例如，F(xiàn)everfew.BotanicalMonograph,AmericanJournalofNaturalMedicine4(6):28-29(1997》。這種差異與廣譜活性引起了關(guān)于植物活性成分及其衍生物的關(guān)注和研究。已知的野甘菊中的活性化學(xué)物質(zhì)為倍半萜內(nèi)酯(總含量^1.8%)和精油(總含量^).07%)。野甘菊活性化合物的列表包括以下化合物(i)倍半萜內(nèi)酯(包括清艾菊素、卡南(canin)、lO-表畫卡南(lO-epi-canin)、chrysanthemolide、chrysanthemonin、環(huán)氧嵩淀粉(epoxyartemorin)、1(3-羥基矮艾素(1(3-hydroxyarbusculin)、3|3-羥基小白菊內(nèi)酯、8|3-羥基喘諾木烯內(nèi)酯(8p-hydroxyreynosin)、magnoliolide、小白菊內(nèi)酯、喘諾木烯內(nèi)酯、裂葉苣莢萊內(nèi)酯、開環(huán)-塔納小白菊內(nèi)酯A、tanaparthin、tanapathin-la、4a-環(huán)氧化物、7tanaparthin-l|3、4p-環(huán)氧化物))；(ii)倍半萜(包括樟腦、法呢烯、和吉瑪烯)；(iii)一貼類；(iv)黃酮醇(包括tanetin、山奈酚(kaempherol)、萬壽菊黃素、芹菜素、木犀草素、和金圣草黃素(chrysoeritol));和(v)螺酮縮醇烯醇醚polyines(spiroketalenoletherpolyines)。這些化合物最豐富的組為d-不飽和Y-內(nèi)酯；特別是小白菊內(nèi)酯，其代表了85。％的a-不飽和，內(nèi)酯。位于野甘菊葉表面的油細(xì)胞中的小白菊內(nèi)酯是最為公知的且研究最為充分的(例如，見Smith等，J.Chromatogr.,627:255(1992);和Smith,R.M.,LCGCInt.,(Jan.8-15，1996))。包括小白菊內(nèi)酯在內(nèi)的ct-不飽和Y-內(nèi)酯被認(rèn)為是與野甘菊的生物活性有關(guān)的基本成分，但同樣與由野甘菊衍生物引起的致敏反應(yīng)有關(guān)的成分相同。例如，成功地用于臨床試驗(yàn)的野甘菊制劑的野甘菊含量為0.4%-0.66%，該含量超出了能夠引發(fā)潰瘍、滲出性皮炎、以及由外部接觸引發(fā)的病理作用的濃度(例如，見，Awang，D.V.C.,"Feverfew,"Can.Pharm.J，122:266-270(1989))。同時(shí)，大約10-18%的野甘菊的使用者報(bào)告具有一些較輕的及可逆的不良反應(yīng)(例如，見，Ernst等，"Theefficacyandsafetyoffeverfew(TanacetumpartheniumL.):anupdateofasystematicreview,"PublicHealthNutrition,3(4a):509畫514(2000);Porter等，"FeverfewinSaskatchewan,"(www.agr.gov.sk.ca/DOCS/crops/special—crops/feverfew.aspfirstPick=&secondpck=&thirdpick=Production%20Information)(2004))，并且小白菊內(nèi)酯能夠?qū)@些不良反應(yīng)起作用。a-不飽和Y-內(nèi)酯觸發(fā)多種致敏反應(yīng)的能力已經(jīng)被充分地證明(例如，見，Arch.Dermatol.Forsch,251(3):235國244(1975);Arch.Dermatol.Forsch,255(2):111-121(1976);ContactDermatitis,38(4):207-208(1988);Am.J,ContactDermatol,1:49-50(1998-1999);Br.J.Dermatol,132(4)543-547(1995》。近些年，關(guān)于野甘菊提取物的制備方面作出了很大的努力，其目的是為8了所述提取物基本上不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，更具體地，基本上不含小白菊內(nèi)酯。例如，見，美國專利No.6,224,875和美國專利No.6,479,080)。應(yīng)該注意的是，"基本上不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯"和"基本上不含有小白菊內(nèi)酯"是指a-不飽和Y-內(nèi)酯或小白菊內(nèi)酯的重量含量分別低于0.1%、更優(yōu)選低于0.09%、進(jìn)一步優(yōu)選低于0.07%的提取物。由于上述含量低于具有0.4-1.8%的小白菊內(nèi)酯的野甘菊植物量中的平均含量(例如，見，MarinoL.，"Theeffectofclonalmicropropagationonparthenolidecontentintwogenotypesoffeverfew,Tanacetumparthenium，"AgroFarmTechnologiesFeverfewReport,London,Ontario(2004))，因而，需要使用多種有機(jī)溶劑以及提純的多個(gè)復(fù)雜提取步驟(包括完全脫去溶劑以及離子交換樹脂的使用)，以生成具有降低含量的a-不飽和Y-內(nèi)酯、特別是小白菊內(nèi)酯的提取物。通過包括以下步驟的方法可以從干野甘菊植物量中得到上文提及的有機(jī)溶劑提取物(a)通過丙酮、乙醇、或這些溶劑與水的混合物從所述植物的地上部分提取大量的植物材料;(b)通過碳?xì)浠衔锶軇?duì)步驟(a)中的所述材料進(jìn)行提取；(c)通過非極性溶劑對(duì)剩余的非碳?xì)浠衔锵噙M(jìn)行提取；(d)蒸發(fā)所述非極性溶劑萃取物，并使位于水-乙醇溶液中的殘留物再溶解，然后通過強(qiáng)堿樹脂對(duì)再溶解的殘留物進(jìn)行處理；(e)通過乙醇洗脫所述樹脂并將洗脫溶液去除掉；(f)通過乙醇的或水-乙醇的酸溶液對(duì)所述樹脂進(jìn)行處理，使所述溶液濃縮并通過非極性溶劑對(duì)所述結(jié)果殘留物進(jìn)行提取；(g)從步驟(f)中蒸發(fā)出非極性溶劑以形成殘留物，該殘留物被加入到從步驟(b)中碳?xì)浠衔锾崛∥锏恼舭l(fā)得到的殘留物中，以及被加入到通過步驟(c)的非極性溶劑的萃取后得到的丙酮或乙醇相中；和(h)蒸發(fā)出所述溶劑并對(duì)剩余的殘留物進(jìn)行干燥。用于多個(gè)提取步驟的優(yōu)選的溶劑包括但不限制于以下溶劑用于步驟(a)的溶劑丙酮、甲醇、乙醇或它們與水的混合物；用于步驟(b)的溶劑己垸、9正戊烷、石油醚、石腦油(ligroin);用于步驟(C)的溶劑二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯，優(yōu)選二氯甲烷；和用于步驟(f)的溶劑乙酸乙酯。根據(jù)美國專利Nos.6,224,875和6，479，080，"基本不含有小白菊內(nèi)酉旨"的提取物具有良好的藥理學(xué)性能，并且減少了引發(fā)致敏性反應(yīng)的危險(xiǎn)。然而，上述提取物是通過使用有機(jī)溶劑順序加工而分離的，這些加工屬于四種不同的類型，這限制了其與多種常規(guī)的皮膚保護(hù)制劑組分的相溶性。因此，上述提取物作為皮膚保護(hù)產(chǎn)品成分的應(yīng)用受到了一定的限制(例如，不易溶于水)。雖然描述的野甘菊提取物"基本上不含有小白菊內(nèi)酯"，但是由于允許含有殘留的小白菊內(nèi)酯，所述野甘菊提取物并不是真正地不含有小白菊內(nèi)酯的材料。小白菊內(nèi)酯本身的眾所周知的高比活性可以促成藥理性質(zhì)和提取物的殘余抗原性，特別是在高濃度使用時(shí)。重要的是，上述提取物的藥理性質(zhì)僅受到在確定條件下溶解在確定溶劑中的那些野甘菊成分的活性的限制。因此，這樣的提取物僅表示存在于活體野甘菊植物中的部分活性組分。例如，與安慰劑相比，冷凍干燥的野甘菊葉和干燥的葉證實(shí)了顯著的有益效果，但野甘菊的乙醇提取物沒有效果(例如，見，Ernst等，"Theefficacyandsafetyoffeverfew(TanacetumpartheniumL):Anupdateofasystematicreview,"PublicHealthNutrition,3(4a):509-514(2000))。關(guān)于在不同形式的野甘菊產(chǎn)品的比活性的比較，應(yīng)該注意的是完全的干燥葉被證明比其提取物更為有效，并且干燥的和鮮的野甘菊在藥理學(xué)效力及分布上顯示出顯著差異(例如，見，Barsby等，"Feverfewandvascularsmoothmuscle:Extractsfromfreshanddriedplantsshowopposingpharmacologicalprofiles,dependentuponsesquiterpenelactonecontent,"PlantaMedica，59:20-25(1993))。因此，與干燥的葉提取物相關(guān)而又不同的鮮葉提取物具有(a)在濃度相關(guān)的方法中的電壓依從性鉀電流的降低的鈍化；(b)血栓素B2和白細(xì)胞三烯B4的白細(xì)胞產(chǎn)物的劑量依從性抑制；禾口(c)對(duì)退黑素、血栓素、和10降低的乙酰膽堿誘導(dǎo)的舒張的抑制的肌肉反應(yīng)。有趣的是，使野甘菊產(chǎn)物的效能最大化的強(qiáng)烈愿望導(dǎo)致了近期含有受植物的加工過程影響最小的所有植物成分的產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。這些產(chǎn)物為冷凍干燥的野甘菊葉制劑，雖然這樣的材料適用于受限制的應(yīng)用，但皮膚保護(hù)并不在其中。此外，野甘菊提取物的活性和位于這些提取物中的小白菊內(nèi)酯水平取決于溶劑和所用的提取方法的選擇(例如，見，Kaplan，M,，"ComparisonofTurkJ.Chem,26:473-480(2002))。因此，通過溶劑萃取和超臨界流體的萃取而得到的材料不同。例如，與氯仿提取物相比，超臨界流體co2提取物的小白菊內(nèi)酯的含量更高，并且在后續(xù)的丙酮提取物中更高。根據(jù)植物材料的來源以及栽培和收獲條件，野甘菊的組成顯著不同。業(yè)己發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯含量的巨大改變。例如，美國生長的植物含有的小白菊內(nèi)酯濃度為在英國和法國生長的植物的小白菊內(nèi)酯濃度的20%。與灌溉的野甘菊相比，干燥土地的野甘菊的小白菊內(nèi)酯含量更高。發(fā)現(xiàn)，用單一的水分脅迫事件處理野甘菊能夠提高小白菊內(nèi)酯的含量(Fonseca等，"Parthenolideandabscisicacidsynthesisinfeverfewareassociatedbutenvironmentalfactorsaffectthemdissimilarly,"J.PlantPhysiology,162，:485-494(2005))。花所含的小白菊內(nèi)酯的水平最高，莖所含的小白菊內(nèi)酯的水平最低。如果延遲收獲，則花中小白菊內(nèi)酯的含量升高，莖和葉中的小白菊內(nèi)酯的含量降低。下午收獲的野甘菊中小白菊內(nèi)酯的含量顯著高于早晨收獲的野甘菊中小白菊內(nèi)酯的含量，并且，野甘菊暴露在紫外光下導(dǎo)致了小白菊內(nèi)酯含量的顯著降低。應(yīng)該注意的是，在野甘菊衍生物中的小白菊內(nèi)酯的含量的廣泛的改變可以是兩種主要因素栽培條件和加工方法，相互作用的本質(zhì)結(jié)果。不過，美國專利Nos.6,224,875和6,479,080并沒有提供與"基本不含有小白菊內(nèi)酯"的野甘菊提取物的重復(fù)性相關(guān)的任何信息。然而，如上文所描述的，原料的巨大改變可以顯著地影響提取物的性質(zhì)。因此，存在很多遺傳的、地理的、氣候的、和技術(shù)的因素，這些因素導(dǎo)致了較差的重復(fù)性以及使其質(zhì)量低于常規(guī)野甘菊產(chǎn)物和提取物的最佳質(zhì)量(例如，見，Hepinstall等,"Parthenolidecontentandbioactivityoffeverfew(Tanacetumparthenium(L)Schultz-Bip.).Estimationofcommercialandauthenticatedfeverfewproducts,"J.Pharm.Pharmacol.,44:391-395(1992);Draves,A.H.andS.E.Walker,"ParthenolideContentofCanadianCommericalFeverfewPreparations:LabelClaimsareMisleadinginMostCases,"CanadianPharmJ，136(10):23-30(Dec.2003/Jan.2004))，這些因素使野甘菊衍生物在草藥和皮膚保護(hù)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用產(chǎn)生了嚴(yán)重的問題。