專利名稱：：表達(dá)齒斑葡聚糖蔗糖酶并合成改性淀粉的轉(zhuǎn)化植物的制作方法表達(dá)齒斑葡聚糖蔗糖酶并合成改性淀粉的轉(zhuǎn)化植物本發(fā)明涉及經(jīng)基因修飾的植物細(xì)胞和植物，其中該基因修飾在此類植本發(fā)明還涉及用于制造此類植物細(xì)胞和植物的手段及方法。這種類型的植物細(xì)胞和植物合成改性淀粉。本發(fā)明因此還涉及由本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物合成的淀粉及用于產(chǎn)生該淀粉的方法，以及這種改性淀粉的淀粉衍生物的制造。鑒于近來(lái)賦予植物成分作為原料的可再生來(lái)源的重要性日益增長(zhǎng)，生物技術(shù)研究的任務(wù)之一是努力調(diào)整植物原料以適應(yīng)加工工業(yè)需要。為了在盡可能多的應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)能夠使用再生性原料，得到非常多樣的材料更重要。除油、脂和蛋白質(zhì)以外，多糖構(gòu)成源自植物的主要再生性原料。除纖維素之外，淀粉在多糖中占據(jù)重要地位，因?yàn)槠錇楦叩戎参镏辛孔疃嗟馁A藏物質(zhì)之一。淀粉在綠葉葉綠體內(nèi)(暫存淀粉)以及塊莖、根和種子的造粉體內(nèi)(貯藏淀粉)作為顆粒沉積(Kossmann和Lloyd2000)。淀粉多糖是由化學(xué)上均一的基本成分即葡萄糖構(gòu)成的聚合物。然而，淀粉組成來(lái)自多種類型分子的高度復(fù)雜的混合物，這些分子在其葡萄糖鏈的聚合程度以及分支程度上彼此不同。因此，淀粉不是均一的原料。人們尤其將其區(qū)分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，前者是由《-1，4-糖苷分支的葡萄糖分子組成的基本上不分支的聚合物，后者則是多種分支的葡萄糖鏈的復(fù)雜混合物。分支因源于額外的a-l，6-糖苷鍵，在植物貯藏器官中，淀粉的生物合成在造粉體內(nèi)發(fā)生并且是不同及^應(yīng)如合成(葡萄糖殘基的聚合)、重排和降解的結(jié)果，在其中多種淀粉合成酶(E.C.2.4.1.21)、轉(zhuǎn)移酶(分支酶(￡.<:.2.4.1.18)及岐化酶(￡.(:.2.4.1.25))以及水解酶(去分枝酶(尼.(:.3.2.1.41))分別起重要作用。為了能夠盡可能拓寬淀粉的用途，提供能夠合成特別適合于多種用途的改性淀粉的植物似乎受到歡迎。除了育種方法以外，提供這種植物的另一種可能是通過(guò)重組DNA技術(shù)對(duì)淀粉生產(chǎn)植物的淀粉代謝進(jìn)行特定的基因修飾。已經(jīng)開展數(shù)項(xiàng)研究多年，其目的是將造粉體變成更為通用的多糖工廠。為此目的，已經(jīng)為數(shù)種微生物酶配備了質(zhì)體乾向性轉(zhuǎn)運(yùn)肽，并且已經(jīng)研究這些酶對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)和功能性的影響。某些細(xì)菌擁有稱作葡聚糖蔗糖酶的一系列酶，其可以附加(連續(xù)的)1，6-連接的或1，3-連接的葡萄糖殘基至麥芽糖糊精。除少數(shù)例外之外，葡聚糖蔗糖酶AJ泡外酶，由乳酸細(xì)菌如腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)菌林、口腔鏈球菌(Streptococci)以及乳酸桿菌(Lactobacilhis)和乳酸球菌(Lactococcus)的某些種產(chǎn)生(Robyt1995;vanGeel-Schutten等1999)。此外，它們可由其它細(xì)菌產(chǎn)生，如奈瑟氏菌(Neisseria)菌林的某些種(Hehre等1949)。這些菌林在自然界中參與不同的過(guò)程。某些菌抹定居在人和動(dòng)物的口腔并能夠引起牙齲形成。其它菌林可以^X喉部，如共生的奈瑟氏菌種。某些乳酸桿菌屬物種增加發(fā)酵乳的黏度(deVuyst和Degeest1999)。葡聚糖蔗糖酶催化來(lái)自蔗糖的葡萄糖殘基聚合，這導(dǎo)致產(chǎn)生具有不同大小和結(jié)構(gòu)以及由多樣鍵型組成的一大類多樣的a-葡聚糖。與通過(guò)淀粉合成酶的延伸相比，葡聚糖鏈通過(guò)葡聚糖蔗糖酶的延伸非常不同。首先，優(yōu)選的底物是蔗糖而非ADP-葡萄糖。其次，葡萄糖殘基通過(guò)所謂的兩位點(diǎn)插入機(jī)制添加至正在生長(zhǎng)的葡聚糖鏈的還原性末端(Robyt1995)。此外，葡聚糖的分支不M淀粉生物合成中那樣通過(guò)分枝酶發(fā)生，而是通過(guò)由葡聚糖蔗糖酶自身催化的所謂接納體反應(yīng)發(fā)生(Robyt，1995)。葡聚糖蔗糖酶被認(rèn)為含有可結(jié)合接納體分子，如新生葡^t鏈或麥芽糖糊精的接納體結(jié)合位點(diǎn)(Su和Robyt，1994)。然而，催化接納體反應(yīng)，尤其是具有淀粉聚合物或麥芽糖糊精的接納體反應(yīng)的效率仍不可預(yù)測(cè)，因?yàn)椴涣私獠⑶液苌儆涗洏?gòu)成納體反應(yīng)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。然而，接納體相對(duì)效率似乎取決于接納體分子的大小(Fu等19卯)，并且對(duì)支鏈淀粉和直鏈淀粉可以作為葡聚糖蔗糖的接納體分子不確定。葡聚糖蔗糖酶可以根據(jù)所形成葡聚糖的結(jié)構(gòu)以及特別根據(jù)所合成糖苷鍵的性質(zhì)和頻率進(jìn)行分類。在蔗糖存在下，由口腔生齲性汗毛鏈球菌Cftr印tococc附^fow/ie/)MFe28細(xì)菌產(chǎn)生的GTFI(EC2.4.1.5)齒斑葡聚糖蔗糖酶(Ferretti等，1987)的表達(dá)導(dǎo)致稱作齒斑葡聚糖的葡聚糖聚合物的積累。齒斑葡聚糖聚合物主要由a-(1—3)糖苷鍵組成，具有少量oK1—6)分枝點(diǎn)。由于其主鏈中"-(1—3)連接的葡萄糖殘基比例高(88%)，齒斑葡聚糖聚合物呈水不溶性，而側(cè)鏈中a-(1—6)連接的葡萄糖殘基(12%)促成其黏附特性。齒斑葡IMt聚合物占齒菌斑中存在糖類的大約70%(Loesche，1986),引起多種細(xì)菌性致病因的作用。簡(jiǎn)而言之，稱為早期定居者的多種口腔細(xì)菌通過(guò)祐附素蛋白黏著至牙齒表面存在的受體，從而定居于唾液包被的釉質(zhì)表面。隨后這些細(xì)菌分泌出表現(xiàn)不同程度水溶性的多種多糖，如齒斑葡^JI、葡聚糖和果聚糖(Sutherland，2001)。這些聚合物與早期定居者一起增強(qiáng)產(chǎn)生生物膜的晚期定居者侵入，該生物膜通常稱作齒菌斑(Marsh，2003)。在形成的聚合物中，齒斑葡聚糖最粘稠并且是水不溶性的聚合物.由于GTFI參與人牙齲，已經(jīng)開展了基于GTFI基因工程的不同研究以便闡明其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。有趣的是，僅表達(dá)GTFI催化域即產(chǎn)生活性GTFI酶，其活性大約是70。/。(Monchois等，1999b)。來(lái)自汗毛鏈球菌Mfe28細(xì)菌的gtfl基因的核酸序列已經(jīng)在Ferreti等，1987，J.ofBacteriology，第4271-4278頁(yè)中報(bào)道。淀粉聚合物修飾已經(jīng)通過(guò)將大腸桿菌(Escherichiacoli)糖原合酶(GLGA)和糖原分枝酶(GLGB)靶向至馬鈴薯造粉體得到實(shí)現(xiàn)(Shewmaker等1994;Kortstee等1996)。在兩個(gè)例子中，鏈的延伸和分支的天然平衡被破壞，產(chǎn)生具有改變的物理特性以及具有分支度更高的聚合物的淀粉顆粒。附著新的糖殘基至淀粉聚合物也已經(jīng)成為目標(biāo)。為此目的，將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶(E.C.2.4丄10)導(dǎo)入馬鈴薯塊莖造粉體(Gerrits等2001)。果聚糖蔗糖酶可以使M底物蔗糖的果糖部分聚合為高分子量的果聚糖。然而，淀粉產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響并且淀粉形態(tài)學(xué)發(fā)生極大改變。已經(jīng)試驗(yàn)將植物中的淀粉轉(zhuǎn)化為高價(jià)值環(huán)狀*#，環(huán)狀寡糖可以在其非極性空腔內(nèi)容納疏水物質(zhì)并且可以應(yīng)用于多個(gè)食品和藥品應(yīng)用中。將來(lái)自肺炎克雷伯氏菌的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶；E.C2.4.1.19)導(dǎo)入馬鈴薯造粉體(Oakes等1991)用于產(chǎn)生環(huán)糊精。僅0.01%的內(nèi)源性淀粉轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)品，并且該產(chǎn)品難以從植物材料中回收。這些實(shí)例說(shuō)明細(xì)菌酶可以作為用于修飾淀粉的潛在有力工具，然而，它們?cè)谥参镏械男阅苁孪炔豢深A(yù)測(cè)(Kok-JacobA.等，2003)。因此，本發(fā)明目的基于提供改性淀粉、合成此類改性淀粉的新植物細(xì)胞和/或新植物以及用于產(chǎn)生此類植物的方法。附圖描述圖1:通過(guò)掃描電子顯微鏡分析法觀察的野生型Kardal植物(I)的淀粉和改性淀粉顆粒，該分析法在以成熟的齒斑葡IMt蔗糖酶基因(J-K)或以截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶基因(L-M)轉(zhuǎn)化的所選馬鈴薯植物的淀粉上開展。圖2:對(duì)非轉(zhuǎn)化植物(KD-UT)或?qū)σ猿墒斓凝X斑葡聚糖蔗糖酶基因[KDI14(-)、KDI30(+)、KDIll(++)、KDI20(++)或以截短的齒斑葡1^1蔗糖酶基因[KDIC1(-)、KDIC22(+)、KDIC14(++)、KDIC15(++)]轉(zhuǎn)化的所選馬鈴薯植物觀察到的變異淀粉顆粒的百分?jǐn)?shù)，其中(-)、(+)和(++)指對(duì)Gtfi或GtfiCAT基因所表達(dá)mRNA的可比水平(分別是不可檢測(cè)的、中度和高度)。圖3:利用赤蘚紅紅色染色溶液使附著至淀粉顆粒的齒斑葡^t聚合物可見。齒斑葡聚糖聚合物存在于KDIC15淀粉顆粒表面(圖3.C)。對(duì)于與KD-UT可比較的KDI系列，^J^見察到染色(圖3.A)。因此，本發(fā)明涉及基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物，其特征在于它們?cè)谫|(zhì)體中顯示齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的酶活性，并且其中與由非基因修飾的對(duì)應(yīng)野生型植物細(xì)胞或野生型植物合成的淀粉相比，所述的基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物分別合成改性淀粉。術(shù)語(yǔ)"基因修飾的"或"轉(zhuǎn)化的"指具有穩(wěn)定整合至其基因組中的至少一種轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞或植物。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因包括嵌合核酸序列，該嵌合核酸序列包含至少一個(gè)源自除轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)化植物以外的另外一個(gè)生物的元件(異源轉(zhuǎn)基因)。特別地，該轉(zhuǎn)基因是重組性轉(zhuǎn)基因，其至少包含啟動(dòng)子、編碼序列以及任選地包含終止信號(hào)。更優(yōu)選地，重組性轉(zhuǎn)基因的編碼序列編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)，最優(yōu)選地是齒斑葡聚糖蔗糖酶GTFI蛋白質(zhì)。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"野生型植物細(xì)胞，，或"野生型植物"意指使用所涉及的植物細(xì)胞或植物作為產(chǎn)生本發(fā)明的植物細(xì)胞的起始材料，即除了所導(dǎo)入的基因修飾之外，它們的遺傳信息與本發(fā)明植物細(xì)胞的遺傳信息對(duì)應(yīng)。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)的，，意指在比較數(shù)個(gè)對(duì)象中，所涉及進(jìn)行相互比較的對(duì)象在相同M下培養(yǎng)。在本發(fā)明中，與"野生型植物細(xì)胞"或"野生型植物"有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)的"意指相互比較的植物細(xì)胞或植物在相同條件下培養(yǎng)并且它們具有相同的栽培齡。這里，在本發(fā)明的框架內(nèi)，術(shù)語(yǔ)"活性"分別意指基因修飾植物細(xì)胞或的蛋白質(zhì)的存在和/或由轉(zhuǎn)基因所編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)生的產(chǎn)物的存在。轉(zhuǎn)基因編碼序列的表達(dá)可以例如通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物的量測(cè)定，例如使用Northern印跡分析或RT-PCR。的轉(zhuǎn)基因所編碼蛋白質(zhì)的存在可以例如通過(guò)免疫學(xué)方法如蛋白質(zhì)印跡法、ELISA(酶^JL疫吸附測(cè)定法)或RIA(放射免疫測(cè)定)確定。在轉(zhuǎn)基因編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的情況下，基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物中蛋白質(zhì)的存在可以例如借助非變性丙烯酰胺凝膠電泳證實(shí)。在證實(shí)時(shí)，首先電泳分離含有蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞或植物提取物，并且在丙烯,凝膠于含有蔗糖的各個(gè)緩沖液內(nèi)溫育后，丙烯跣胺^在齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的位置處呈現(xiàn)白色沉淀。此外，凝膠中由齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)產(chǎn)生的齒斑葡聚糖可以用赤蘚紅紅色染色試劑(根據(jù)一般方法中方法6)染色。