因此，需要一種高重復(fù)性的和不含有小白菊內(nèi)酯的野甘菊衍生物的制備方法，所述野甘菊衍生物具有廣譜的所需要的生物活性，這些活性不僅僅限于與確定的溶劑有關(guān)的活性，S卩，不受到常規(guī)化學(xué)提取的限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及生物活性成分，該成分含有源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁的分離的生物活性組分。所述生物活性組分不含有或基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)。此外，所述生物活性組分具有抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明還涉及一種生物活性組分的分離方法，該生物活性組分源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁，并且該生物活性組分基本不含有a-不飽和內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)。該方法包括提供野甘菊植物的鮮生物量。在能夠有效地生成細(xì)胞汁上清液以及膜組分的條件下對(duì)鮮生物量進(jìn)行加工。在能夠有效地生成第一細(xì)胞汁漿上清液以及細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物的條件下對(duì)細(xì)胞汁上清液進(jìn)行處理。然后，對(duì)細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物進(jìn)行分離，其中，所述細(xì)胞質(zhì)12沉淀物為生物活性組分，該生物活性組分基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯。本發(fā)明還涉及了一種生物活性成分，該生物活性成分包括根據(jù)此方法得到的細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物，并且具有抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明還涉及一種制備穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分的方法，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分為細(xì)胞活性組分且源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)。該方法包括在能夠有效地生成第二細(xì)胞汁漿上清液的條件下使第一細(xì)胞汁槳上清液澄清。在能夠有效地生成穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分的條件下將穩(wěn)定劑與所述第二細(xì)胞汁漿上清液混合。所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，該生物活性組分不含有a—不飽和Y-內(nèi)酯。本發(fā)明還涉及一種生物活性成分，該生物活性成分包括由此方法得到的穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分，該組分具有抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明還涉及一種制備穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分的方法，所述濃縮的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，且該組分源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁，所述生物活性組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)。該方法包括在能夠有效地生成濃縮的細(xì)胞汁漿上清液的條件下，使所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分濃縮。在能夠有效地生成穩(wěn)定的濃縮細(xì)胞汁漿組分的條件下，將穩(wěn)定劑與所述濃縮的細(xì)胞汁漿上清液混合。所述穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，該生物活性組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯。本發(fā)明還涉及一種生物活性成分，該生物活性成分包括由此方法得到的穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分，該組分具有抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明還涉及一種生物活性組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的分離的生物活性組分的混合物。本發(fā)明是有益的，其提供了一種制備具有高重復(fù)性且不含有小白菊內(nèi)酯或基本不含有小白菊內(nèi)酯的野甘菊衍生物的方法，該野甘菊衍生物具有廣譜13的所需生物活性(例如，抗炎性和抗氧化活性)。本發(fā)明強(qiáng)于現(xiàn)有技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的方法不需要使用粗糙的有機(jī)溶劑來分離本發(fā)明的生物活性組分。在哺乳動(dòng)物(包括人類)的多種局部和經(jīng)口應(yīng)用中，本發(fā)明的生物活性組分用作活性成分。這些制劑可以用于抑制皮膚組織的炎性活性以及用于保護(hù)皮膚組織免受紫外光誘導(dǎo)的傷害。本發(fā)明的活性成分還能夠用于使哺乳動(dòng)物皮膚組織的皮膚病恢復(fù)正常。圖l為說明了制備本發(fā)明的生物活性成分的過程的一個(gè)實(shí)施方式的示意圖2為用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的方法的野甘菊鮮生物量的高壓液相色譜("HPLC")的色譜圖；下箭頭表示小白菊內(nèi)酯的峰；圖3為通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的方法分離得到的富含纖維的材料的HPLC色譜圖；下箭頭表示小白菊內(nèi)酯的峰；圖4為通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的方法分離得到的沉淀物I的HPLC色譜圖；下箭頭表示小白菊內(nèi)酯的峰；圖5為通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的方法分離得到的沉淀物n(生物活性成分A)的HPLC色譜圖；下箭頭表示小白菊內(nèi)酯的峰；圖6為通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的方法分離得到的最終上清液(生物活性成分B)的HPLC色譜圖7為通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的方法分離得到的濃縮的最終上清液(生物活性成分C)的HPLC色譜圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及生物活性成分，該成分含有源自野甘菊植物的鮮生物量的14生物活性組分不含有或基本不含有cx-不飽和Y-內(nèi)酯；更確地，所述生物活性組分不含有或基本不含有小白菊內(nèi)酯。此處所用的術(shù)語"生物活性組分"和"生物活性成分"可互換使用。通過閱讀本發(fā)明的說明書，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解到，互換使用上述術(shù)語是合適的。本發(fā)明的生物活性成分具有良好的活性，包括但不限制于抗炎性和抗氧化活性。正如此處所用的，術(shù)語"野甘菊"為"7b"flce^w;aW/7em'im2"植物的通用名稱。正如此處所用的，術(shù)語"基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯"和"基本不含有小白菊內(nèi)酯"是指01-不飽和？內(nèi)酯或小白菊內(nèi)酯的重量含量分別為^).01%的野甘菊生物活性成分或生物活性組分，但所述重量含量仍然位于使用本領(lǐng)域公知的高壓液相色譜("HPLC")分析法對(duì)a-不飽和Y-內(nèi)酯或小白菊內(nèi)酯的檢測極限的范圍之內(nèi)。正如此處所用的，除非另有說明，所用的涉及本發(fā)明的生物活性成分/組分中的a-不飽和y-內(nèi)酯或小白菊內(nèi)酯的重量含量或濃度的百分?jǐn)?shù)是指重量百分比(通常簡寫為"重量％"或短語"重量百分比")。正如此處所用的，術(shù)語"不含有a-不飽和Y-內(nèi)酉旨"和"不含有小白菊內(nèi)酯"是指a-不飽和Y-內(nèi)酯或小白菊內(nèi)酯的含量分別低于使用本領(lǐng)域公知的高壓液相色譜("HPLC")分析法對(duì)a-不飽和Y-內(nèi)酯或小白菊內(nèi)酯的檢測極限的范圍之下的野甘菊生物活性成分或生物活性組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述不含有小白菊內(nèi)酯的生物活性成分/組分的小白菊內(nèi)酯的含量小于0.00007重量%。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的"不含有(x-不飽和Y-內(nèi)酯"或"不含有小白菊內(nèi)酯"的生物活性成分/生物活性組分分別表征為"完全不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯"或"完全不含有小白菊內(nèi)酯"。用于檢測小白菊內(nèi)酯的量的適宜的方法在實(shí)施例6(下文中沖進(jìn)行了進(jìn)一步的描述。簡要地說，用于檢測小白菊內(nèi)酯的方法包括在225nm處進(jìn)行檢15測，在225nm處小白菊內(nèi)酯的含量可以通過使用多點(diǎn)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測，所述多點(diǎn)校準(zhǔn)曲線具有范圍從30嗎-900嗎小白菊內(nèi)酯/克樣品的六個(gè)小白菊內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis，MO)。在一個(gè)實(shí)施方式中，小白菊內(nèi)酯在這些條件下的檢測極限為0.7嗎小白菊內(nèi)酯/ml的樣品(即，0.00007%)。約30嗎小白菊內(nèi)酉旨/克樣品(例如，0.003%)可以通過使用這些條件的組合來進(jìn)行定量。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物活性成分相當(dāng)于此處所描述的"細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物"。參考圖l描述的過程示意圖，此實(shí)施方式包括確定"沉淀物1136"所屬的生物活性成分的類別。此外，如實(shí)施例部分(下文中)所描述的，此實(shí)施方式包括確定"生物活性成分A"所屬的生物活性成分的類別。正如實(shí)施例中所表示的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的生物活性成分A顯示出含有約0.01重量Q/^的小白菊內(nèi)酯，從而確定基本不含有小白菊內(nèi)酯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與"細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物"相對(duì)應(yīng)的生物活性成分具有與圖5等所示的分布相應(yīng)的HPLC分布。