在已用編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸序列轉(zhuǎn)化的本發(fā)明植物細(xì)胞或本發(fā)明植物中所產(chǎn)生齒斑葡聚糖的存在可以例如通過(guò)免疫分析加以證實(shí)。用于檢測(cè)植物細(xì)胞中存在的齒斑葡聚糖的其它方法是用赤蘚紅紅色染色試劑(根據(jù)一般方法中方法5)染色。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)"將理解為能夠催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的酶，其中齒斑葡聚糖主要包含&1，3-連接的葡萄糖單元。在由齒斑葡聚糖蔗糖*白質(zhì)產(chǎn)生的齒斑葡聚糖中，a-l，3^的數(shù)量?jī)?yōu)選地是75%、更優(yōu)選地至少80%、特別優(yōu)選地至少85%并且最優(yōu)選地至少88%。術(shù)語(yǔ)"齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)"還定義為與SEQIDNO:2所示M酸序列或其部分具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%以及仍更優(yōu)選地至少95%同一性的酶，所述酶具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力NO:。大多數(shù)葡聚糖蔗糖酶，包括齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)，共有由四個(gè)不同區(qū)即信號(hào)肽、可變區(qū)、催化域和I1^末端(葡聚糖結(jié)合)域(GBD)組成的共同結(jié)構(gòu)(Monchois等，1999，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters177，243-248;Monchois等，1999,FEMSMicrobiologyReviews23，131-151)。信號(hào)肽由35-38個(gè)氨基酸組成，并且天然細(xì)菌宿主表達(dá)的信號(hào)肽負(fù)責(zé)蔗糖酶的分泌。信號(hào)肽之后是140-261個(gè)氨基酸的可變區(qū)。催化域或活性核心區(qū)由約900個(gè)氨基酸組成，并且在明串珠菌屬(Leuconostoc)和鏈球菌屬(Streptococcus)物種之間高度保守(MacGregor等1996)。催化域還被稱作蔗糖結(jié)合域，因其含有在結(jié)合和切割蔗糖分子中具有重要作用的天冬氨酸及谷氨酸殘基的催化三聯(lián)體。在作為催化域的部分的單個(gè)氨基酸處具有多個(gè)突變的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)已經(jīng)就各個(gè)突變對(duì)所產(chǎn)生的葡萄糖的結(jié)構(gòu)及各個(gè)齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的催化活性方面進(jìn)行了分析(Shimamura等，1994，J.Bacteriology176(16)，4845-4849)。葡聚糖結(jié)合域覆蓋約500個(gè)氨基酸并且由通過(guò)共有序列定義的稱作A、B、C、D的重復(fù)區(qū)組成(Monchois等1998，1999)。然而這些重復(fù)區(qū)的數(shù)目和組織方式在諸葡聚糖蔗糖酶中不同，并且已經(jīng)證實(shí)為確保葡萄糖結(jié)合特性所需要的這些重復(fù)區(qū)單元的最小數(shù)目根據(jù)酶而不同，并且更特別地對(duì)于產(chǎn)生可溶性葡聚糖的酶和產(chǎn)生不可溶性葡聚糖的酶而言不同(Monchois等，1999)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，能夠合成齒斑葡彩瞎的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)可以是包含相應(yīng)的天然存在蛋白質(zhì)(全長(zhǎng)的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì))的完整M酸序列的蛋白質(zhì)或其變體。齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)蛋白質(zhì):缺少編碼天然^在的;號(hào)序列如引起細(xì)菌齒斑葡聚糖蔗糖i蛋白質(zhì)分泌至培養(yǎng)基的信號(hào)序列的氛基酸.齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的其它變體包含天然存在的齒斑葡聚糖蔗糖si^白質(zhì)的片段、衍生物和等位變體，齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì))。具有催化活性的截短的酶實(shí)例在Monchois等，1999中報(bào)道。具體而言，信號(hào)肽和Jl^末端高度可變區(qū)對(duì)擁有完全催化活性的齒斑葡勤瞎蔗糖酶蛋白質(zhì)而言不需要。具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)是能夠催化從蔗糖合成齒斑葡IMt的活性酶，其中該蛋白質(zhì)由僅編碼保守催化域(活性核心區(qū))或編碼帶全長(zhǎng)或截短的羧基末端域的活性核心區(qū)的工程化gtfi基因編碼(Monchois等，1999)。已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)體中表現(xiàn)具有催化活性的截短的齒斑葡聚其與在基因《務(wù)飾植物分別合成的改性淀^^目比，進(jìn)一步得以改良。因此，本發(fā)明的又一個(gè)目的是基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物，其飾野生型植物合成的淀粉相比，該基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物分別合成改性淀粉。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)，，定義為酶，其至少包含天然存在的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的活性核心區(qū)的氛基酸?；钚院诵膮^(qū)的^J^酸序列或可以包含編碼活性核心區(qū)的^J^酸序列并額外包含選自如下的M酸序列a)構(gòu)成全長(zhǎng)或截短的可變區(qū)的M酸序列，b)構(gòu)成全長(zhǎng)或截^T時(shí)^^^端域時(shí)Jt^^^^列l(wèi)"一c)構(gòu)成截短的羧基末端域的氨基酸序列和構(gòu)成全長(zhǎng)的可變區(qū)的JL^紗列。d)構(gòu)成全長(zhǎng)羧基末端域的氨基酸序列和構(gòu)成截短的可變區(qū)的氨基酸序列。e)構(gòu)成截短的羧基末端域的氨基酸序列和構(gòu)成截短的可變區(qū)的M醋列，葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)，在其中已缺部編碼羧基末端域的失全JL^酸序列。氨基酸序列并額外地包含編碼可變區(qū)的氨基酸序列.又一個(gè)優(yōu)選的具有催化活性的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)包含活性核心區(qū)的M酸序列和可變區(qū)的部分。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"活性核心區(qū)"還定義為至少包含這樣的列的蛋白質(zhì)，該^J^酸序列與SEQIDNO:4中從位置109至1012所確定的核心區(qū)M酸序列具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%并且仍更優(yōu)選地至少95%的同一性。列，其與SEQIDNO:4中所確定的M酸序列具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%并且特別更優(yōu)選地至少95%的同一性。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"理解為意指這樣的分子，其或者非天然或非基因修飾的野生型植物內(nèi)，或其位于非基因修飾的野生型植物細(xì)胞或非基因修飾的野生型植物基因組中的該分子非天然存在的位置內(nèi).與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"重組，，意指由不同元件組成的核酸分子、在植物細(xì)胞或植物中非天然存在的組合或具體空間排列。大量技術(shù)可用于將DNA導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括使用根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)以T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、注射、DNA電穿孔、通過(guò)生物射彈法導(dǎo)入DNA以及其它任何可能技術(shù)。土壤桿菌介導(dǎo)性植物轉(zhuǎn)化的用途已經(jīng)得到充分研究并且在EP120516;Hoekema于TheBinaryPlantVectorSystemOffsetdrukkerijKantersB.V.，Alblasserdam(1985)，第五章；Fraley等，Crit.Rev.PlantSci.4，l-46中并且由An等EMBOJ.4,(1985)，277-287充分描述。對(duì)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，例如見Rocha-Sosa等，EMBOJ.8，(1989)，29-33。借助基于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的栽體對(duì)單子葉植物的轉(zhuǎn)化也已經(jīng)得到描述(Chan等，PlantMol.Biol.22，(1993)，491-506;Hiei等，PlantJ.6,(1994)271-282;Deng等，ScienceinChina33，(1990)，28-34;Wilmink等，PlantCellReports11，(1992)，76-80;May等，Bio/Technology13，(1995),486-492;Conner和Domisse，Int.J.PlantSci.153(1992)，550-555;Ritchie等，TransgenicRes.2,(1993)，252-265)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的備選系統(tǒng)是通過(guò)生物射彈法的轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，PlantPhysiol.104，(1994)，37-48;Vasil等，Bio/Technology11(1993),1553-1558;Ritala等，PlantMol.Biol.24，(1994)，317-325;Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990),625-631)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、已部分預(yù)透化的細(xì)胞的電穿孔及通it^璃纖維導(dǎo)入DNA。玉米的轉(zhuǎn)化尤其已經(jīng)在文獻(xiàn)中多次描述(參考例如WO95/06128,EP0513849,EP0465875,EP0292435;Fromm等，Biotechnology8，(1990),833-844;Gordon曙Kamm等，PlantCell2，(19卯)，603-618;Koziel等，Biotechnology11(1993)，194-200;Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(19卯)，721-726)。對(duì)其它類型谷物的成功轉(zhuǎn)化也已經(jīng)描述，例如對(duì)大麥的轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，見如上；Ritala等，見如上；Krens等，Nature296，(1982)，72-74)和對(duì)小麥的轉(zhuǎn)化(Nehra等，PlantJ.5，(1994)，285-297)。以上全部方法適于本發(fā)明。在本發(fā)明中，導(dǎo)入的核酸可以整合至植物細(xì)胞的核基因組或質(zhì)體基因組中。轉(zhuǎn)染質(zhì)體的經(jīng)典方法涉及以攜帶DNA分子的微拋射體轟擊葉子(Svab等，1993)。如今，穩(wěn)定的質(zhì)體轉(zhuǎn)染常規(guī)在煙草(N.tabaccum)上開展(Svab和Maliga，1990;Svab等，1993)。最近在稻(Khan和Maliga，1999)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Sikdar等，1998)、馬鈴薯(Sidorov等，1999)、甘藍(lán)型油菜(colza)(WO00/39313)、番茄(tomato)(Ruf等，2001)和大豆(soybean)(WO04/053133)中取得逸艮。用于得到轉(zhuǎn)原質(zhì)體性植物的方法已經(jīng)在專利申請(qǐng)WO04/055191中描述。除此之外，本發(fā)明的植物細(xì)胞和本發(fā)明的植物可以分別與野生型植物細(xì)胞或野生型植物區(qū)分，因?yàn)樗鼈兒兄辽僖粋€(gè)拷貝穩(wěn)定整合至其基因組的外來(lái)核酸分子(轉(zhuǎn)基因)，其編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)或具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明的植物細(xì)胞和本發(fā)明的植物可以通過(guò)如下特征優(yōu)選地分別與野生型植物細(xì)胞或野生型植物區(qū)分本發(fā)明的植物細(xì)胞或本發(fā)明的植物具有所導(dǎo)入核酸分子的轉(zhuǎn)錄物，這些轉(zhuǎn)錄物可以例如通過(guò)Northern印跡分析或通過(guò)RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行驗(yàn)證。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物細(xì)胞和本發(fā)明的植物含有由導(dǎo)入的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。這可以通過(guò)免疫學(xué)方法例如尤其通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)。