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明生物活性成分與此處所定義的"穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分"相對(duì)應(yīng)?？紤]到實(shí)施例部分(下文中)和如圖1所示的過程的示意圖，此實(shí)施方式包括確定"生物活性成分B"和"生物活性成分B60"所屬的生物活性成分的類別。正如在實(shí)施例中所表示的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的生物活性成分B顯示含有低于0.00007重量％的小白菊內(nèi)酯，從而被確定不含有小白菊內(nèi)酯。換言之，發(fā)現(xiàn)此實(shí)施方式中的生物活性成分的小白菊內(nèi)酯的含量低于用于檢測小白菊內(nèi)酯的分析步驟的檢測極限(見，實(shí)施例6，"用于檢測小白菊內(nèi)酯含量的方法")。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與"穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分"相對(duì)應(yīng)的生物活性成分具有與如圖6等所示的分布相對(duì)應(yīng)的HPLC分布。此實(shí)施方式的生物活性成分易溶于水。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物活性成分于此處所定義的"穩(wěn)定的16濃縮的細(xì)胞汁漿組分"相對(duì)應(yīng)。參考實(shí)施例部分(下文中)和圖1所描述的過程的示意圖，此實(shí)施方式包括確定"生物活性成分C"和"生物活性成分C80"所屬的生物活性成分的類別。正如在實(shí)施例中所表示的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的生物活性成分C顯示含有低于0.00007重量％的小白菊內(nèi)酯，從而被確定為不含有小白菊內(nèi)酯。換言之，發(fā)現(xiàn)此實(shí)施方式中的生物活性成分的小白菊內(nèi)酯的含量低于用于檢測小白菊內(nèi)酯的分析步驟的檢測極限(見，實(shí)施例6,下文中)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與"穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁槳組分"相對(duì)應(yīng)的生物活性成分具有與如圖7等所示的分布相對(duì)應(yīng)的HPLC分布。此實(shí)施方式的生物活性成分易溶于水。本發(fā)明的生物活性成分具有抗炎性和抗氧化活性。關(guān)于抗炎性，該活性可以通過使用彈性蛋白酶抑制測定來檢測(例如，見，實(shí)施例6,"用于檢測彈性蛋白酶抑制活性的方法")。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物活性成分的抗炎性表示為IC5()值，該值的范圍為約0.1%(體積/體積)至約2.0%(體積/體積)；特別地，為約0.3%(體積/體積)至約1.7%(體積/體積)。正如此處用于對(duì)抗炎性的限定，術(shù)語"ICM)值"是指使彈性蛋白酶的酶促反應(yīng)的速度降低50%所需的生物活性成分的濃度。如圖4、7、10、和13所示，鑒定的生物成分的抗炎性(ICs。值)可以以體積(例如，微升，pL)來表示，然后根據(jù)每體積的體積(體積/體積)濃度再進(jìn)行計(jì)算。如表4、7、10、和13所示的抗炎性數(shù)據(jù)是是基于3.0mL的反應(yīng)混合物的體積得到的。關(guān)于抗氧化活性，該活性可以通過清除活性氧的檢測來進(jìn)行檢測(例如，見，實(shí)施例6，"用于檢測超氧化物清除活性的方法")。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物活性成分的抗氧化活性表示為IC5Q值，該值的范圍為約0.007%(體積/體積)至約1.0%(體積/體積)；特別地，為約0.067%(體積/體積)至約0.27%(體積/體積)。正如此處用于對(duì)抗氧化活性的限定，術(shù)語"IC5o值"是指使細(xì)胞色素C還原反應(yīng)的速度降低50%所需的生物活性成分的濃度。17如圖4、7、10、和13所示，鑒定的生物成分的抗氧化活性(ICs。值)可以以體積(例如，微升，pL)來表示，然后根據(jù)每體積的體積(體積/體積)濃度再進(jìn)行計(jì)算。如表4、7、10、和13所示的抗炎性數(shù)據(jù)是基于3.0mL的反應(yīng)混合物的體積得到的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性成分可以用于具有或不具有穩(wěn)定劑的局部應(yīng)用。適合的穩(wěn)定劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的穩(wěn)定劑，包括但不限制于乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物基質(zhì)、和它們的混合物。正如此處所用的，"局部應(yīng)用"通常是指例如使用手或施用器如擦布(wipe)直接將本發(fā)明的生物活性成分或含有這些生物活性成分的制劑放置或涂敷在外部皮膚上。所述生物活性成分(以及含有它們的制劑)為"化妝品可接受的"。正如此處所用的，術(shù)語"化妝品可接受的"是指適用于與哺乳動(dòng)物組織(例如，人類皮膚)接觸，而不具有過度毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激作用、過敏反應(yīng)等且具有合理的效益風(fēng)險(xiǎn)比的生物成分、制劑、化妝品活性劑、或惰性成分。所述生物活性成分(以及含有它們的制劑)用于人體局部或口服應(yīng)用，并且可以以"安全和有效量"來施用。正如此處所用的，術(shù)語"安全和有效量"是指在待調(diào)整的或治療的條件下能夠顯著地誘導(dǎo)積極改變但足夠低以避免嚴(yán)重的副作用的生物活性成分或制劑的量。所述生物活性組分或含有生物活性組分的制劑的安全和有效量將根據(jù)待處理的特定條件、最終使用者的年齡和身體條件、待治療的/預(yù)防的狀況的嚴(yán)重程度、治療的持續(xù)時(shí)間、同步治療的性質(zhì)、使用的具體的生物活性成分或制劑、利用的具體的化妝品可接受的局部載體等因素而發(fā)生改變。本發(fā)明的含有所述生物活性成分的制劑可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行制備。本發(fā)明還涉及了一種分離生物活性組分的方法，所述生物活性組分源自18本發(fā)明還涉及一種生物活性組分的分離方法，該生物活性組分源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁。該方法包括提供野甘菊植物的鮮生物量。適宜的鮮生物量可以包括野甘菊植物的任何部位，例如，包括其葉、花、枝條、莖、和根。在能夠有效地生成細(xì)胞汁上清液以及膜組分的條件下對(duì)鮮生物量進(jìn)行加工。在能夠有效地生成第一細(xì)胞汁漿上清液以及細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物的條件下對(duì)細(xì)胞汁上清液進(jìn)行處理。在一個(gè)實(shí)施方式中，"細(xì)胞質(zhì)部分沉淀物"與生物活性成分A相對(duì)應(yīng)(見圖l和實(shí)施例部分)。然后，對(duì)細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物進(jìn)行分離，其中，所述細(xì)胞質(zhì)沉淀物為生物活性組分，該生物活性組分基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，基本不含有小白菊內(nèi)酯。在能夠有效地生成細(xì)胞汁上清液以及膜組分的條件下對(duì)鮮生物量進(jìn)行加工的一個(gè)實(shí)施方式如以下步驟所示(i)將鮮生物量分離成細(xì)胞汁漿組分和富含纖維的材料；(ii)使所述細(xì)胞汁漿組分澄清，以得到澄清的細(xì)胞汁漿組分；和(iii)將所述澄清的細(xì)胞汁漿組分分離成細(xì)胞汁漿上清液和膜組分。本發(fā)明還涉及一種穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分的制備方法，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分且源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁，所述生物活性組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯(例如，不含有小白菊內(nèi)酯)。該方法包括在能夠有效地生成第二細(xì)胞汁漿上清液的條件下使第一細(xì)胞汁上清液澄清。在能夠有效地生成穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分的條件下將穩(wěn)定劑(在此描述的適合實(shí)例)與所述第二細(xì)胞汁漿上清液混合。所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，該生物活性組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酉旨，特別地，不含有小白菊內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，"穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分"與生物活性成分B(見圖1和實(shí)施例部分)相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明還涉及一種制備穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分的方法，所述穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，該生物活性組分源自野甘菊植物的鮮生物量，并且該生物活性組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不含有小白19菊內(nèi)酯。該方法包括在能夠有效地生成濃縮的細(xì)胞汁漿上清液的條件下，使所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分濃縮(如上所述)。在能夠有效地生成穩(wěn)定的濃縮細(xì)胞汁漿上清液組分的條件下，將穩(wěn)定劑(在此描述的適合的例子)與所述濃縮的細(xì)胞汁漿上清液混合。所述穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿上清液組分為生物活性組分，該生物活性組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯；特別地，不含有小白菊內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述"穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分"與生物活性成分C相對(duì)應(yīng)(見圖1和實(shí)施例部分)。本發(fā)明還涉及由上述方法制得的生物活性成分，該生物活性成分包括，例如，含有以下組分的生物活性成分(i)由本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物；(ii)由本發(fā)明的方法得到的穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分；和(iii)由本發(fā)明的方法得到的穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分。這些生物活性組分具有抗炎性和抗氧化活性。通過實(shí)施例，用于制備本發(fā)明的生物活性成分(例如，生物活性成分A、生物活性成分B、和生物活性成分C)的全部過程的一個(gè)實(shí)施方式如圖1示意性地表示。此過程的步驟細(xì)節(jié)在此詳述以及實(shí)施例中有進(jìn)一步的描述。如圖l所描述的，提供了新鮮的野甘菊10(即，野甘菊的鮮生物量)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在此段落中描述的步驟與描述的為"提供野甘菊植物的鮮生物量"的步驟相對(duì)應(yīng)。在能夠有效地分離新鮮的野甘菊IO成為細(xì)胞汁16和富含纖維的材料14的條件下，將新鮮的野甘菊10碾碎、浸漬、和壓搾12。然后，在能夠有效地生成澄清的細(xì)胞汁20的條件下，使細(xì)胞汁16澄清18。在能夠有效地生成沉淀物I26(膜組分)和上清液130(細(xì)胞汁上清液)的條件下，對(duì)澄清的細(xì)胞汁20進(jìn)行pH調(diào)節(jié)/微波處理22，然后在有效地生成沉淀物126(膜組分)和上清液130(細(xì)胞汁上清液)的條件下進(jìn)行冷卻/離心24。此步驟有效地將大量的cx-不飽和7-內(nèi)酯(特別地，為小白菊內(nèi)酯)分隔成沉淀物I26，其還包括在澄清20的細(xì)胞汁20中發(fā)現(xiàn)的很多膜材料。正如用于描述沉淀物126中所含的ot-不飽和Y-內(nèi)酯(特別地，為小白菊內(nèi)酯)的量，術(shù)語"大量"是指a-不飽和Y-內(nèi)酯(特別地，為小白菊內(nèi)酯)的含量超過0.01重量％和/或該含量能夠比得上新鮮的野甘菊中的cx-不飽和Y-內(nèi)酯(特別地，為小白菊內(nèi)酯)的含量。因此，由此步驟得到的上清液I30包括至少基本不含有小白菊內(nèi)酯的細(xì)胞汁，特別地，包括至少基本不含有小白菊內(nèi)酯的細(xì)胞汁。在一個(gè)實(shí)施方式中，此段中描述的步驟與被定義為"在能夠有效地生成細(xì)胞汁上清液和膜組分的條件下對(duì)鮮生物量進(jìn)行處理"的步驟相對(duì)應(yīng)。對(duì)上清液130進(jìn)行等電沉淀32，此后在能夠有效地生成上清液H40(例如，第一細(xì)胞汁漿上清液)和沉淀物II36(例如，細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物)的條件下，進(jìn)行離心34。在一個(gè)實(shí)施方式中，在此段描述的步驟與被定義為"在能夠有效地生成第一細(xì)胞汁漿上清液和細(xì)胞質(zhì)部分沉淀物的條件下對(duì)細(xì)胞汁上清液進(jìn)行處理"的步驟相對(duì)應(yīng)。然后分離沉淀物1136。在一個(gè)實(shí)施方式中，沉淀物H36與生物活性成分A相對(duì)應(yīng)，并且其基本不含有a-不飽和，內(nèi)酯，特別地，基本不含有小白菊內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，在此段中描述的步驟與被定義為"對(duì)所述細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物進(jìn)行分離"的步驟相對(duì)應(yīng)。沉淀物II36(生物活性成分A)還具有多種優(yōu)良的生物活性，包括但不限制于抗炎性和抗氧化活性。對(duì)上清液1140(例如，第一細(xì)胞汁漿上清液)進(jìn)行pH調(diào)節(jié)42，此后，在能夠有效地生成最終上清液50(在一個(gè)實(shí)施方式中還指"第二細(xì)胞汁漿上清液")的條件下使其澄清44。然后在能夠有效地生成生物活性成分B60(在一個(gè)實(shí)施方式中還指"穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分")的條件下使最終上清液50與穩(wěn)定劑52混合。生物活性成分B60基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，基本不含有小白菊內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，在此段中描述的步驟與被進(jìn)行以下定義的步驟相對(duì)應(yīng)(i)"在能夠有效地生成第二細(xì)胞汁漿上清液的條件下使21在能夠有效地生成穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分的條件下將穩(wěn)定劑與第二細(xì)胞汁漿上清液混合"。生物活性成分B60還具有多種優(yōu)良的生物活性，包括但不限制于抗炎性和抗氧化活性。在能夠有效地使生物活性成分B60濃縮以生成濃縮的最終上清液70(在一個(gè)實(shí)施方式中還指"濃縮的細(xì)胞汁漿上清液")的條件下，使生物活性成分B60蒸發(fā)62。在一個(gè)實(shí)施方式中，此步驟與被定義為"在能夠有效地生成濃縮的細(xì)胞汁漿上清液的條件下使所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分濃縮"的步驟相對(duì)應(yīng)。然后，在能夠有效地生成生物活性成分C80(在一個(gè)實(shí)施方式中還指"穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分")的條件下使?jié)饪s的最終上清液70與穩(wěn)定劑72混合。在一個(gè)實(shí)施方式中，此步驟與步驟"在能夠有效地生成穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分的條件下將穩(wěn)定劑與濃縮的細(xì)胞汁漿上清液混合"的步驟相對(duì)應(yīng)。生物活性成分C80不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不含有小白菊內(nèi)酯。生物活性成分C80還具有多種優(yōu)良的生物活性，包括但不限制于抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明的生物活性成分包括所有如圖l所描述的源自細(xì)胞汁的生物活性成分，即，如以下所表示的生物活性成分(i)上清液130;(ii)上清液II40;(iii)沉淀物II36(生物活性成分A);(iv)最終上清液50;(v)生物活性成分B60;(vi)濃縮的最終上清液70;和(vii)生物活性成分C80。此段中的所列的生物活性組分各自不含有或基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不含有或基本不含有小白菊內(nèi)酯。此外，此段中所列的生物活性組分各自具有抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明還涉及生物活性組合物，該組合物包括源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁的一種或多種分離的生物活性組分。適合的生物活性組分包括但不限制于任何本發(fā)明的生物活性組分。特別地，所述生物活性組分各自不含有或基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不含有或基本不含有小白菊內(nèi)22酯。此外，適合的生物活性組合物具有抗炎性和抗氧化活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性組分可以包括但不限制于如圖l所描述的一種或多種生物活性組分/生物活性成分，即，上清液I30、上清液II40、沉淀物II36(生物活性成分A)、最終上清液50、生物活性成分B60、濃縮的最終上清液70、和/或生物活性成分C80。本發(fā)明的生物活性組合物不含有或基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不含有或基本不含有小白菊內(nèi)酯。所述生物活性組合物還具有抗炎性和抗氧化活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性組合物包括穩(wěn)定劑。結(jié)合一種或多種本發(fā)明的生物活性組分以生成本發(fā)明的生物活性組合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并作為本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的生物活性成分和生物活性組合物可以用于多種用于哺乳動(dòng)物(包括人類)的方法。此外，由于生物活性成分中的小白菊內(nèi)酯的濃度較低(或完全不存在小白菊內(nèi)酯)，使用生物活性成分的方法可以包括不僅對(duì)成年人安全的應(yīng)用，還包括對(duì)各種年齡的孩子的應(yīng)用(包括但不限制于嬰兒、初學(xué)走路的孩子、未發(fā)育的孩子、和青少年)。此外，本發(fā)明的生物活性成分的實(shí)施方式在下文中進(jìn)行了概述。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性成分從各種生長階段的野甘菊的鮮生物量中得到，包括但不限制于，提供最高產(chǎn)量的時(shí)期從盛花早期(10%開花)至盛花期(100%開花)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性成分可以從新鮮的植物量中得到，所述新鮮的植物量可以從培養(yǎng)第一年和/或隨后的生長年代中的植物得到。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性成分可以從新鮮的植物量中得到，所述新鮮的植物量為大地種植的和/或溫室種植的和/或人工氣候室種植的和/或組織培養(yǎng)的和/或愈傷組織培養(yǎng)的。適合的生物活性成分可以包括但不限制于任何的植物細(xì)胞組分，該植物細(xì)胞組分不與a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不與小白菊內(nèi)酯結(jié)合和/或不與23其具有親和力。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合的生物活性成分包括但不限制于任何的植物細(xì)胞組分，該植物細(xì)胞組分具有抗炎性能且不與a-不飽和，內(nèi)酯，特別地，不與小白菊內(nèi)酯結(jié)合和/或不與其具有親和力。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述適合的生物活性成分可以包括但不限制于任何的植物細(xì)胞組分，在人體組織的炎癥應(yīng)答過程中，所述植物細(xì)胞組分具有抗蛋白酶釋放的抑制活性。上述蛋白酶可以包括但不限制于人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶，其是蛋白酶中多種破壞性酶中的一種。由于彈性蛋白酶能夠降解人體組織的細(xì)胞外基質(zhì)的多種組分，彈性蛋白酶的抑制劑被認(rèn)為具有能夠減少與炎癥條件的巨大改變相關(guān)的組織損傷的重要生物活性能力。雖然純化的小白菊內(nèi)酯本身證明了確定的抗彈性蛋白酶活性，但意外地發(fā)現(xiàn)，基本不含有小白菊內(nèi)酯的本發(fā)明生物活性成分和完全不含有小白菊內(nèi)酯的本發(fā)明生物獲悉國內(nèi)成分具有更高的彈性蛋白酶抑制活性，比純化的小白菊內(nèi)酯的生物活性高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。不與(X-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不與小白菊內(nèi)酯結(jié)合和/或不與其具有親和力的本發(fā)明的生物活性成分具有抗彈性蛋白酶的活性，該活性優(yōu)于純的小白菊內(nèi)酯的活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合的本發(fā)明的生物活性成分包括但不限制于具有彈性蛋白酶抑制性質(zhì)的且不與a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不與小白菊內(nèi)酯結(jié)合和/或不與其具有親和力的任何的植物細(xì)胞組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合的本發(fā)明的生物活性成分包括但不限制于具有抗氧化性質(zhì)的且不與a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不與小白菊內(nèi)酯結(jié)合和/或不與其具有親和力的任何的植物細(xì)胞組分。