另外，本發(fā)明的植物細(xì)胞和本發(fā)明的植物可以通過(guò)它們合成齒斑葡聚糖這個(gè)特征更優(yōu)選地分別與野生型植物細(xì)胞或野生型植物區(qū)分。本發(fā)明的植物細(xì)胞或本發(fā)明的植物優(yōu)選地在其質(zhì)體內(nèi)產(chǎn)生齒斑葡聚糖。術(shù)語(yǔ)"與野生型植物細(xì)胞所合成的淀粉相比的改性淀粉"或"改性淀粉"或"改變的淀粉"意指這樣的淀粉，當(dāng)與野生型植物中合成的淀粉相比，其在物理化學(xué)性質(zhì)、糊化特性、淀粉顆粒的大小和/或形狀方面不同。與野生型淀粉相比，該淀粉尤其在其祐度和/或此淀粉膠的:^形成特性和/或增加的凝膠穩(wěn)定性和/或其受消化能力和/或顆粒形態(tài)學(xué)方面經(jīng)過(guò)改良。黏度方面的改良可以通過(guò)數(shù)種手段并且尤其通過(guò)ThermoHaake驗(yàn)電器(ThermoElectronCooperation)或通過(guò)快速黏度分才斤儀(RVA)例如RapidViscoAnalyserSuper3(NewportScientificPtyLtd,InvestmetSupportGroup,WarriewodNSW2102，澳大利亞>^據(jù)制造商說(shuō)明書測(cè)量。祐度值根據(jù)制造商操作手冊(cè)以厘泊Centipoise(cP)表示，該操作手冊(cè)引入本說(shuō)明書作為參考。通過(guò)快速祐度分析儀(RVA)測(cè)定勦度特征的優(yōu)選方式以及用于比較不同樣本的參數(shù)在本發(fā)明一般方法(方法l)中描述。通過(guò)ThermoHaake驗(yàn)電器測(cè)定祐度測(cè)定曲線的另一個(gè)優(yōu)選方式在本發(fā)明一般方法(方法2)中描述。淀粉膠的^形成特性(或凝膠強(qiáng)度)的測(cè)定和/或^穩(wěn)定性可以通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀例如質(zhì)構(gòu)儀TA-XT2(StableMicroSystems-Surrey,UK)根據(jù)制造商操作手冊(cè)測(cè)定，該操作手冊(cè)引入本說(shuō)明書作為參考。一般方法(方法3)中描述。受消化能力可以使用EnglystH.N.等，EuropeanJournalofClinicalNutrition4,Suppl.2，S"-S50的方法學(xué)(在本說(shuō)明書中引入作為參考)，通過(guò)測(cè)定已消化淀粉的百分?jǐn)?shù)確定，所述方法學(xué)基于抗性淀粉rsm型的測(cè)定，該淀粉是例如通過(guò)熱處理和/或酶處理得到并隨后回生的不可消化的回生淀粉。Englyst的方法可隨WO00/02926(在本說(shuō)明書中引入作為參考)中關(guān)于測(cè)定rs含量的信息進(jìn)行調(diào)整。得到的方法在本發(fā)明一般方法(方法4)中描述。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物，其特比，具有增加的T-起始溫度、和/或增加的最小黏度、和/或增加的終祐度和/或改變的顆粒形態(tài)學(xué)的改性淀粉。在本發(fā)明中，T-起始溫度、最小黏度和終祐度可以通過(guò)驗(yàn)電器，尤其是ThermoHaake驗(yàn)電器或快速祐度分析儀確定。優(yōu)選的方法在本發(fā)明一般方法(方法1和2)中描述。本發(fā)明的又一個(gè)目的是基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物，其特征在物所合成的淀粉相比，具有增加的T-起始溫度和/或改變的顆粒形態(tài)學(xué)和/或增加的最小黏度和/或增加的終黏度。優(yōu)選地，在基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物表現(xiàn)出成熟齒斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性時(shí)，T-起始溫度的增加為至少0.5。/。，并且在基因修飾植物性時(shí)，其為至少0.5%、優(yōu)選為至少1%、更優(yōu)選為至少1.5%、最優(yōu)選為至少2%。優(yōu)選地，在基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物表現(xiàn)出成熟齒斑葡^t蔗糖酶的酶活性時(shí)，最小私度增加為至少5%、優(yōu)選為10%、并且在基因修的酶活性時(shí)，其為至少10%、優(yōu)選為至少40%、更優(yōu)選為至少70%、最優(yōu)選為至少100%。優(yōu)選地，在基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物表現(xiàn)出成熟齒斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性時(shí)，終祐度的增加為至少1.5%、優(yōu)選為3%，并且在基因酶的酶活性時(shí)，其為至少3%、優(yōu)選為至少25%、更優(yōu)選為至少45%、最優(yōu)選為至少65%。在本發(fā)明中，淀粉顆粒形態(tài)學(xué)可以如本發(fā)明一般方法(方法5)中所描述通過(guò)光學(xué)顯微鏡法(LM)和掃描電子顯微鏡法(SEM)確定。在本發(fā)明中，具有改變的顆粒形態(tài)學(xué)的淀粉可以定義為具有多于5%變異淀粉顆粒的淀粉。在本發(fā)明中，變異淀粉顆粒定義為當(dāng)與野生型植物細(xì)胞所合成的淀粉顆粒的絕大多數(shù)相比時(shí)，顯示出形狀不常見的淀粉顆粒。作為實(shí)例，變異淀粉顆粒是具有凸起形態(tài)的淀粉顆粒、具有侵蝕的形態(tài)的淀粉顆粒、與較大淀粉顆粒結(jié)合的小淀粉顆粒、表面具有孔洞的淀粉顆粒和/或具有^Mt^面或不平整表面的淀粉顆粒。的淀粉顆粒分別相比，分離自本發(fā)明基因^^植物細(xì)胞或基因修飾植物的淀粉顆粒中優(yōu)選多于10%、更優(yōu)選多于15%并且仍更優(yōu)選多于20%顯示改變的形態(tài)學(xué)，其中該修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物表現(xiàn)出成熟齒斑葡聚糖性。此外，本發(fā)明涉X^因修飾植物細(xì)胞或本發(fā)明基因修飾的植物，其特征在于與野生型植物細(xì)胞或野生型植物所合成的淀粉相比，該植物細(xì)胞或該植物分別合成凝膠強(qiáng)度增加的改性淀粉。在本發(fā)明中，淀粉的凝膠強(qiáng)度(或膠的凝膠形成特性)可以通過(guò)本發(fā)明一般方法(方法3)中所述方法測(cè)量。優(yōu)選地，在基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物表現(xiàn)出成熟的或具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的酶活性時(shí)，凝膠強(qiáng)度增加10%-600%、優(yōu)選20%-500%、更優(yōu)選25%-400%并且最優(yōu)選30%-300%,性的本發(fā)明基因修飾植物細(xì)胞或本發(fā)明基因修飾植物合成齒斑葡聚糖與之結(jié)合的新型淀粉顆粒。如一般方法(方法5)中所公開，齒斑葡聚糖對(duì)淀粉的結(jié)合可以通過(guò)以赤蘚紅紅色染色試劑對(duì)淀粉顆粒染色而觀察到?？谇粚＜页Ｒ?guī)地使用此染色反應(yīng)以證實(shí)齒菌斑的存在。因此，本發(fā)明的又一個(gè)目的是在其質(zhì)體中表現(xiàn)出具有催化活性的截短植物，葡聚糖與之結(jié)合的淀粉顆粒。本發(fā)明的優(yōu)選目的是表現(xiàn)出齒斑葡彩瞎蔗糖胡&囡^務(wù)禍枯缺紐始,盡.本發(fā)明基因{務(wù)飾植物，其分別的淀粉顆粒，其中所述的淀粉顆?？捎贸嗵\紅紅色染色試劑染色。此外，本發(fā)明涉及使轉(zhuǎn)基因整合至其基因組的本發(fā)明基因修飾植物細(xì)胞或本發(fā)明基因修飾植物，所述轉(zhuǎn)基因包含如下以功能性方式彼此連接的處于轉(zhuǎn)錄方向的序列-啟動(dòng)植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，國(guó)編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)或編碼具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的異源核^_序列，以及-任選地在植物細(xì)胞中有活性的終止序列.與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"齒斑葡聚糖蔗糖酶基因"將理解為編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸序列。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"截短的齒斑葡絲蔗糖酶基因"將理解為編碼具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸序列。以包含僅編碼活性核心區(qū)的核酸序列或可以包含編碼活性核心區(qū)的核,列和編碼選自如下氨基酸序列的額外核酸序列a)構(gòu)成全長(zhǎng)或截短的可變區(qū)的M酸序列，b)構(gòu)成全長(zhǎng)或截短的g末端域的^^酸序列，c)構(gòu)成截短的g末端域的^^酸序列和構(gòu)成全長(zhǎng)可變區(qū)的#^,列。d)構(gòu)成全長(zhǎng)g末端域的M酸序列和構(gòu)成截短的可變區(qū)的^J^^列。e)構(gòu)成截短的羧基末端域的JL^酸序列和構(gòu)成截短的可變區(qū)的氣基酸序列。其與如SEQIDNO.3中所確定的核酸序列具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少卯％并且特別優(yōu)選地至少95%的同一性。此外，本發(fā)明涉及使轉(zhuǎn)基因整合至其基因組的本發(fā)明基因修飾植物細(xì)胞或本發(fā)明基因修飾植物，該轉(zhuǎn)基因包含如下以功能性方式彼此連接的處于轉(zhuǎn)錄方向的序列-啟動(dòng)植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，-編碼具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的異源核^列，以及-任選地在植物細(xì)胞中有活性的終止序列，之結(jié)合的淀粉。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"基因組"將理解為意指植物細(xì)胞中存在的4^遺傳物質(zhì).本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，除了細(xì)胞核以外，其它區(qū)室(例如質(zhì)體、線粒體)也含有遺傳物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因整合至植物細(xì)胞的細(xì)胞核。因此，將齒向特定細(xì)胞區(qū)室如質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)可以通過(guò)利用以目的細(xì)胞區(qū)室為靶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽實(shí)現(xiàn)。編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列插在編碼序列的前部。編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列可以衍生自編碼在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)并轉(zhuǎn)運(yùn)至目的細(xì)胞區(qū)室的蛋白質(zhì)的任意核酸序列。轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以通過(guò)將編碼特定多肽的信使RNA與成熟蛋白質(zhì)的M酸序列比較加以確定。成熟蛋白質(zhì)中缺少并由對(duì)應(yīng)信使RNA從起始密碼子(通常是甲硫氨酸)處開始編碼的^J^酸序列通常是轉(zhuǎn)運(yùn)肽，或通常含有轉(zhuǎn)運(yùn)肽。技術(shù)人員將能夠使用預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的程序例如Chloro1.1服務(wù)器(EmanuelssonO.等，1999，ProteinScience:8:978-984)確定編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。轉(zhuǎn)運(yùn)肽是能夠指導(dǎo)連接至轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)1目的細(xì)胞區(qū)室的#^酸序列并且可以是完整的天然存在(野生型)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽、其功能性片段、其功能性突變體或嵌合轉(zhuǎn)運(yùn)肽，在嵌合轉(zhuǎn)運(yùn)肽中至少兩種轉(zhuǎn)運(yùn)肽以功能性方式彼此結(jié)合或不同轉(zhuǎn)運(yùn)肽的部分以功能性方式彼此結(jié)合。這種嵌合轉(zhuǎn)運(yùn)肽作為優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽在EP0508909和EP0924299中報(bào)道。編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列可以是相對(duì)于編碼與之融合的酶的核酸序列而言為異源的，這意味著編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列和編碼待靶向^X質(zhì)體的酶的核^列源自于不同基因，而基因還可以源自不同物種。將專用于使酶靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽稱作質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中酶與轉(zhuǎn)運(yùn)肽翻譯性地連接。本發(fā)明還涉及使核酸構(gòu)建體^^至其基因組的本發(fā)明基因修飾植物細(xì)胞或本發(fā)明基因修飾植物，該核酸構(gòu)建體包含以功能性方式彼此連接的處于轉(zhuǎn)錄方向的如下序列-啟動(dòng)植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，-異源核酸序列，其編碼與之翻譯性融合的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，蔗糖酶蛋白質(zhì)的異源核^列，以及-任選地在植物細(xì)胞中有活性的終止序列。