本發(fā)明還涉及生物活性成分，該生物活性成分(i)基本或完全不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯；以及具有皮膚保護(hù)(包括局部和口服應(yīng)24用)所期望的(ii)抗炎性；和(iii)抗氧化性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合的生物活性成分可以包括但不限制于具有抗炎性和抗氧化性質(zhì)且不與a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不與小白菊內(nèi)酯結(jié)合和/或不與其具有親和力的任何的植物細(xì)胞組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合的生物活性組分可以包括但不限制于具有彈性蛋白酶抑制性和抗氧化性質(zhì)且不與a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別地，不與小白菊內(nèi)酯結(jié)合和/或不與其具有親和力的任何的植物細(xì)胞組分。本發(fā)明還涉及一種用于從野甘菊的鮮生物量中分離用于皮膚保護(hù)的生物活性成分的方法，其中，所述生物活性成分①基本或完全不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯；具有(ii)抗炎性和/或(iii)抗氧化性質(zhì)。本發(fā)明還涉及一種用于從野甘菊的鮮生物量得到的細(xì)胞汁中分離用于皮膚保護(hù)的生物活性成分的方法，其中，所述生物活性成分(i)基本或完全不含有oc-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯；具有(ii)彈性蛋白酶抑制性質(zhì)和/或(iii)抗氧化性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括野甘菊的鮮生物量。然后，將鮮生物量分離成細(xì)胞汁和富含纖維的材料。應(yīng)該注意的是，根據(jù)野甘菊栽培的條件、生長的年齡、和具體的收獲方式，植物生物量中干物質(zhì)含量會(huì)發(fā)生很大的改變，并將影響細(xì)胞汁性質(zhì)的一致性以及源自細(xì)胞汁的生物活性成分的重復(fù)性。本發(fā)明考慮了細(xì)胞汁性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化，以改善生物活性成分的重復(fù)性。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過用于野甘菊栽培和收獲的一致性條件使細(xì)胞汁性能的標(biāo)準(zhǔn)化改善。在另一個(gè)實(shí)施方式中，新鮮野甘菊的碾碎、浸漬、和壓榨體系的適當(dāng)調(diào)整，能夠得到干物質(zhì)含量在相對(duì)較窄的范圍內(nèi)(例如，7.0±1.6%)改變的細(xì)胞汁。例如，如果由于環(huán)境的影響導(dǎo)致植物生物量中干物質(zhì)含量減少，則野甘25菊的精細(xì)研磨和高壓能夠提高細(xì)胞汁中干物質(zhì)的含量，從而改善了它的重復(fù)性。如果植物生物量中干物質(zhì)的含量增加，則可以使用過程研磨和低壓。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在無需不理想的增加溫度的情況下，提供了細(xì)胞汁的標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)當(dāng)指出，上述調(diào)整指導(dǎo)了細(xì)胞汁的重復(fù)性，并且與新鮮野甘菊的干物質(zhì)基或具有富含纖維的材料的干物質(zhì)基相比，不必降低細(xì)胞汁中(X-不飽和，內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯的含量。雖然小白菊內(nèi)酯明顯集中在位于野甘菊葉表面的油細(xì)胞中(例如，見，Smith等，J.Chromatogr"627:255(1992);和Smith,R.M.,LCGCInt.,Jan.8-15，1996，并在此通過引用的方式將其全文并入本文)，但意外地發(fā)現(xiàn)，所述小白菊內(nèi)酯并不主要集中在富含纖維的材料中，而分散于上述材料和細(xì)胞汁之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，使富含纖維的材料干燥或者在冷凍條件下進(jìn)行儲(chǔ)存。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將含有小白菊內(nèi)酯的富含纖維的材料應(yīng)用在本領(lǐng)域通常用的野甘菊衍生物的常規(guī)應(yīng)用中。新鮮的野甘菊細(xì)胞汁為墨綠色的相對(duì)穩(wěn)定的膠體分散體系。這種顏色取決于葉綠體及其碎片，它們分散在褐色的且富含其它細(xì)胞質(zhì)組分的連續(xù)的細(xì)胞汁相中。意外地發(fā)現(xiàn)，在膠體分散體系中，a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯與葉綠體及其碎片具有很強(qiáng)的結(jié)合力和/或親和力。在一個(gè)實(shí)施方式中，從細(xì)胞汁中去除葉綠體及其碎片，得到連續(xù)的細(xì)胞汁相，該相基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯。細(xì)胞汁中這些不需要的化合物的去除可以通過以下不同的處理方法來實(shí)現(xiàn)，包括但不限制于pH調(diào)節(jié)、熱處理、微波輻射、離心、過濾、超濾、和它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，新鮮的野甘菊細(xì)胞汁被分成由葉綠體組成的墨綠色的糊狀沉淀物和褐色的上清液，該上清液基本不含有(x-不飽和Y-內(nèi)酯，特別26在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過中速或高速離心(S15,000g)來實(shí)現(xiàn)上述分離。結(jié)果，所有的葉綠體及其碎片均被富集至沉淀物(下文稱沉淀物I)中，并且分離出的上清液(下文稱上清液I)完全不含有葉綠素。結(jié)果，膠體分散系的幾乎所有的小白菊內(nèi)酯池被富集至沉淀物I中，因此，上清液I的小白菊內(nèi)酯的含量比最初的細(xì)胞汁低^20倍(例如，0.03%)，即，本發(fā)明的上述上清液I可被確定為基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯(與美國專利Nos.6,224,875和6,479,080中描述的優(yōu)選的實(shí)施方式的野甘菊提取物的水平相比，本發(fā)明的上清液具有更低的小白菊內(nèi)酯的殘留含量，上述兩篇專利通過引用的方式將其全文并入本文)。特別在較大的工業(yè)規(guī)模上，中速以及高速離心存在技術(shù)上和/或經(jīng)濟(jì)上的限制。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)新鮮的野甘菊細(xì)胞汁進(jìn)行處理以降低葉綠體及其碎片的穩(wěn)定性，然后通過低速離心(^3,000g)使失穩(wěn)的細(xì)胞汁有效地分離。有效的分離標(biāo)準(zhǔn)是在上清液I的光譜中不出現(xiàn)典型的葉綠素峰值。本發(fā)明包括多個(gè)處理步驟，以減少野甘菊細(xì)胞汁葉綠素及其碎片的起始凝結(jié)物的相穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用凍融處理(S1個(gè)循環(huán))、熱處理40°C)、pH調(diào)節(jié)(pH=3.0...4.0)、和/或它們的組合，使細(xì)胞汁的穩(wěn)定性降低。野甘菊細(xì)胞汁的上述處理以及低速離心能夠得到含有6.5-7.3%的干物質(zhì)和0.01-0.035%的小白菊內(nèi)酯的細(xì)胞汁上清液1。葉綠體及其碎片的分離能夠得到上清液I，該上清液I基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，上清液I中干物質(zhì)的含量可以被提高，而其中的小白菊內(nèi)酯含量則沒有顯著的變化。因此，在進(jìn)行分離之前，通過強(qiáng)攪拌(例如，使用rotostat)、或均化處理(例如，使用polytron勻漿器)、或超聲處理、或微波射線、和/或它們的組合，對(duì)所述細(xì)胞汁進(jìn)行處理，以使葉綠體組分部分與(x-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是與小白菊內(nèi)酯不具有強(qiáng)結(jié)合力和/或親和力，27從而使葉綠體組分移入至連續(xù)的(可溶的)彌散相中。上述過程能夠進(jìn)一步提高上清液I中的干物質(zhì)含量，而并不使a-不飽和，內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯的含量提高。結(jié)果，在僅僅為全部的細(xì)胞汁干物質(zhì)的15-20%的沉淀物I中可以得到分離的葉綠體及其碎片，因而，全部的細(xì)胞汁干物質(zhì)的80-85%殘留在濃縮的細(xì)胞汁上清液I中。在一個(gè)實(shí)施方式中，將富含有(x-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯的沉淀物I儲(chǔ)存在^-2(TC下。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將所述沉淀物I干燥(例如，使用凍干器、或噴霧干燥器、或流化床干燥器)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)沉淀物I進(jìn)行保存(例如，使用0.75%的葡萄糖酸5內(nèi)酯和0.25%的抗壞血酸鈉，或使用1.0%的非諾尼普)，然后在冷凍條件下進(jìn)行儲(chǔ)存。在一個(gè)實(shí)施方式中，將含有小白菊內(nèi)酯的沉淀物I應(yīng)用于本領(lǐng)域常用的野甘菊衍生物的常規(guī)應(yīng)用領(lǐng)域。雖然上清液I基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯，本發(fā)明能夠在不降低其期望的生物活性的情況下，從上清液中定量地將這些不需要的組分去除掉。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過利用額外的上清液I的不同處理，可以實(shí)現(xiàn)殘余的a-不飽和Y-內(nèi)酉旨，特別是小白菊內(nèi)酯的定量去除。這些處理包括但不限制于以下處理(i)提高上清液I的pH(6.0^pHS10.0)，以起始與a-不飽和T"內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯具有親和力的組分的等點(diǎn)沉淀；(ii)使用離心和/或過濾對(duì)沉淀物組分進(jìn)行分離，以濃縮位于沉淀物II中的上述組分；(iii)將得到的上清液II的pH調(diào)節(jié)至細(xì)胞汁的初始pH值；和(iv)通過離心和減過濾或微濾(孔徑S0,22pm)或超濾(截留分子量SIO,OOO道爾頓)對(duì)上清液II進(jìn)行額外的澄清，以得到最終上清液。上述步驟促成的最終上清液的分離，該上清液完全不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯，但具有所有期望的生物活性。28在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)最終的沉淀物n進(jìn)行干燥(例如，通過凍干器、或噴霧干燥器、或流化床干燥器)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在冷凍條件下對(duì)所述沉淀物ii進(jìn)行儲(chǔ)存。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過加入如先前在美國專利No.2003/0175235中描述的防腐劑以及對(duì)該混合物進(jìn)行孵育直至完全溶解，獲得了最終上清液的穩(wěn)定性，該專利的全文通過引用的方式并入本文。所用的防腐劑包括0.1%的山梨酸鉀、0.1%的苯甲酸鈉、0.1%的對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉、0.1%的焦亞硫酸鈉、0.1%的檸檬酸75%。在環(huán)境條件下，儲(chǔ)存保存好的最終上清液。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過蒸發(fā)、或透析、或電滲析、或反滲透、或它們的組合對(duì)最終上清液進(jìn)行濃縮。優(yōu)選通過蒸發(fā)，因?yàn)檎舭l(fā)能夠使所述生物活性成分的完整性得以保存，除了去除水以外不發(fā)生不期望的任何組分的去除。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將濃縮的最終上清液與穩(wěn)定劑混合，所述濃縮的最終上清液為能夠自發(fā)形成淡米色沉淀物的不穩(wěn)定的暗褐色渾濁懸浮液，所述穩(wěn)定劑包括但不限制于25.0%的丙三醇或戊二醇(1，2-戊二醇或1,2-二羥基戊烷)。本發(fā)明還涉及分離的生物活性成分，該生物活性成分基本不含有或完全不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯，并且該生物活性成分還具有期望的生物活性沉淀物II(生物活性成分A)、最終上清液(生物活性成分B)、和濃縮的最終上清液(生物活性成分C)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的生物活性成分與穩(wěn)定劑進(jìn)行了組合。特別適合的穩(wěn)定劑包括但不限制于防腐劑、抗氧化劑、和/或它們的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)所述分離的生物活性成分進(jìn)行了濃縮，然后進(jìn)行穩(wěn)定，以進(jìn)一步用于口服和局部應(yīng)用的皮膚保護(hù)。本發(fā)明的生物活性成分還可以包括在現(xiàn)有技術(shù)常用的給藥體系中。29所有的本發(fā)明的生物活性成分可以用作摻入在包括局部和口服應(yīng)用的皮膚保護(hù)產(chǎn)品中的溶液、懸浮液、分散體、糊劑、或干粉末。實(shí)施例以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但并不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1-從新鮮野甘菊中制備生物活性組分下面描述是對(duì)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的相關(guān)方面的描述。在生長的盛花期，采集足夠量的新鮮野甘菊的地上部分，約100kg的干物質(zhì)。檢測到新鮮野甘菊中干物質(zhì)的水平為23.77%，需要采集約420.7kg的新鮮植物量以生成100kg的干物質(zhì)。利用的野甘菊的HPLC色譜如圖2所示。保持新鮮野甘菊的含水量并避免由水分流失引起的枯萎。以這種方式進(jìn)行采集以避免采集的新鮮野甘菊的切碎、搗碎、和壓碎，或者使上述狀況最小化。在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成所有的步驟。這樣可以使野甘菊在陽光、高溫、和其它負(fù)面環(huán)境因素的暴露最小化。然后，進(jìn)行清洗步驟以在進(jìn)行進(jìn)一步的處理之前，從植物中去除土壤顆粒和其它碎片。通過在水壓￡1kg/cm2的條件下在S5分鐘內(nèi)完成采集的野甘菊的清洗步驟。殘余的水清洗物不含有任何綠色或褐色色素，用于指示適合的水壓和清洗時(shí)間。從清洗后的植物量中去除多余的水。清洗后的野甘菊經(jīng)過碾碎、浸泡、和壓搾，得到細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(即，細(xì)胞汁)，并將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)從富含纖維的材料中分離出。使用具有5HP引擎的錘式粉碎機(jī)，在最短的時(shí)間內(nèi)并以不引起生物量溫度顯著升高的方式，對(duì)生物量進(jìn)行碾碎以得到具有適合大小的野甘菊組織顆粒。設(shè)置錘式粉碎機(jī)，以在90秒的處理時(shí)間內(nèi)得到最大尺寸S2.0厘米的浸軟植物顆粒。所述生物量的溫度僅僅升高5匸。直接使用裝配有由壓縮空氣支撐的錐體的水平連續(xù)螺旋壓力機(jī)(CompactPressCP-6,VincentCorporation,Tampa,FL)，以立即從、浸軟的野甘菊中得到細(xì)胞汁。錐體的壓力維持在220kg/cm的水平，螺旋轉(zhuǎn)速為12rpm，溫度的增加僅S5'C。該處理生成富含纖維的材料和細(xì)胞汁。使用其澄清半自動(dòng)連續(xù)流離心機(jī)，在S3,000rpm的條件下，在^30秒的滯留時(shí)間內(nèi)從細(xì)胞汁中分離出殘余的小纖維顆粒(Model12-413V，AMLIndustries,Inc.,Hatboro,PA)。收集沉淀物并與壓搾野甘菊后得到的富含纖維的材料結(jié)合在一起。上述描述的過程能夠生成干物質(zhì)水平為8.20%的217.2kg的野甘菊細(xì)胞汁，和干物質(zhì)水平為40.39%的203.5kg富含纖維的材料。富含纖維的材料的HPLC色譜如圖3所示。然后將細(xì)胞汁進(jìn)行包括pH調(diào)節(jié)、微波輻射和分離在內(nèi)的多種處理。通過滴定法使用3.6升的5.0N的鹽酸，調(diào)節(jié)新鮮野甘菊細(xì)胞汁的pH值(初始pH=5.3)，以使所述細(xì)胞汁的pH降低至3.5。然后，使用頻率為2.45GHz，輸出功率為3200瓦特的特別設(shè)計(jì)的連續(xù)流系統(tǒng)(MicrowaveResearch&Applications,Inc.,Laurel,MD)，將調(diào)節(jié)后的細(xì)胞汁立即暴露于微波輻射下。該系統(tǒng)裝配有恒定速率的攪拌器BDC1850(CaframoLtd.,Wiarton，Ontario,Canada)和溫度控制探針。進(jìn)行該處理直至微波室內(nèi)的細(xì)胞汁的溫度達(dá)到92°C，然后通過與1HP再循環(huán)冷卻器(Model6106P,PolyscienceCorporation,Niles，IL)相連的連續(xù)流設(shè)備，立即對(duì)處理后的細(xì)胞汁進(jìn)行泵送。在處理后的細(xì)胞汁的溫度降低至g(TC之后，使用連續(xù)流離心機(jī)CEPALE(CarlPadbergZentrifbgenbauGmbH,Germany),在15000rpm的條件下在S0秒的時(shí)間內(nèi)，對(duì)所述材料進(jìn)行分離。220.8kg的處理后的細(xì)胞汁的分離，產(chǎn)出19.2kg的干物質(zhì)含量為26.2%的墨綠色糊狀沉淀物(下文稱沉淀物1)，和201.6kg的干物質(zhì)含量為6.34%的褐色微乳白上清液(下文稱上清液1)。沉淀物I的HPLC色譜如圖4所示。值得關(guān)注的是，圖4所示的沉淀物I的HPLC分布與在美國專利No.6,479,080(見，圖l)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有顯著的差異。因此，沉淀物I的組成與美國專利No.6,479,080中描述的野甘菊提取物的組成具有顯著的差異。然后，對(duì)沉淀物I進(jìn)行包括pH調(diào)節(jié)和分離在內(nèi)進(jìn)一步的處理。通過滴定法使用1.07升50。/。的氫氧化鉀(KOH)進(jìn)行第一pH調(diào)節(jié)，以使細(xì)胞汁上清液I的pH從3.5增至9.0。該處理使材料的乳白光改進(jìn)和材料的顏色更暗，使用連續(xù)流離心機(jī)CEPALE(CarlPadbergZentrifligenbauGmbH,Germany),在15000rm的條件下，在^30秒的滯留時(shí)間內(nèi)使該材料立即被澄清。上述分離產(chǎn)出0.55kg的干物質(zhì)含量為38.2%的暗米色糊狀沉淀物(下文稱沉淀物11)，和202.12kg的干物質(zhì)含量為6.22%的褐色微乳上清液(下文稱上清液11)。沉淀物II的HPLC色譜如圖5所示。值得關(guān)注的是，圖5所示的HPLC分布與美國專利No.6，479，080(見，圖l)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有顯著的差異。因此，沉淀物II的組成與美國專利No.6,479,080中描述的野甘菊提取物的組成具有顯著的差異。通過HPLC分析確定的含有0.01%的小白菊內(nèi)酯的沉淀物II表示為生物活性組分A，該生物活性組分A基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，特別是小白菊內(nèi)酯。使用5.0N的鹽酸對(duì)上清液II進(jìn)行等電滴定，以使pH值被調(diào)回至上清液I的初始pI^3.5。這樣的處理導(dǎo)致材料微乳光的增強(qiáng)，但使用連續(xù)流離心機(jī)CEPALE(CarlPadbergZentrifiigenbauGmbH,Germany),在15000rpm的條件下在260秒的時(shí)間內(nèi)使該材料有效地被澄清。通過HPLC分析檢測到，澄清的材料(下文稱最終上清液)含有^).00007%的小白菊內(nèi)酯，根據(jù)檢測極限，上述最終上清液應(yīng)該認(rèn)為不含有小白菊內(nèi)酯，特別是完全不含有小白菊內(nèi)酯。通過添加防腐劑和抗氧化劑并孵育該混合物直至完全溶解，使最終上清液具有穩(wěn)定性。所用的防腐劑和抗氧化劑包括0.1%的山梨酸鉀、0.1%的苯甲酸鈉、0.1%的對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉和0.2%的焦亞硫酸鈉。該制備過程產(chǎn)出201.6kg的生物活性成分B,該生物活性成分B含有6.8%的干物質(zhì)。100kg的初始野甘菊生物的干物質(zhì)得到的生物活性成分B的量約為12.5kg干物質(zhì)。生物活性成分B的HPLC色譜如圖6所示。值得關(guān)注的是，圖6所示的生物活性成分B的HPLC分布與美國專利No.6,479，080(見，圖l)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有顯著的差異。因此，生物活性成分B的組成與美國專利No.6,479,080中描述的野甘菊提取物的組成具有顯著的差異。利用配備有8個(gè)0.6升試管、2.550升集液器、和隔膜真空泵(Model2018B-01,WelchRietscheThomas,Skokie，IL)的RapidVap真空蒸發(fā)系統(tǒng)(Labconco,KanzasCity,MO),使所述生物活性成分B濃縮。在操作壓力為100mBar、溫度為60°C，渦旋速率為40%的條件下，在90分鐘循環(huán)內(nèi)對(duì)生物活性成分B進(jìn)行濃縮，產(chǎn)出總共63.16升(或70.11kg)的干物質(zhì)含量為19.89%的濃縮的材料。然后，將5.0%(重量/重量)的戊二醇加入至濃縮的材料中，在^60秒的適度混合之后，得到透明暗褐色的結(jié)果液體生物活性成分C。通過HPLC分析檢測至l」，所述生物活性成分C含有〈0.00007。/。的小白菊內(nèi)酯，根據(jù)檢測極限，上述生物活性成分C應(yīng)該認(rèn)為不含有小白菊內(nèi)酯，特別是完全不含有小白菊內(nèi)酯。生物活性成分C的HPLC色譜如圖7所示。值得關(guān)注的是，圖7所示的生物活性成分C的HPLC分布與美國專利No.6,479，080(見，圖l)中描述的野甘菊提取物的HPLC分布具有顯著的差異。因此，生物活性成分C的組成與美國專利No.6，479，080中描述的野甘菊提取物的組成具有顯著的差異。實(shí)施例2-生物活性成分B的特征和性質(zhì)根據(jù)與上述實(shí)施例1相同的方法制備生物活性成分B。對(duì)生物活性成分B進(jìn)行分析，以確定其多種物理-化學(xué)特性、化學(xué)特性、和微生物學(xué)特性。