術(shù)語(yǔ)"以功能性方式彼此連接，，意指核酸構(gòu)建體的元件彼此以允許編碼區(qū)得以表達(dá)的方式連接。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"翻譯性融合"應(yīng)當(dāng)意指以如此方式融合核酸序列以至于它們代表在轉(zhuǎn)錄時(shí)引起單個(gè)信使RNA產(chǎn)生的單個(gè)可讀框，該信使RNA在翻譯時(shí)即編碼單個(gè)蛋白質(zhì)。質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可選自編碼蠟質(zhì)蛋白(K16sgen等，MolGenGenet.217(1989),155-161)、二磷酸核酮糖羧化酶小亞基(Wolter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)，846-850;Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.10USA91(1994)，12760-12764)、NADP蘋果^^氫酶(Gallardo等，Planta197(1995)，324-332)、谷胱甘艦原酶(Creissen等，PlantJ.8(1995),167-175)、EPSPS(US5，188,642)基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及EP0508909和EP0924299中所述的優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽。這些實(shí)例是非限制性的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼鐵氧還蛋白還原酶基因的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列(Pihm等，1995)與編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)或具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸序列翻譯性融合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼EP0508909和EP0924299中所述的譯性融合。技術(shù)人員眾所周知用于構(gòu)建本發(fā)明核酸構(gòu)建體的技術(shù)。作為非限制性的實(shí)例，可能提到Sambrook等(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第三版(2001)ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NY.ISBN:0879695773)和Ausubel等(ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWHey&Sons;第五版(2002)，ISBN:0471250929)中所述的技術(shù)。此外，含有本發(fā)明植物細(xì)胞的植物和/或其后代也是本發(fā)明的主題。這種類型的植物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如R.D.Hall編輯的"plantCellPlantProtocols"1999，HumanaPress，ISBN0-89603畫549-2中所述的方法通過(guò)再生從本發(fā)明的植物細(xì)胞中產(chǎn)生。原則上，>^發(fā)明的植物可以是任意的植物物種，即單子葉植物和雙子葉植物.優(yōu)選地，它們是有用植物，即出于食用或技術(shù)目的，尤其工業(yè)目的由人栽培的植物'在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物是淀粉貯藏植物。術(shù)語(yǔ)"淀粉貯藏植物，，包括具有貯藏淀粉的植物部分的全部植物，例如玉米、稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、木薯、馬鈴薯、西米、綠豆、豌豆或高粱。優(yōu)選的貯藏淀粉的植物部分是例如塊莖、貯藏根和含有胚乳的谷物果實(shí)；尤其優(yōu)選塊莖；特別優(yōu)選馬鈴薯植物的塊莖。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的淀粉貯藏植物，其為馬鈴薯植物。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"馬鈴薯植物，，或"馬鈴薯"意指茄屬(Solamim)的植物物種，尤其是茄屬中產(chǎn)生塊莖的物種并且特別是馬鈴薯(Solamimtuberosum)。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明植物細(xì)胞的本發(fā)明植物的繁殖材料。本文中，術(shù)語(yǔ)"繁殖材料"包括植物中適于通過(guò)營(yíng)養(yǎng)方式或有性方式產(chǎn)生后代的那些部分.例如，插條、愈傷組織培養(yǎng)物、根狀莖或塊莖適用于營(yíng)養(yǎng)繁殖。其它繁殖材料例如包括果實(shí)、種子、幼苗、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物等，優(yōu)選地，繁殖材料是種子并且特別優(yōu)選是塊莖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉;5L^發(fā)明植物的可收獲植物部分，如果實(shí)、貯藏根、花、芽、苗或莖，優(yōu)選地是種子或塊莖，其中這些可收獲部分含有本發(fā)明的植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明基因修飾植物的方法，其中a)用核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述核酸分子包含編碼齒斑葡聚糖蔗糖b)從步驟a)中得到的植物細(xì)胞再生植物，并且c)根據(jù)需要，從步驟b)中得到的植物中產(chǎn)生另外的植物?？梢愿鶕?jù)技術(shù)人員已知的方法從步驟a)中得到的植物細(xì)胞再生完整植物，如使用R.D.Hall編輯的"plantCellPlantProtocols"1999，HumanaPress,ISBN0-89603-549-2中所述的方法.在用于產(chǎn)生本發(fā)明基因修飾植物的優(yōu)選方法中，步驟a)中編碼齒斑葡酸分子與編碼質(zhì)體肽序列的核酸分子翻譯性融合，根據(jù)本發(fā)明方法步驟C)產(chǎn)生另外的植物可以例如通過(guò)營(yíng)養(yǎng)繁殖(例如使用插條、塊莖或借助愈傷組織培養(yǎng)和完整植物的再生)或通過(guò)有性繁殖實(shí)現(xiàn)。本文中，有性繁殖優(yōu)選地在受控條件下發(fā)生，即具有特定特征的所選擇植物與另一植物雜交并繁殖。本發(fā)明還涉及用于根據(jù)如上所公開方法產(chǎn)生基因修飾植物的方法，其中編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)或具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子整合至植物的質(zhì)體基因組。編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子可以來(lái)自任意希望的來(lái)源，更優(yōu)選地，本發(fā)明中所用的核酸分子可以編碼選自鏈球菌細(xì)菌的細(xì)菌性齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)。最優(yōu)選地，本發(fā)明中所用的核酸分子可以編碼來(lái)自汗毛鏈球菌MFe28的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)。編碼具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子可以通過(guò)分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員廣泛已知的方法自任意的編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子產(chǎn)生。適用于產(chǎn)生編碼具有催化活性的截短齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸序列的方法描述于例如Sambrook等(MolecularCloning，ALaboratoryManual，笫三版(2001)ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour，NY.ISBN:0879695773)和Ausubel等(ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons;第五版(2002),ISBN:0471250929)中。這些方法包括但不限突變體，所述方法為限制酶和/或使用位點(diǎn)定向誘變(例如插入提前終止密碼子)和/或PCR擴(kuò)增(例如編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的序列的部分)和/子。本發(fā)明中所用編碼齒斑葡IMt蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子可以分離自例如基因組DNA或DNA文庫(kù)，其來(lái)自任何來(lái)源，優(yōu)選地來(lái)自細(xì)菌。備選地，它們可以通過(guò)重組DNA技術(shù)(例如PCR)或通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。此類分子的鑒定和分離可以通過(guò)^f吏用本發(fā)明的分子或這些分子的部分或者(視情況而定)這些分子的反向互補(bǔ)鏈加以開展，例如通過(guò)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法的雜交(見Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第三版(2001)ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,l^Y.ISBN:0879695773)和Ausubel等(ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons;第五版(2002)，ISBN:0471250929)。作為用于雜交的探針，可以使用完全或基本上含有SEQIDNo.l所示核普酸序列或其部分的核酸分子。用作雜交^:針的片段還可以是通過(guò)常規(guī)^合成方法產(chǎn)生并且其序列與本發(fā)明的核酸分子基4^目同的合成性片段。與本發(fā)明中所用的核酸分子雜交的分子還包括如上所述編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子的片段、衍生物和等位變體.在此上下文中，將片段定義為核酸分子中長(zhǎng)度足以編碼蛋白質(zhì)的部分。在此上下文中，術(shù)語(yǔ)"衍生物"意指與以上所提及核酸分子的序列在一個(gè)或多個(gè)位置處不同的這些分子的序列，并且意指它們與這些序列具有高度同源性。同源性意指至少70%的序列同一性并且仍更優(yōu)選地多于卯％的序列同一性以及最優(yōu)選地多于95%的序列同一性.當(dāng)與以上所述核酸分子比較時(shí)由于缺失、置換、插入或重組可出現(xiàn)偏離。此外，同源性意指在各自核酸分子間或它們編碼的蛋白質(zhì)之間存在功能性和/或結(jié)構(gòu)性等效。與如上所述分子同源并代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變異，其構(gòu)成了具有相同生物學(xué)功能的修飾。這些變異可以是天然存在的變異，例如衍生自其它細(xì)菌的序列，或者突變，因而這些突變可以天然存在或它們可以通過(guò)特定誘變加以導(dǎo)入。另外，變異可以是合成產(chǎn)生的序列。等位變體可以是天然存在和合成產(chǎn)生的變體或通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼齒斑葡*#蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子選自a)核酸分子，其編碼具有SEQIDNO:2所示Jl&酸序列或其部分并具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力的蛋白質(zhì)；b)核酸分子，其編碼其M酸序列與SEQIDNO:2所示M酸序列或其部分具有至少70%的同一性并具有催化從蔗糖合成齒斑葡^l的能力的蛋白質(zhì)；c)核酸分子，其包含SEQIDNO:l中所示核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或者它們的部分，所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或者它們的部分編碼具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力的蛋白質(zhì)d)核酸分子，其核酸序列與a)或c)所述核酸序列具有至少70y。的同一性；e)核酸分子，其核苷酸序列因遺傳密碼子簡(jiǎn)并性而自a)、b)、c)或d)中所確定的核酸分子的序列衍生；以及f)核酸分子，其^f^在a)、b)、c)、d)或e)中所確定的核酸分子的片段、等位變體和/或衍生物。在本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子編碼如此蛋白質(zhì)，其M酸序列與SEQIDNO:2中所確定的M酸序列或其部分具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%并且仍更優(yōu)選地至少95%的同一性并具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力。