選擇的生物活性成分B的物理-化學(xué)特性和化學(xué)特性如表1所示。表1-生物活性成分B的物理-化學(xué)特性和化學(xué)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>金黃色葡萄球菌陰性假單孢菌陰性*菌落形成單位下表3所示的抗微生物效果檢測的結(jié)果顯示出，生物活性成分B具有有效的防腐劑體系。表3—生物活性成分B的抗微生物效果檢測的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表4中包括與生物活性成分B的抗炎性和抗氧化活性有關(guān)的數(shù)據(jù)。使用人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶檢測法檢測抗炎性活性，并使用細(xì)胞色素C還原分析檢測抗氧化活性。表4一生物活性成分B的抗炎性和抗氧化活性<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>生物活性成分B在避光的封閉容器內(nèi)于15-25"C的溫度間保存至少12個(gè)月后，檢測該生物活性成分B是穩(wěn)定的(S卩，維持物理和化學(xué)的完整性)。實(shí)施例3—生物活性成分C的特征和性質(zhì)根據(jù)與上述實(shí)施例1相同的方法制備生物活性成分C。對(duì)生物活性C進(jìn)行分析，以確定其各種物理-化學(xué)的、化學(xué)的、微生物的、和生物活性特性。選擇的生物活性成分C的物理-化學(xué)的和化學(xué)的特征如下表5所示。圖5—生物活性C的物理-化學(xué)的和化學(xué)的特性參數(shù)結(jié)果外觀紅-褐色液體氣味特征性顏色(加德納色度)18.5干物質(zhì)，％19.82比重，g/cm31.117折射率，nD1.3770PH4.1最大紫外光，nm255小白菊內(nèi)酯，％<0細(xì)07生物活性成分c可以容易地以任何比例溶于水。下面的表6描述了生物活性成分C的微生物學(xué)特性。這些數(shù)據(jù)表明生物活性成分C使皮膚保護(hù)在總的平板計(jì)數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)方面能夠滿足工業(yè)需要，并且不含有病原體。表6—生物活性成分C的微生物學(xué)特性參數(shù)結(jié)果總的平板計(jì)數(shù)，CFU*/g<100<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表7涉及生物活性成分C的抗炎性和抗氧化活性。使用人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶檢測法檢測抗炎性活性，并使用細(xì)胞色素C還原分析檢測抗氧化活性。表7—生物活性成分C的生物學(xué)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>生物活性成分C在避光的封閉容器內(nèi)于15-25'C的溫度保存至少12個(gè)月后，檢測該生物活性成分C是穩(wěn)定的(即，維持物理和化學(xué)的完整性)。實(shí)施例4一生物活性組分A的特征和性質(zhì)根據(jù)與上述實(shí)施例1相同的方法制備生物活性組分A。對(duì)生物活性A進(jìn)行分析，以確定其各種物理-化學(xué)的、化學(xué)的、微生學(xué)物的、和生物活性特性。選擇的生物活性組分A的物理-化學(xué)的和化學(xué)的特性如下圖8所示。圖8—生物活性A的物理-化學(xué)的和化學(xué)的特性<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>顏色(I^值)27.83顏色^*值)0.57顏色(1)*值)8,24干物質(zhì)，％38.2比重，g/cm31.087pH9.0小白菊內(nèi)酯，％<0.01下面的表9描述了生物活性組分A的微生物學(xué)特性。這些數(shù)據(jù)表明生物活性組分A使皮膚保護(hù)在總的平板計(jì)數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)方面能夠滿足工業(yè)需要，并且不含有病原體。表9—生物活性組分A的微生物學(xué)特性參數(shù)結(jié)果總的平板計(jì)數(shù)，CFUVg<100霉菌和酵母，CFUVg<10大腸桿菌陰性沙門氏菌陰性金黃色葡萄球菌陰性假單孢菌陰性*菌落形成單位表10涉及生物活性組分A的抗炎性和抗氧化活性。使用人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶檢測法檢測抗炎性活性，并使用細(xì)胞色素C還原分析檢測抗氧化活性。表IO—生物活性組分A的生物學(xué)活性38抗炎性(ICs。)，pl11.2抗氧化活性(IC^，Hl2,2生物活性組分A在避光的封閉容器內(nèi)的冷凍裝置中保存至少12個(gè)月后，檢測該生物活性組分A是穩(wěn)定的(即，維持物理和化學(xué)的完整性)。實(shí)施例5—從不同的季節(jié)的不同收獲物中的得到的野甘菊中得到的生物活性組分的比較利用新鮮野甘菊分析生物活性成分的重復(fù)性，該新鮮野甘菊收獲自同一片土地的兩個(gè)連續(xù)的季節(jié)。此外，在同一生長期，每個(gè)季節(jié)收獲兩次新鮮野甘菊。利用與上述實(shí)施例1相同的方法處理上述所有的新鮮野甘菊生物量樣品。生物活性成分B和C的產(chǎn)量、選擇性特征和性質(zhì)的比較相關(guān)的數(shù)據(jù)如下文所示(生物活性組分A相關(guān)的數(shù)據(jù)不包括在此實(shí)施例中，因?yàn)檫@種生物活性組分的產(chǎn)量很低)?？梢钥闯?，從產(chǎn)出100kg的干物質(zhì)的野甘菊的量可以生產(chǎn)出約12.4士2.1kg的生物活性組分的干物質(zhì)。新鮮野甘菊生物量中的平均干物質(zhì)含量約為20%，因此，可以得到約l卯kg的生物活性成分B或約62kg的生物活性成分C。得自第一收獲物和第二收獲物的生物活性組分(p-值-0.8893)，或得自兩個(gè)連續(xù)的季節(jié)(p-值-0.6531)的生物活性組分并沒有顯示出顯著的區(qū)別。此夕卜，生物活性組分之間的干物質(zhì)含量(p-值^0.5334)以及上述組分中的小白菊內(nèi)酯的含量(-值=0.9923)并沒有顯著的區(qū)別。所述生物活性組分的所選物理-化學(xué)的和化學(xué)的特性如下表11所示，所述生物活性組分得自不同的季節(jié)的不同收獲物的新鮮野甘菊，所述特性顯示出生物活性成分B和生物活性成分C具有很高的重復(fù)性。表ll一得自不同的季節(jié)的不同收獲物的新鮮野甘菊的生物活性組分的39<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>應(yīng)該注意的是，生物活性組分中的小白菊內(nèi)酯的含量低于HPLC分析過程的檢測極限。下表12描述了所述生物活性組分的微生物學(xué)特性。這些數(shù)據(jù)表明，得自不同的季節(jié)的不同收獲物的新鮮野甘菊的生物活性組分使皮膚保護(hù)在總的平板計(jì)數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)方面能夠滿足工業(yè)需要，并且不含有病原體。表12—得自不同的季節(jié)的不同收獲物的新鮮野甘菊的生物活性組分的微生物學(xué)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*菌落形成單位表13涉及生物活性成分的抗炎性和抗氧化活性。使用人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶檢測法檢測抗炎性活性，并使用細(xì)胞色素C還原分析檢測抗氧化活性。得自不同的季節(jié)的不同收獲物的新鮮野甘菊的生物活性組分并沒有顯示出顯著的差異，并且所述特性顯示出生物活性成分B和生物活性成分C具有很高的重復(fù)性。表13—得自不同的季節(jié)的不同收獲物的野甘菊的生物活性組分的生物活性的重復(fù)性<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>得自不同的季節(jié)的不同收獲物的野甘菊的生物活'性成分在避光的封閉容器內(nèi)的冷凍裝置中保存至少12個(gè)月后，檢測該生物活性成分是穩(wěn)定的(即，維持物理和化學(xué)的完整性)。實(shí)施例6—用于檢測生物活性成分的特定特征的過程下文是用于檢測生物活性組分的特定特征的多種方法。在上述實(shí)施例中均參考了這些方法。下文的"檢測產(chǎn)品"或"檢測樣品"指的是生物活性成分。檢測干物質(zhì)的方法用于檢測干物質(zhì)的步驟包括在IO(TC的水浴中蒸發(fā)檢測的產(chǎn)品直至水分完全蒸發(fā)；在105。C的溫箱內(nèi)儲(chǔ)藏所述樣品3小時(shí)；冷卻至室溫；并立即稱量含有固體物質(zhì)的容器的重量。用于檢測！^a葉M直的方法用于檢測1^^化*值的步驟使用了測量幾何為0°/45°的設(shè)置有HunterLabscan的幾何比色計(jì)。使用具有向上視窗的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)光物D65。將具有檢測的生物活性成分的容器放置于視窗上，并通過其底部進(jìn)行檢測。使用以下CIELAB方程式C*=(a*2+b*2)1/2DE*=[(DDLL)2+(Da*)2+(Db*)2]1/2DH=[(DE*)2-(DL*)2-(DC*)2]1/2。用于檢測小白菊內(nèi)酯含量的方法使用甲醇并且進(jìn)行30分鐘的超聲波處理，對(duì)樣品進(jìn)行萃取。使用C18反相柱作為靜止相，并使用44%的乙腈、56%的水和0.1%的磷酸作為流動(dòng)相。在225nm處檢測小白菊內(nèi)酯，并使用具有30嗎/g-900(ig/g的六個(gè)小白菊內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)范圍(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis，MO)的多個(gè)校準(zhǔn)曲線來確定小白菊內(nèi)酯的濃度。該條件下的檢測極限為0.7pg/ml。使用這些設(shè)置的條件定量出約30pg/g的小白菊內(nèi)酯。用于檢測微生物學(xué)特性的方法根據(jù)美國藥典(USP)方法UPSXXVII,NF22,<61>，微生物學(xué)極限檢測，來確定檢測的樣品的微生物學(xué)特性，該方法的全部內(nèi)容通過引用的方式并入本文。上述檢測包括總需氧量計(jì)數(shù)、總霉菌和酵母(需氧菌平板計(jì)數(shù))；沙門氏菌(sp.)、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、和假單孢菌的檢測。使用美國藥典(USP)方法USPXXVII,NF22,<51>，抗微生物效果檢測,pp.2148-2150，進(jìn)行防腐劑的挑戰(zhàn)性研究，該方法的全部內(nèi)容通過引用的方式并入本文。在20-25。C下孵育接種的檢測樣品，并在時(shí)間間隔為7天、14天、21天、和28天時(shí)進(jìn)行檢測。用于檢測彈性蛋白酶抑制活性的方法通過使用了人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶(ElastinProductsCompany,Inc.,Owenswille,MO)和合成月太可溶性底物N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-NA(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,MO)的檢測法，對(duì)檢測的生物活性組分的彈性蛋白酶抑制活性進(jìn)行檢測。該檢測法包括在ElastinProductsCompany的目錄中描述的方法"人彈性蛋白酶活性的測定"ResearchBiochemicalCatalog,ElastinProductCompany,Inc.,Owensville,MO，84頁(2004)的改進(jìn)方法，該方法通過引用的方式全部并入本文中。在410nm處和25"C下，使用含有50mMNaCl的O.lMTris-HCl緩沖液(pH7.5)檢測所述底物的酶切。位于分光光度計(jì)的透明容器內(nèi)的反應(yīng)介質(zhì)的總體積為3.0ml。在酶反應(yīng)速率降低50X(ICso)所需的濃度下，檢測每一個(gè)需要檢測的生物活性組分。用于檢測超氧化物清除活性的方法使用基于Quick等，在"Rapidmicroplateassayforsuperoxidescavengingefficiency,"J.NeuroscienceMethods,97:139-144(2000)中描述的過程的方法，該過程的全部內(nèi)容通過弓I用的方式并入本文中。所述檢測考慮了檢測生物活性成分的速度和精度，以確定超氧化物清除的比較的抗氧化活性。所述檢測包括次黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、和細(xì)胞色素C。次黃嘌呤用作底物，并在兩個(gè)步驟的過程中被黃嘌呤氧化酶所代謝，生成兩個(gè)超氧化物陰離子。這些游離的陰離子還原了細(xì)胞色素C，從而在550nm處產(chǎn)生顯著的峰增加。位于分光光度計(jì)的透明容器內(nèi)的反應(yīng)介質(zhì)的總體積為3.0ml。雖然在此描述了優(yōu)選的實(shí)施方式，但在不背離本發(fā)明的宗旨和情況下，可以進(jìn)行各種對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的各種修改、補(bǔ)充和替換等，因此，本發(fā)明的范圍如下文所附的權(quán)利要求書所述。4權(quán)利要求1、一種生物活性成分，該成分含有源自野甘菊(Tanacetumparthenium)植物的鮮生物量的細(xì)胞汁的分離的生物活性組分，其中，所述生物活性組分不含有或基本不含有α-不飽和γ-內(nèi)酯，所述α-不飽和γ-內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯；并且，其中，所述生物活性組分具有抗炎性和抗氧化活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性組分不含有小白菊內(nèi)酯。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性組分基本不含有小白菊內(nèi)酯。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物活性成分，其中，所述生物活性組分中，小白菊內(nèi)酯的含量等于或小于約0.01重量％。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性組分的抗炎性ICs。值為約0.01體積％至約2.0體積％，其中，所述ICso值表示使彈性蛋白酶的酶促反應(yīng)的速度降低50%所需的生物活性成分的濃度。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性成分，其中，所述生物活性組分的抗氧化活性IC5o值為約0.007體積％至約1.0體積％，其中，所述ICso值表示使細(xì)胞色素C還原反應(yīng)的速度降低50%所需的生物活性成分的濃度。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性成分，其中，該生物活性成分還含有穩(wěn)定劑。8、一種生物活性組分的分離方法，該生物活性組分源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁，并且該生物活性組分基本不含有a-不飽和y-內(nèi)酯，該方法包括提供野甘菊植物的鮮生物量；在能夠有效地生成細(xì)胞汁上清液以及膜組分的條件下對(duì)所述鮮生物量進(jìn)行加工；在能夠有效地生成第一細(xì)胞汁漿上清液以及細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物的條件下對(duì)細(xì)胞汁上清液進(jìn)行處理；和對(duì)細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物進(jìn)行分離，其中，所述細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物為生物活性組分，該生物活性組分基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，其中所述a-不飽和Y-內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，對(duì)所述鮮生物量進(jìn)行加工的步驟包括將所述鮮生物量分離成細(xì)胞汁組分和富含纖維的材料；使所述細(xì)胞汁組分澄清，以得到澄清的細(xì)胞汁組分；和將所述澄清的細(xì)胞汁組分分離成細(xì)胞汁上清液和膜組分。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，該方法還包括在能夠有效地生成第二細(xì)胞汁漿上清液的條件下使所述第一細(xì)胞汁漿上清液澄清；在能夠有效地生成穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分的條件下將穩(wěn)定劑與所述第二細(xì)胞汁漿上清液混合，其中，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，該生物活性組分基本不含有a-不飽和y-內(nèi)酯，所述a-不飽和y-內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯。11、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，該方法還包括在能夠有效地生成濃縮的細(xì)胞汁漿上清液的條件下，使所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分濃縮。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，該方法還包括在能夠有效地生成穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分的條件下，將穩(wěn)定劑與所述濃縮的細(xì)胞汁漿上清液混合，其中，所述穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，該生物活性組分不含有(X-不飽和Y-內(nèi)酯，所述a-不飽和Y-內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯。13、一種生物活性成分，該生物活性成分含有根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法制備的細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物，其中，所述細(xì)胞質(zhì)組分沉淀物為生物活性組分，該生物活性組分基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，所述a-不飽和Y-內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯。14、一種生物活性成分，該生物活性成分含有根據(jù)權(quán)利要求10制備的穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分，其中，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分為生物活性組分，該生物活性組分基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，所述a-不飽和Y-內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物活性成分，其中，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿上清液的抗炎性IC5。值為約0.01體積％至約2.0體積％，其中，所述ICso值表示使彈性蛋白酶的酶促反應(yīng)的速度降低50。/^所需的生物活性成分的濃度。16、根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物活性成分，其中，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分的抗氧化活性ICso值為約0.007體積％至約1.0體積％，其中，所述IC50值表示使細(xì)胞色素C還原反應(yīng)的速度降低50%所需的生物活性成分的濃度。17、一種生物活性成分，該生物活性成分含有根據(jù)權(quán)利要求12制備的穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分，其中，所述穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿上清液組分為生物活性組分，該生物活性組分不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，所述a-不飽和？內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的生物活性組分，其中，所述穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿上清液組分的抗炎性IC5。值為約0.01體積％至約2.0體積％，其中，所述IQo值表示使彈性蛋白酶的酶促反應(yīng)的速度降低50%所需的生物活性成分的濃度。19、根據(jù)權(quán)利要求17所述的生物活性組分，其中，所述穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分的抗氧化活性ICs。值為約0.007體積％至約1.0體積％，其中，所述ICs。值表示使細(xì)胞色素C還原反應(yīng)的速度降低50%所需的生物活性成分的濃度。20、一種生物活性組合物，該組合物含有源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁的一種或多種分離的生物活性組分的混合物，其中，所述生物活性組分各自不含有或基本不含有a-不飽和Y-內(nèi)酯，所述a-不飽和Y-內(nèi)酯包括小白菊內(nèi)酯，并且，其中所述生物活性組分具有抗炎性和抗氧化活性。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的生物活性組合物，其中，所述一種或多種分離的生物活性組分包括選自由上清液I、上清液II、沉淀物II(生物活性成分A)、最終上清液、生物活性成分B、濃縮的最終上清液、和生物活性成分C所組成的組中的生物活性組分。22、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性組合物，該組合物還含有穩(wěn)定劑。全文摘要本發(fā)明涉及生物活性成分，該生物活性成分含有源自野甘菊植物的鮮生物量的細(xì)胞汁的分離的生物活性組分。所述生物活性組分不含有或基本不含有α-不飽和γ-內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)。此外，所述生物活性組分具有抗炎性和抗氧化活性。本發(fā)明還涉及一種生物活性組分的分離方法，該生物活性組分源自野甘菊(Tanacetumparthenium)植物的鮮生物量的細(xì)胞汁，并且該生物活性組分至少基本不含有α-不飽和γ-內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)。本發(fā)明還涉及一種穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分和穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分的制備方法，所述穩(wěn)定的細(xì)胞汁漿組分和穩(wěn)定的濃縮的細(xì)胞汁漿組分不含有α-不飽和γ-內(nèi)酯(例如，小白菊內(nèi)酯)。本發(fā)明還涉及一種生物活性組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明分離的生物活性組分的混合物。文檔編號(hào)A01N65/00GK101453898SQ200780013469公開日2009年6月10日申請(qǐng)日期2007年2月21日優(yōu)先權(quán)日2006年2月21日發(fā)明者M(jìn)·科加諾夫申請(qǐng)人:聯(lián)合植物科技有限公司