在另外的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子具有如此序列，其與序列SEQIDNO:NO:l或其部分具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%并且仍更優(yōu)選地至少95%的同一性并編碼具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼具有催化活性的齒斑葡IMt蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子選自a)核酸分子，其編碼具有SEQIDNO:4所示JtJ^酸序列或其部分并具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力；b)核酸分子，其編碼如此蛋白質(zhì)，其M酸序列與在SEQIDNO:4所示#^酸序列或其部分具有至少70%的同一性并具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力；c)核酸分子，其包含SEQIDNO:3中所示核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或者它們的部分，所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或者它們的部分編碼具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力的蛋白質(zhì)；d)核酸分子，其核酸序列與a)或c)所述核酸序列具有至少70。/n的同一性；e)核酸分子，其核苷酸序列因遺傳密碼子簡(jiǎn)并性而自a)、b)、c)或d)中所確定的核酸分子的序列衍生；以及f)核酸分子，其代表在a)、b)、c)、d)或e)中所確定的核酸分子的片段、等位變體和/或衍生物，在本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，編碼具有催化活性的截短的齒斑葡IMt蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子編碼如此蛋白質(zhì)，其M酸序列與SEQIDNO:4中所確定的M酸序列或其部分具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少卯％并且仍更優(yōu)選地至少95%的同一性并具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力。編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子的優(yōu)選部分是如此核酸分子，其編碼與如SEQIDNO:4中從位置109至1012所示M酸序列具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少卯％并且仍更優(yōu)選地至少95%的同一，性。在另外的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼具有催化活性的截短的齒斑葡IMt蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子具有如此核酸序列，其與如SEQIDNO:3所示序列或SEQIDNO:3中從位置325至3036所示序列具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%并且仍更優(yōu)選地至少95%的同一性。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"同一性"將理解為意指與其它蛋白質(zhì)/核酸的氨基i^/核苷酸對(duì)應(yīng)的JL^^/核苷酸數(shù)目，表示為百分?jǐn)?shù)。同一性優(yōu)選地借助計(jì)算;feiL^序通過(guò)將SEQ.IDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或其部分與其它蛋白質(zhì)/核酸比^以確定。當(dāng)相互比較的序列具有不同長(zhǎng)度時(shí)，同一性將以如此方式確定即較短序列與較長(zhǎng)序列共有JL^酸的數(shù)目決定同一性的百分比商。優(yōu)選地，同一性通過(guò)眾所周知并iU^眾可獲得的計(jì)算^4呈序ClustalW(Thompson等，NucliecResearch22(1994)，4673-4680)確定。德國(guó)海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Meyerhofstrasse1，D69117)的JulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibsonfGibson@EMBL-Hddelberg.DEHtClustalW可/〉開地獲得。ClustalW還可以從不同因特網(wǎng)址上下栽，包括IGBMC(InstitutdeG6n6tiqueetdeBiologieMol6culaireetCellulaire，B.P.163,67404IllkirchCedex，法國(guó)；ftp:〃ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftD:〃ftt).ebi.ac.uk/Dub/software/)以及從EBI(EuropeanBioinformaticsInstitute,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton，CambridgeCB101SD，UK)的全部鏡像因特網(wǎng)址上下載。優(yōu)選地使用ClustalW計(jì)算M序1.8版確定本發(fā)明的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)之間的同一性。在實(shí)施中，必須設(shè)置如下參數(shù)KTUPLE-l，TOPDIAG=5，WINDOW=5,PAIRGAP=3,GAPOPEN=10，GAPEXTEND-0.05,GAPDIST=8，MAXDIV=40，MATRIX-GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。優(yōu)選地使用ClustalW計(jì)算M序1.8版確定例如本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列與其它核酸分子的核苷酸序列之間的同一性。在實(shí)施中，必須設(shè)置如下參數(shù)KTUPLE=2,TOPDIAGS=4,PAIRGAP=5，DNAMATRIX:IUB，GAPOPEN-10,GAPEXT=5，MAXDIV-40,TRANSITIONS:枯權(quán)。此外，同一性意思是指在所涉及的核酸分子或由它們編碼的蛋白質(zhì)之間存在功能性和/或結(jié)構(gòu)等效。與上述分子同源并且構(gòu)成這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變異，其構(gòu)成執(zhí)行相同生物學(xué)功能的修飾。為此目的，修飾在不參與酶活性的氨基酸殘基上進(jìn)行。與此同時(shí)，這些變異可天然發(fā)生，例如它們可以是來(lái)自另一些細(xì)菌物種的序列，或它們可以是突變，其中這些突變可能以天然方式存在或已經(jīng)通過(guò)目標(biāo)誘變導(dǎo)入。這些變異還可以是合成產(chǎn)生的序列。等位變異體既可以是天然存在的變體，也可以^1合成產(chǎn)生的變異體或通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。因遺傳密生物。一'二、二、，h'"本發(fā)明的主題還是如此核酸分子的用途，其編碼齒斑葡聚糖蔗糖S^密碼子的簡(jiǎn)并性而不同于以上所提及核酸分子的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及具有如此序列的核酸分子的用途，該序列與以上所提及的核酸分子之一的部分或全部互補(bǔ)。為表達(dá)上述核酸分子，這些核酸分子優(yōu)選地與確保在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)序列連接。具體而言，這些核酸分子包含啟動(dòng)子.通常，在植物細(xì)胞中有活性的任意啟動(dòng)子均適用于表達(dá)。與此同時(shí)，可以選擇啟動(dòng)子以侵/ft^達(dá)組成型^L生或僅在某種組織內(nèi)、在植物發(fā)育某個(gè)階段或在由外界影響所決定的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。啟動(dòng)子可以是對(duì)于植物和核酸分子而言是同源或異源的，適宜啟動(dòng)子是例如以下的啟動(dòng)子用于組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒35SRNA的啟動(dòng)子和來(lái)自玉米遍在蛋白的啟動(dòng)子、用于在馬鈴薯中塊莖特異性表達(dá)的patatin啟動(dòng)子B33(Rocha-Sosa等，EMBOJ.8(1989)，23-29)，或確保僅在光合作用活躍的組織中表達(dá)的啟動(dòng)子如ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987)，7943-7947;Stockhaus等，EMBOJ.8(1989)，2445-2451)，或來(lái)自小麥的用于胚乳特異性表達(dá)的HMG啟動(dòng)子、USP啟動(dòng)子、菜豆蛋白啟動(dòng)子、來(lái)自玉米的玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子(Pedersen等，Cell29(1982)，1015-1026;Quatroccio等，PlantMol.Biol.15(19卯),81-93)、谷蛋白啟動(dòng)子(Leisy等，PlantMol.Biol.14(1990)，41-50;Zheng等，PlantJ.4(1993)，357-366;Yoshihara等，F(xiàn)EBSLett.383(1996),213-218)或shrunken-1啟動(dòng)子(Werr等，EMBOJ.4(1985)，1373-1380)。然而，還可使用僅在由外界影響決定的時(shí)間內(nèi)活化的啟動(dòng)子(參見例如WO9307279)。在本文中，允許簡(jiǎn)單誘導(dǎo)的熱休克蛋白的啟動(dòng)子特別有用。此外，還可使用種子特異性啟動(dòng)子，如確保在蠶豆(ViciaFaba)和另一些植物中表達(dá)的來(lái)自蠶豆的USP啟動(dòng)子(Fiedler等，PlnatMol.Biol.22(1993)，669-679;Baumlein等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。如果本發(fā)明的核酸構(gòu)建體整合至植物細(xì)胞的質(zhì)體基因組，則可使用在植物細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)有活性的啟動(dòng)子。在植物細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)有活性的啟動(dòng)子當(dāng)中，特別提到的是例如編碼PSII的Dl多肽的psbA基因(Staub等1993EMBOJournal12(2):601-606),以及調(diào)節(jié)核糖體RNA操縱子的組成型Prrn啟動(dòng)子(Staub等1992PlantCell4:39-45)。此外，可以存在終止序列(聚腺苷酸化信號(hào))，其用于向轉(zhuǎn)錄物添加聚腺苷^c。聚腺苷^具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的功能，這種類型的元件描述于文獻(xiàn)(參考Gielen等，EMBOJ.8(1989)，23-29)中并且可以隨意交換。通過(guò)用于產(chǎn)生本發(fā)明植物的方法可得到的本發(fā)明植物是本發(fā)明的又一實(shí)施方案.此外，本發(fā)明涉及栽體，特別是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和遺傳工程中常見的其它栽體，其含有以上提及的編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)或具有催化活性的截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子。此類栽體優(yōu)選地是可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的栽體.更優(yōu)選地，它們?cè)试S本發(fā)明的核酸分子整合至植物細(xì)胞的核基因組或質(zhì)體基因組，其根據(jù)需要與側(cè)翼調(diào)節(jié)序列組合。實(shí)例是可以在土壤桿菌介導(dǎo)性基因轉(zhuǎn)移中使用的雙元栽體，例如pBIN20雙元栽體(Hennegan和Danna，1998)?？梢杂糜谥苯淤|(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體實(shí)例在WO04/055191中給出。包含待導(dǎo)入植物的異源核酸分子的質(zhì)粒還可以含有選擇標(biāo)記或報(bào)^t^因或含有這兩者以促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定和選擇。備選地，選擇標(biāo)記可以由獨(dú)立的載體攜帶并用于共轉(zhuǎn)化方法。選擇標(biāo)記和報(bào)逸基因均可以具有側(cè)翼分布的使得在植物中表達(dá)的適宜調(diào)節(jié)序列。有用的選擇標(biāo)記和報(bào)逸基因在本領(lǐng)域眾所周知并且包括例如抗生素和除草劑抗性基因、編碼/3-葡糖醛酸糖苷酶(Staub等，1993)或綠色熒光蛋白(Sidorov等，1999)的基因。此類基因的具體實(shí)例,〉開于Weising等，1988，Svab等，1993，White等，NucleicAcidRes.18(4):1062中。通過(guò)使用編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)或具有催化活性的截短的齒斑葡^t蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子，現(xiàn)在有可能通過(guò)重組DNA技術(shù)以迄今不可能的方式干預(yù)植物細(xì)胞或植物的淀粉代謝。因而，淀粉代謝可以以如野生^植物中合成的淀:分別相比r其物理化學(xué)性質(zhì)、糊化)性r淀粉顆粒的大小和/或形狀方面不同的改性淀粉。與野生型淀粉相比，該淀粉尤其在其黏度和/或此淀粉膠的^形成特性和/或M^穩(wěn)定性和/或其受消化能力和/或顆粒形態(tài)學(xué)方面經(jīng)過(guò)改良。本發(fā)明因此還涉及可從本發(fā)明的植物細(xì)胞或本發(fā)明的植物、從本發(fā)明的繁殖材料或從本發(fā)明的可收獲植物部分中得到的改性淀粉。本發(fā)明的又一目的是齒斑葡聚糖與之結(jié)合的本發(fā)明淀粉。本發(fā)明優(yōu)選地涉及齒斑葡聚糖與之結(jié)合的改性淀粉顆粒，其中淀粉顆?？捎贸嗵\紅紅色染色試劑可染色。這種淀粉可從如此的基因修飾植物細(xì)胞或基因修飾植物中得到，其在它們的質(zhì)體中表現(xiàn)具有催化活性的截短的齒斑葡彩瞎蔗糖酶蛋白質(zhì)的活性。優(yōu)選的本發(fā)明淀粉涉及來(lái)自本發(fā)明淀粉貯藏植物例如玉米、稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、木薯、馬鈴薯、西米、綠豆、豌豆或高粱的淀粉。特別優(yōu)選馬鈴薯植物的淀粉。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生改性淀粉的方法，包括從本發(fā)明的植物細(xì)胞、從本發(fā)明的植物、從本發(fā)明的可》1^植物部分或從通過(guò)用于產(chǎn)生本發(fā)明植物的本發(fā)明方法可得到的植物中提取淀粉的步驟。優(yōu)選地，此方法還包括在提取淀粉前收獲栽培的植物和/或此類植物的淀粉貯藏部分的步驟。最優(yōu)選地，該方法還包括在收獲前栽培本發(fā)明植物的步驟。技術(shù)人員已知用于vM4t物或從植物的淀粉貯藏部分提取淀粉的方法。用于從玉米種子中提取淀粉的方法已經(jīng)描述于例如Eckhoff等(CerealChem.73(1996)54-57)中。工業(yè)水平的淀粉提取通常由所謂的濕磨4支術(shù)實(shí)現(xiàn)。此外，用于從多種其它淀粉貯藏植物中提取淀粉的方法已經(jīng)描述于例如"Starch:ChemistryandTechnology"(編者Whistler,BeMiller和Paschall(1994)，第二增補(bǔ)版，AcademicPressInc.LondonLtd;ISBN0陽(yáng)12-746270-8;參見例如笫12章，第412-468頁(yè):Watson編寫的maizeandsorghumstarches:production;第13章，第469-479頁(yè)Corbishley和Miller編寫的tapioca,arrowrootandsagostarches:production;第14章，第479-490頁(yè):Mitch編寫的potatostarch:productionanduses;第15章，第491-506頁(yè)Knight和Oson編寫的wheatstarch:production,modificationanduses;以及第16章，第507-528頁(yè):Rohmer和Klem編寫的ricestarch:productionanduses)中。廣泛用于從植物材料中提取淀粉的裝置是分離器、傾析器、水力旋流器、噴霧干燥器和4tX干燥器。優(yōu)選地，用于制造本發(fā)明改性淀粉的方法包括實(shí)例3中所述的步驟。糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子表達(dá)，故本發(fā)明中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物合成這樣的改性淀粉，其與對(duì)應(yīng)的非基因修飾野生型植物細(xì)胞或非基因修飾野生型植物中所合成的淀粉分別相比，在其物理化學(xué)性質(zhì)、糊化特性、淀粉顆粒的大小和/或形狀方面經(jīng)過(guò)改良。與野生型淀粉相比，該淀粉尤其在其黏度和/或此淀粉膠的^形成特性和/或^穩(wěn)定性和/或其受消化能力和/或顆粒形態(tài)學(xué)方面經(jīng)過(guò)改良。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，使用了用于制造本發(fā)明改性淀粉的方法生產(chǎn)本發(fā)明的改性淀粉。因此，由制造本發(fā)明改性淀粉的方法可得到的改性淀粉也是本發(fā)明的主題。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的改性淀粉是天然淀粉。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"天然淀粉，，意指通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從本發(fā)明的植物、本發(fā)明可收獲的植物部分或本發(fā)明植物的繁殖材料中分離的淀粉。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，淀粉的特性可以例如通過(guò)熱、化學(xué)、酶或^Ofe性衍生作用加以改變。衍生淀粉尤其適于食品和/或非食品領(lǐng)域內(nèi)的不同應(yīng)用。本發(fā)明淀粉比常規(guī)淀粉更適合作為用于制造衍生淀粉的起始材料。因此，本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生衍生淀粉的方法，其中通過(guò)本發(fā)明方法可得到的本發(fā)明改性淀粉得以回溯性衍生。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"衍生淀粉"理解為意指本發(fā)明的改性淀粉，其特征在借助化學(xué)、酶、熱或機(jī)械方法從植物細(xì)胞中分離后已經(jīng)受到改變。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的衍生淀粉是已受熱處理和/或酸處理的淀粉。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，衍生淀粉;iA淀粉醚，尤其是淀粉烷醚、淀粉O-烯丙基醚、淀粉羥烷基醚、淀粉Ol甲基醚、含氮的淀粉醚、含磷酸的淀粉醚或含;克的淀粉醚。在又一個(gè)實(shí)施方案中，衍生淀粉是交聯(lián)淀粉'在又一個(gè)實(shí)施方案中，衍生淀粉是淀粉接枝聚合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，衍生淀粉是氧化的淀粉。在又一個(gè)實(shí)施方案中，衍生淀粉是淀粉酯，特別是使用有機(jī)酸導(dǎo)入淀粉的淀粉酯。特別優(yōu)選地，這些淀粉酯是磷酸酯淀粉、硝酸酯淀粉、硫酸酯淀粉、黃原酸酯淀粉、乙酸酯淀粉或檸檬酸酯淀粉。用于制造本發(fā)明衍生淀粉的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并JU5E常見文獻(xiàn)中充分描述。關(guān)于衍生淀粉制造方面的綜述可以在Orthoefer的(在Corn,ChemistryandTechnology,1987，編者Watson和Ramstad，第16章，479-499)中找到。根據(jù)用于制造衍生淀粉的本發(fā)明，通過(guò)用于產(chǎn)生衍生淀粉的方法可得到的衍生淀粉也是本發(fā)明的主題。本發(fā)明又一實(shí)施方案是本發(fā)明的改性淀粉用于產(chǎn)生衍生淀粉的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物細(xì)胞、本發(fā)明的植物、本發(fā)明植物的可收獲部分或通過(guò)本發(fā)明的方法可得到的植物用于產(chǎn)生改性淀粉的用途。本發(fā)明還涉及核酸分子用于制造本發(fā)明的基因修飾植物細(xì)胞、本發(fā)明的基因修飾植物、本發(fā)明的繁殖材料或本發(fā)明植物的可收獲部分的用途，葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)，此外，編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)或具有催化活性的截短的齒斑葡實(shí)施方案。一般方法:方法1:通過(guò)快速祐度分析儀(RVA)測(cè)定黏度特征2g馬鈴薯淀粉(對(duì)于待使用的其它類型的淀粉或面粉，該值應(yīng)當(dāng)根據(jù)制造商手冊(cè)進(jìn)ffi^整)在25mlH20(VE型水，導(dǎo)電性至少15兆歐)中溶解并在RapidViscoAnalyserSuper3(NewportScientificPtyLtd.,InvestmetSupportGroup,WarriewodNSW2102，澳大利亞)分析中使用.該裝置按照制造商i兌明書^St作.黏度值根據(jù)制造商操作手冊(cè)表示為厘泊(cP)，該手冊(cè)引入本說(shuō)明書作為參考。為測(cè)定淀粉水溶液的勦度，淀粉混懸液首先以960轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?0秒并且隨后在160轉(zhuǎn)/分的攪拌速度下在50°C加熱，最初持續(xù)1分鐘(步驟1)。隨后溫度以每分鐘12。C的加熱i^L從50°C升至95。C(步驟2),溫度在95。C保持2.5分鐘(步驟3)并且隨后以以每分鐘12。C從9S。C冷卻至50。C(步驟4)。在最后步驟中(步驟5)，保持溫度S0。C持續(xù)2分鐘。黏度在整個(gè)持續(xù)期間測(cè)定。在該程序結(jié)束后，移去攪拌器并且蓋上燒杯。膠化的淀粉在室溫溫育24小時(shí)后可用于質(zhì)構(gòu)分沖斤。RVA分析曲線包含顯示用于比較不同測(cè)量值和物質(zhì)的^故。在本發(fā)明上下文中，如下術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)做如下理解1.最大祐度(RVAMax)或峰值勦度將最大祐度理解為意指在溫度曲線的步驟2或3中得到的以cP度量的最高私度值。2.最小黏度(RVAMin)或低谷私度將最小黏度理解為意指在溫度曲線中觀察到最大私度之后的以cP度量的最低黏度值。通常，該值在溫度曲線的步驟3中出現(xiàn)，3.終末勦度(RVAFin)或終祐度將終末黏度(或終祐度)理解為意指在測(cè)量結(jié)束時(shí)觀察到的以cP度量的祐度值。4.消減值(RVASet)所謂的"消減值"通狄曲線中最大黏度之后出現(xiàn)的最小黏度中減去終末黏度而計(jì)算。5.膠化溫度(RVAPT)或T-起始溫度將膠化溫度理解為溫度曲線中黏度在短時(shí)間內(nèi)首次顯著上升的時(shí)間方法2:通過(guò)ThermoHaake驗(yàn)電器測(cè)定祐度測(cè)定曲線來(lái)自2%淀粉混懸液的私度測(cè)定曲線使用ThermoHaake驗(yàn)電器，通it>t1Hz頻率施加小的往復(fù)切變形加以測(cè)定。電流計(jì)配有平行板配列(typC70/1Ti)并且間隙大小是0.1mm。2。/。淀粉-水(w/v)混懸液的成糊曲線如下得到混懸液以2。C/每分鐘的速率從40。C加熱至90。C，保持15分鐘，隨后以2。C/每分鐘的速率冷卻至20°C并在20°C再次保持15分鐘。測(cè)量Tg(膠化溫度或T-起始溫度)、Tp(峰值溫度)和黏度。隨后，從回生的樣品中，在10Pa于60秒內(nèi)增至1.000Pa時(shí)進(jìn)行幅度掃描以檢查測(cè)量值是否處于應(yīng)力和張力的幅度彼此成正比的線性區(qū)域內(nèi)。方法3:通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀TA-XT2測(cè)定淀粉膠的凝膠形成特性。根據(jù)上述方法(方法l)通過(guò)快速私度分析儀(RVA)將樣品在RVA裝置內(nèi)于水質(zhì)混懸液中膠化并1^于室溫在封閉容器內(nèi)貯藏24小時(shí)。樣品在來(lái)自StableMicroSystems(Surrey,UK)的質(zhì)構(gòu)儀TA-XT2的探頭(具有平面的圓形活塞)下固定并使用如下參數(shù)測(cè)定凝膠強(qiáng)度-測(cè)試速度0.5mm/s-插入深度7mm-接觸表面113mm2-壓力2g.方法4:基于抗性淀粉RSIII型的測(cè)量，測(cè)定淀粉的消化性.抗性淀粉RS可以分為如下類型RS1型消化作用不可抵達(dá)的淀粉，例如部分磨碎的植物細(xì)胞(例如在穆茲利中)。RS2型不可消化的顆粒淀粉(淀粉粒)，例如來(lái)自生馬鈴薯、生香蕉等。RS3型例如通過(guò)熱處理和/或酶處理并且隨后回生得到的不可消化的回生淀粉。RS4型例如通過(guò)交聯(lián)或酯化(乙?；?形成的不可消化的化學(xué)改性淀粉?？剐缘矸跼SIII型的確定使用如下步驟得到a)胰酶制劑/淀粉葡糖苷酶(AGS)處理使用的胰酶制劑/淀粉葡糖苷酶消化緩沖液0.1M乙酸鈉pH5.24mMCaCl2酶溶液的制備將12g胰酶制劑(Merck，產(chǎn)品編號(hào)L07130.1000)在80ml脫礦質(zhì)水(導(dǎo)電性大約18兆歐)中于37°C攪拌10分鐘并且隨后3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。離心后得到的54ml上清液以9.86ml脫礦質(zhì)水和0.14ml淀粉葡糖苷酶(6000u/ml，Sigma，產(chǎn)品編號(hào)A-3042)處理。胰酶制劑/淀粉葡糖苷酶(AGS)消化方法對(duì)每批次待測(cè)量的淀粉每次制備5個(gè)胰酶制劑/淀粉葡糖苷酶(AGS)消化分析體系。隨后將無(wú)酶溶液添加至這5個(gè)分析體系的兩個(gè)當(dāng)中。將添加無(wú)酶溶液的分析體系設(shè)定為參考并用于測(cè)定回收率。剩余的三個(gè)分析體系i殳定為樣品，隨后以酶溶液處理并用于測(cè)定RS含量。平行處理多個(gè)不含淀粉的反應(yīng)容器(空白樣品)。這些不含淀粉的空白樣品用于測(cè)定共沉淀物質(zhì)(蛋白質(zhì)、鹽)的量。測(cè)量50ml反應(yīng)容器(Falcon管)的自重并且隨后在每一例子中稱量;^在大約200mg淀粉。將15ml乙酸鈉緩沖液添加至每份線性水不溶性聚+1，4-0-葡聚糖樣品及空白樣品中，并且將20ml乙酸鈉緩沖液添加至每一參考內(nèi)(見如上)。將這些樣品預(yù)溫至37。C。通過(guò)添加5ml酶溶液至樣品及空白樣品的各個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)啟動(dòng)反應(yīng)，隨后反應(yīng)容器在37°C(200轉(zhuǎn)/分)振蕩2小時(shí)。通過(guò)添加5ml水醋酸(平衡至pH3.0)和80ml工業(yè)級(jí)乙醇至樣品、空白樣品和參考內(nèi)終止反應(yīng)。室溫已終止的反應(yīng)分析體系溫育1小時(shí)，從反應(yīng)混合物中沉淀淀粉。沉淀(在2500xg離心10分鐘)后，各分析體系的沉淀以80%乙醇洗滌兩次以除去短鏈葡聚糖并且在冷卻至-70。C后凍干。樣品再次稱重并且重量差用于計(jì)算RS"重量"含量。b)測(cè)定RS含量如下方法用于測(cè)定各個(gè)批次水不溶性淀粉的RS含量a)測(cè)定各個(gè)樣品批次淀粉的水含量(1120重量)。b)對(duì)各樣品(RGP重量)、參考(RGR重量)和空白樣品(RGB重量)測(cè)定各反應(yīng)容器的自重。c)稱量大約200mg水不溶性淀粉加至用于樣品(P重量)和參考(R重量)的各個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)。d)對(duì)樣品(Ptr重量-P重量-H20重量)和參考(Rtr重量-P重量-H20重量)計(jì)算重量的干燥部分。e)各樣品和空白樣品的酶消化。參考以相同方式處理，但不添加酶溶液。f)在進(jìn)行如e)中所述的處理后，沉淀、離心沉淀、洗滌和凍干在樣品、參考和空白樣品反應(yīng)容器內(nèi)存留的物質(zhì).g)在進(jìn)行如f)中所述的處理后，將包括反應(yīng)容器在內(nèi)的樣品(PRG重量)、參考(RRG重量)和空白樣品(BRG重量)反應(yīng)容器內(nèi)存留的物質(zhì)稱重。h)在進(jìn)行如f)中所述的處理后，計(jì)算如下^^應(yīng)容器內(nèi)留存的物質(zhì)重量樣品(Pnv重量-PRG重量-RGP重量)，參考(Rnv重量-RRG重量-RGR重量)及空白樣品(Bnv重量-BRG重量-RGB重量)。i)在進(jìn)行如f)中所述的處理后，測(cè)^應(yīng)容器內(nèi)留存物質(zhì)的水含量樣品(H20Pnv重量)，參考(H20Rnv重量)及空白樣品(H20Bnv重量)。j)在進(jìn)行如f)中所述的處理后，計(jì)算如下>^應(yīng)容器內(nèi)留存物質(zhì)的千燥部分樣品(Pnvtr重量=Pnv重量-H2OPnv重量)參考(Rnvtr重量=Rnvff-H2ORnv重量)及空白樣品(Bnvtr重量=Bnv-H2OBnv重量)。k)對(duì)如下項(xiàng)測(cè)定校正的重量樣品(Pnvkorr重量-Pnvtr重量-Bnvtr重量)及參考(Rnvkorr重量-Rnvtr重量-Bnvtr重量)1)相對(duì)于樣品起始量的干重，計(jì)算酶消化后經(jīng)校正的存留的水不溶性淀粉重量百分?jǐn)?shù)(RSaP-Pnvkorr重量/Ptr重量x100)并相對(duì)于參考起始量的干重，計(jì)算酶消化后參考中經(jīng)校正的存留的水不溶性淀粉重量百分?jǐn)?shù)(RSaR-Rnvkorr重量/Rtr重量x100)。m)測(cè)定酶消化樣品后留存的水不溶性淀粉百分?jǐn)?shù)的平均值(RSaPMW=nxRSaP/n)并測(cè)定參考中存留的水不溶性淀粉百分?jǐn)?shù)的平均值(回收率；RSaRMW=nxRSaR/n)在其中n是對(duì)各批次水不溶性淀粉所實(shí)施的樣品和參考分析的數(shù)目。n)通過(guò)用回收率校正酶消化后留存的水不溶性淀粉百分?jǐn)?shù)的平均值而測(cè)定各批次水不溶性淀粉的RS百分含量(RS=RSaPMW/RSaRMWx100)。方法5:測(cè)定淀粉顆粒的形態(tài)學(xué)特征和物理化學(xué)特征淀粉顆粒形態(tài)學(xué)的分析通過(guò)配置索尼彩色視頻照相機(jī)(CCD-Iris/RGB)的光學(xué)顯微鏡(LM)(Axiophot，德國(guó))和掃描電子顯微鏡(SEM，JEOL6300F，日本)開展。對(duì)于LM,顆粒在可視化前以2x稀釋的Lugol溶液染色。對(duì)于SEM，在銀帶上鋪展并固定在銅盤上的干燥淀粉樣品以20nm柏層包被。隨后用加速電壓1.5-3.5keV操作的掃描電子顯微鏡檢查樣品。工作距離9mm。齒斑葡^t聚合物用LM通過(guò)以10x稀釋的赤蘚紅紅色染色試劑(DisclosingRed-Cote溶液)(AmericanDentalTradingBV，荷蘭)對(duì)淀粉顆粒染色而可視化。齒斑葡聚糖聚合物由作為陽(yáng)性對(duì)照起作用的鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶(變異鏈球菌(Streptococcusmutans)20381、變異鏈球菌6067和遠(yuǎn)緣^l菌(Str印tococcussobrinus)6070的混合物在蔗糖存在下產(chǎn)生(Wiater等，1999).外切葡聚糖酶(o4，3-葡聚糖酶，EC3.2.1.59)由哈茨木霉(Trichodermaharzianum)F隱470產(chǎn)生(Wiater和Szczodrak,2002)。葡聚糖酶測(cè)定用乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中的0.025單位外切葡聚糖酶在10mg(轉(zhuǎn)基因)淀粉存在下于訓(xùn)。C開展站小時(shí)。短暫離心(l分鐘，10，000g)后，棄去上清液并將淀粉顆粒用赤蘚紅紅色染色溶液染色。方法6:SDSPAGE分析齒斑葡聚糖蔗糖酶的活性及染色。蛋白質(zhì)提取物從植物組織中制備。通過(guò)SDSPAGE分離蛋白質(zhì)(大約80將總植物蛋白)，隨后用50mMpH5.3乙酸鈉緩沖液洗滌除去SDS并在50mMpH5.3乙酸鈉、5%(w/v)蔗糖中于37。C溫育M^16小時(shí)，檢測(cè)各個(gè)植物蛋白提取物中的齒斑葡聚糖蔗糖酶活性(Miller和Robyt，AnalyticalBiochemistry156,(1986)，357-363)。與蔗糖溫育后，白色條帶在齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的位置處顯現(xiàn)，原因在于齒斑葡聚糖是水不溶性葡^|。此外，SDS凝膠可以如上所述(方法5)用赤蘚紅紅色染色試劑染色。為進(jìn)一步增強(qiáng)SDSPAGE測(cè)定的敏感性，可以在含有蔗糖的溫育緩沖液中包含葡聚糖T10(約5%至10%),本發(fā)明具體由如下實(shí)例說(shuō)明，這些實(shí)例無(wú)論如何不是限制性的。實(shí)施例l:含有成熟或截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶基因的構(gòu)建體的制備含有patatin啟動(dòng)子(Wenzler等，1989)，來(lái)自白花蠅子草(Silenepratensis)的葉綠體鐵氧還蛋白的信號(hào)肽(FD)(Pilon等，1995)和NOS終止子的表達(dá)盒克隆至pBluescriptSK(pBSSK)質(zhì)粒，得到pPF。來(lái)自汗毛鏈球菌Mfe28的成熟的齒斑葡聚糖蔗糖酶(Gtfl)基因以符合可讀框的方式連接于信號(hào)肽FD和NOS終止子之間。成熟的Gtfl基因使用有校對(duì)作用的PfuturboDNA聚合酶(2.5單位/nl;Stratagene)，以及含有Smal限制性位點(diǎn)的正向引物f5，-AGCTTGCGGCCCCGGGACTGAAAC畫3，)和含有EcoRI限制性位點(diǎn)的反向引物(5'-GTGGTGGTGGAATTCGAGTTAGTTC國(guó)3，、通過(guò)PCR擴(kuò)增并克隆至pPF的Smal/EcoRI限制性位點(diǎn)，得到pPFGtfl。FD和融合的Gtfl基因由Baseclear(荷蘭)在單一方向進(jìn)行完全測(cè)序以^iiM^建體的正確性。pPFGtfl以Xhol消化并連接至pBIN20二元載體(Hennegan和Dairna，1998)，得到pPFI。為構(gòu)建包含截短的Gtfl基因的FD-GtflCAT-NOS融合體，Gtfl基因以含有Smal限制性位點(diǎn)的正向引物(5，-AGCTTGCGGCCCCGGGACTGAAAC-3，、和含有EcoRI限制性位點(diǎn)的反向引物f5，誦AGAAGGAATTCTCATCTTAAACATTGAGGTA-3，)通過(guò)PCR擴(kuò)增并克隆至pPF的Smal/EcoRI限制性位點(diǎn)，得到pPFGtflCAT。測(cè)序并克隆至pBIN20雙元栽體如對(duì)pDFI所述開展，得到pPFICAT。實(shí)施例2:馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)化和再生使用電穿孔法(Takken等，2000)，將pPFI和pPFICAT分別轉(zhuǎn)化至根瘤土壤桿菌菌抹LBA4404。來(lái)自四倍體馬鈴薯基因型栽培變種Kardal(KD)的節(jié)間莖片段用于土壤桿菌介導(dǎo)性轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體在具有含卡那霉素(100mg/l)的MS30培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)的平皿上選擇。對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體繁殖30林形成根的轉(zhuǎn)基因苗并轉(zhuǎn)移至溫室以便塊莖發(fā)育.成熟的塊莖在18周后收獲。轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物系列分別稱作KDIxx和KDICxx，其中I和IC分別指Gtfi和gtfiCAT基因并且xx指克隆號(hào)碼。實(shí)施例3:淀粉分離馬鈴薯塊莖剝皮并在SanamatRotor(Spangenberg，荷蘭)中勻漿。得到的勻漿液于4。C過(guò)夜并將馬鈴薯汁液傾析并貯存于-20。C以表征可溶性齒斑葡IMI聚合物。淀粉沉淀以水洗滌三次并且最終在室溫空氣干燥至少3日。將干燥的淀賴^^碎并在室溫貯藏。實(shí)施例4:使用半定量和實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析對(duì)Gtfl和GtflCAT基因進(jìn)行表達(dá)分析根據(jù)Kuipers等(1994)從所選轉(zhuǎn)基因系的3g(鮮重)馬鈴薯塊莖材料分離RNA。對(duì)于半定量RT-PCR，50將總RNA用DNAseI處理并4吏用Gene-elute哺乳動(dòng)物總RNA試劑盒(Sigma，荷蘭)純化。使用5jig總RNA與500ng引物聚脫氧胸苷(5，-ttttttttttttttttttttttttt-3，)和12.5mM每一dNTP(終體積12pl)在65。C溫育5分鐘開展逆轉(zhuǎn)錄。短暫離心后(30秒；10，000g)，混合物于42。C與4nl的5x第一鏈緩沖液(Invitrogen，荷蘭)及2pl的0.1MDTT溫育2分鐘，加入ljdSuperscriptIIRNA酶H逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/jU;Invitrogen)并且混合物在42。C溫育50分鐘，此后，通it^70°C加熱樣品15分鐘終止反應(yīng)。2.5[UcDNA用于如下所述具有后續(xù)引物/Tm/循環(huán)數(shù)組合的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng).對(duì)于每一組合，優(yōu)化循環(huán)數(shù)以^更保持處于對(duì)數(shù)期。GtflRT引物5，-CCGTGCTTACAGTACCTCAGC-3，和5，-GGTCGTTAGCATTGTAGGTGAAA-3，(Tm=59。C，35個(gè)循環(huán))基于Gtfl基因序列(Ferretti等，1987).Ubi3引物5，-GTCAGGCCCAATTACGAAGA誦3，和5，陽(yáng)AAGTTCCAGCACCGCACTC-3，(Tm-55。C,40個(gè)循環(huán))用作內(nèi)部對(duì)照并且基于馬鈴薯的遍在蛋白核糖體蛋白基因序列(Ubi3)(Garbarino和Belknap，1994)。在眾多轉(zhuǎn)化體上開展RT-PCR，將KDI或KDIC每一系列中的這些轉(zhuǎn)化體基于不同PCR產(chǎn)物的條帶密度分別分為三類。條帶密度與用作內(nèi)部對(duì)照的Ubi3(Garbarino和Belknap，1994)的密度相比較。因此，這些轉(zhuǎn)化體被分為(-)、(+)或(++)三類，其中(-)、(+)和(++)分別代表不可檢測(cè)的、中等水平的和高水平的mRNA。如所預(yù)期，在KD-UT植物中未檢測(cè)到GtflmRNA對(duì)KDI和KDIC系列的不同類別轉(zhuǎn)化體開展其它特征描述。實(shí)施例5:齒斑葡聚糖表^t淀粉顆粒形態(tài)學(xué)、對(duì)齒斑葡聚糖與淀粉的結(jié)合、對(duì)植物形態(tài)學(xué)、塊莖數(shù)和產(chǎn)量的影響。淀粉顆粒的形態(tài)學(xué)如本發(fā)明一般方法(方法5)中所描述通過(guò)SEM和LM測(cè)定。借助兩種手段(SEM和LM)，對(duì)于KDI和KDIC系列觀察到變異淀粉顆粒的存在。圖l顯示通過(guò)掃描電子顯微鏡分析觀察到的與野生型Kardal植物(Kardal)的淀粉相比，所選擇的用成熟的齒斑葡彩瞎蔗糖酶基因(KDI)或截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶基因(KDIC)轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物改性淀粉顆粒形態(tài)學(xué)。對(duì)于KDI系列，淀粉含有形狀不常見的顆粒，具有凸出的形態(tài)以及與大顆粒結(jié)合的小顆粒。對(duì)于KDIC系列，淀粉含有形狀不常見的顆粒，具有受侵蝕的和凸出的形態(tài)。常在顆粒表面觀察到額外的孔洞。對(duì)每一系列如此開展變異淀粉顆粒數(shù)的定量，即對(duì)來(lái)自經(jīng)實(shí)施例4中經(jīng)RT-PCR所定義的(-)、(+)和(++)每一類轉(zhuǎn)化體通過(guò)分析100個(gè)顆粒淀粉^重復(fù)三次進(jìn)行定量。圖2顯示對(duì)非轉(zhuǎn)化植物(KD-UT)、系列KDI的不同類別的轉(zhuǎn)化體[KDI14(-)、KDI30(+)、10)111(++)和10>120(++)以;^10)1<:的不同類別的轉(zhuǎn)化體[KDICl(-)、KDIC22(+)、KDIC14("f+)和KDIC15(++)的變異淀粉顆粒的百分?jǐn)?shù)，對(duì)于由RT-PCR測(cè)定顯示具有中等水平或高水平mRNA的轉(zhuǎn)化體，變異淀粉顆粒百分?jǐn)?shù)為約20%至約30%。對(duì)mRNA水平檢測(cè)不到的轉(zhuǎn)化植物，變異淀粉的頻率為約13%。對(duì)于非轉(zhuǎn)化植物，變異淀粉的頻率為約3%。赤蘚紅染色溶液用于使結(jié)合至淀粉顆粒的齒斑葡聚糖聚合物可視化。作為陽(yáng)性對(duì)照，用該染色溶液可染色齒斑葡IMt聚合物(Wiater等，1999)。有趣地是，齒斑葡^t聚合物以結(jié)合或游離的形態(tài)存在于KDIC系列轉(zhuǎn)化體的淀粉顆粒表面。圖3顯示了存在于KDIC15淀賴^5粒表面的已染色齒斑葡聚糖。對(duì)于KDI系列未觀察到染色(圖3),這與非轉(zhuǎn)化植物相當(dāng)。當(dāng)KDIC轉(zhuǎn)化體淀粉顆粒用外切葡IMt酶溶液處理時(shí)，大部分齒斑葡IWt聚合物從淀粉顆粒解離。這表明結(jié)合^層地存在于淀粉顆粒表面。齒斑葡聚糖聚合物對(duì)KDI淀粉顆粒的不結(jié)合可能是由于產(chǎn)生了具有較低分子量的齒斑葡聚糖聚合物，因而限制它們對(duì)顆粒表面的黏附。對(duì)于KDI和KDIC系列，塊莖數(shù)、產(chǎn)量和植物形態(tài)學(xué)未改變并且與非轉(zhuǎn)化植物相當(dāng)。實(shí)施例7:齒斑葡聚糖表達(dá)對(duì)通過(guò)ThermoHaake驗(yàn)電器所測(cè)量的黏度測(cè)量曲線的影響已經(jīng)使用本發(fā)明一般方法(方法2)中所述的方法，通過(guò)ThermoHaake驗(yàn)電器測(cè)定了來(lái)自淀粉混懸液的黏度測(cè)定曲線，其中所述淀粉混懸液從用成熟的齒斑葡聚糖蔗糖酶Gtfl基因(KDI)或截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶gtficat基因(KDIC)轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物或從野生型Kardal植物(Kardal)得到。下表顯示與野生型Kardal植物(Kardal)的淀粉相比較，提取自所選擇轉(zhuǎn)化體(KDI或KDIC)的淀粉樣品在T-起始溫度、最小(低谷)黏度和終勒度上的增加。Kardal、KDI和KDIC:從2%淀粉溶液中兩次獨(dú)立分析的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實(shí)施例8:齒斑葡聚糖表達(dá)對(duì)膠的凝膠形成特性的影響膠的,形成特性(即凝膠強(qiáng)度)使用一般方法中詳細(xì)說(shuō)明的方法(方法3)對(duì)從用成熟齒斑葡聚糖蔗糖酶Gtfl基因(齒斑葡聚糖蔗糖酶全長(zhǎng)030系)或截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶gtficat基因(齒斑葡聚糖蔗糖酶截短014系、015系、024系)轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物及從野生型Kardal植物(Kardal1和Kardal2)中得到的淀粉混懸液加以測(cè)定。下表顯示與野生型Kardal植物中所提取的淀粉相比，從以成熟或截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶基因轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物中所提取的淀粉樣品皿強(qiáng)度的增長(zhǎng)。凝膠強(qiáng)度(g)齒斑葡聚糖蔗糖酶全長(zhǎng)030系51.0齒斑葡聚糖蔗糖酶截短014系64.0齒斑葡聚糖蔗糖酶截短015系白馬鈴薯93.0齒斑葡聚糖蔗糖酶截短015系棕馬鈴薯73.0齒斑葡聚糖蔗糖酶截短024系48.0KARDAL136.0KARDAL238.0實(shí)施例9:齒斑葡聚糖表M淀粉消化性的影響淀粉的消化性已經(jīng)使用一般方法中詳述的方法(方法4)測(cè)定。該測(cè)量基于Englyst(EuropeanJournalofClinicalNutrition(1992)46(suppl.2)，笫33-50頁(yè))用于測(cè)定抗性淀粉m型的方法并按照WO0002926中關(guān)于測(cè)定RS含量測(cè)定方面的信息加以改進(jìn)。下表顯示，與野生型Kardal植物(Kardal)的淀粉相比，用截短的齒斑葡聚糖蔗糖酶基因(KDIC)轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物中所提取樣品的已消化淀粉百分?jǐn)?shù)降低。已消化淀粉的(平均)百分?jǐn)?shù)(％):15304560120180240300360分鐘Kardal35791521263137KDIC34681319253035Kardal:來(lái)自四個(gè)獨(dú)立測(cè)量值的平均值KDIC:來(lái)自四個(gè)獨(dú)立測(cè)量值的平均值所提及的全部出版物、專利申請(qǐng)和專利在本文中以與每一出版物、專利申請(qǐng)和專利具體且個(gè)別標(biāo)明引用作為參考相等的程度引用作為參考。參考文獻(xiàn)先An等EMBOJ.4,(1985)，277-287頭Baumlein等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467頭Chan等，PlantMol.Biol.22，(1993)，491-506;*vanCleve，J.W.、Schaefer，W.C.和Rist,C.E.1956.J.Am.Chem.Soc.78:4435-4438。*Conner和Domisse,Int.J.PlantSci.153(1992)，550-555女Creissen等，PlantJ.8(1995),167-175*DeVuyst和Degeest1999FEMSMicrobiolRev.23(2):153-77。女Deng等，ScienceinChina33，(1990)，28-34*Eckhoff等，CerealChem.73(1996)54-57*EmanuelssonO.等，1999，ProteinScience:8:978畫984*EnglystH.N.等,EuropeanJournalofClinicalNutrition4，Suppl.2，S33-S50AFerretti等，1987*Fiedler等，PlantMol.Biol.22(1993)，669-679汆Fraley等，Crit.Rev.PlantSc"，1-46士Fromm等，Biotechnology8，(1990),833-844;*FuD,RobytJF(1990)CarbohydrRes183:97-109;*FuD，RobytJF(19卯)ArchBiochemBiophys283:379-387*Garbarino和Belknap,1994汝Gallardo等，(1995)，Planta197，324-332*Gerrits，N.、Turk,S.C.H.J.、vanDun,K.P.M.、Hulleman，S.H.D,、Visser，R.G.F.、Weisbeek,P丄和Smeekens，S,C.M.2001.PlantPhysiol.125:926-934。*016化11等，1989，EMBOJ.8，23-29論Gordon-Kamm等，1990，PlantCell2，603-618;先Hiei等，(1994)，PlantJ.6，271-282*HehreEJ，HamiltonDM,CarlsonAS(1949).JBiolChem177:267-279*He騰gan，K.P.和Daima,K丄(1998).PlantMol.Biol.Rep.16:129-131。*Hoekema，在TheBinaryPlantVectorSystemOffsetdrukkerijKantersB.V.,Alblasserdam(1985)，第五章*JanecekS、SvenssonB、RussellRRB(2000).FEMSMicrobiolLett192:53-57*Jeanes，A.、Haynes,W.C.、Wilham，C.A.、Rankin,J.C.、Melvin，E.H.、Austin,M丄、Cluskey，J.E.、Fisher,B.E.、Tsuchiya,H.M.和Rist，C.E.(1954).J.Am.Chem.Soc.76:5041-5052。*KhanM.S.和MaligaP.(1999).Nat.Biotechnol.17，910-915論K16sgen等(1989),MolGenGenet.217,155-161*Kok-JacobA.、JiQ.、VinckenJP.和VisserRG.(2003)J.PlantPhysiol;160，765-777*KortsteeAJ、VermeeschAM、deVriesBJ、JacobsenE、VisserRG.(1996)，PlantJ.10(l):83-90。*Kossmann和Llyod(2000),Crit.Rev.Bioch.Mol.Biol.35:141-196論Koziel等，(1993)Biotechnology11，194-200;先Krens等，Nature296，(1982)，72-74六Kuipers等(1994)。力Leisy等，PlantMol.Biol.14(1990)，41-50*Loesche，1986*MacGregorEA、JespersenHM、SvenssonB(1996).FEBSlett378:263-266*Marsh，2003*Matsuda,T.和Kabat，E.A.1989.J.Immuiiol.142:863-870。論May等，Bio/Technology13，(1995)，486-492;*MonchoisV、Remaud-SimeonM、RussellRRB、MonsanP和WillemotRM.1997.Appl.Microbiol.Biotechnol.48:465-472*MonchoisV、Remaud-SimeonM、MonsanP和WillemotRM.1998.FEMSMicrobiol,lett.159:307-315*Monchois等，1999，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters177，243-248;*MonchoisV、WillemotRM和MonsanP.1999，F(xiàn)EMSMicrobiologyReviews23,131-151。頭Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。*Murashige,T.和Skoog，F(xiàn).1962.Physiol.Plant.15:473-497。女Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.10USA91(1994)，12760-12764)先Nehra等，PlantJ.5,(1994),285-297*OakesJV,ShewmakerCK,StalkerDM(1991).Biotechnol9:982-986汆Pede腦等，Cell29(1982)，1015-1026;*Pilon，M.、Wienk,H.、Sips，W.、deSwaaf，M.、Talboom，I.、van，tHof，R.、deKorte-Kool，G.、Demd，R.、Weisbeek，P.和deKruijff,B.1995.J.Biol.Chem.270:3882-3893。Quatroccio等，PlantMol.Biol.15(1990),81-93古Quirasco等(Appl.Environ.Microbiol.，65(12)，5504-5509，1999古Ritala等，PlantMol.股ol.24，(1994)，317-325;*Ritchie等，TransgenicRes.2，(1993),252-265)。*Robyt，J.F.和Walseth,T.F.1978.Carbohydr.Res.61:433-445。*Robyt,J.F.1995.Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.51:133-168。論Rocha-Sosa等，EMBOJ.8,(1989)，29-33*RufS.，HermannM.，BergerI.J.，CarrerH.，和BockR.(2001).Nat.Biotechnol.19(9):870-875,*Sambrook等，2001.MolecularCloning,AlaboratoryManual，第三版一ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour，NY.ISBN:0879695773。*ShewmakerCK、BoyerCD、WiesenbornDP、ThompsonDB、BoersigMR、OakesJV、StalkerDM.PlantPhysiol.1994Apr;104(4):1159-66。*Sidebotham,R丄.1975.Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.30:371-444。*SidorovV.A.、KastenD.、PangS.Z.、HajdukiewiczP.T.、StaubJ.M.和NehraN.S.(1999).PlantJ.19(2):209-216.*SikdarS.R.等(1998).PlantCellReports18:20-24。*Smeekens,S.、vanBinsbergen,J.和Weisbeek,P.1985.NucleicAcidsRes.13:3179-3194*Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)*Staub等1992PlantCell4:39-45*StaubJ.M"和MaligaP.(1993).EMBOJ.12(2):601-606'^Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987),7943-7947女Stockhaus等，EMBOJ.8(1989)，2445-2451*SuD.和RobytJF.，ArchBiochemBiophys.1994Feb1;308(2):471-6。*Sutherland,2001*SvabZ.，HajdukiewiczP.和MaligaP.(19卯).Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(21):8526國(guó)8530。*SvabZ.，MaligaP.(1993);Proc.Natl.Acad.Sci.USAFeb1;90(3):913-7,*Takken，F(xiàn)丄.W.、Luderer，R.、Gabrigls，S.H.E.J.、Westerink，N.、Lu，R.、deWit，P丄G.M.和Joosten，M.H.A.J,2000.PlantJ.24:275-283。*Thompson等，NucleicAcidsResearch22(1994)，4673-4680*Tom6s-Barbei^n和Espin，2001*VanGeel-SchuttenGH、FaberEJ、SmitE、BontingK、SmithMR、TenBrinkB、KamerlingJP、VliegenthartJF、DijkhuizenL.，ApplEnvironMicrobiol.1999Jul;65(7):3008-14。wVasil等，Bio/Technology11(1993)，1553-1558;士Wan和Lemaux，PlantPhysiol.104，(1994)，37-48*Wang，D.、Liu，S.、Trummer，B.J.、Deng,C.和Wang，A.2002.NatureBiotechnol.20:275-281.*WeisingK,SchellJ，KahlG.，AnnuRevGenet.1988;22:421-77.Review*Wenzler,H.C.、Mignery，A.、Fisher,L.M.和Park,W.D.1989.PlantMol.Biol.12:41-50。頭Werr等，EMBOJ.4(1985)，1373-1380*WiaterA、ChomaA、SzczodrakJ，1999，J.BasicMicrobiol.39，265-273。*WiaterA和SzczodrakJ,2002，ActaBiol.Hung.53，389-401。頭Wilmink等，PlantCellReports11，(1992),76-80;*White等，NucleicAcidsRes.18(4):1062頭Wolter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)，846-850Yoshihara等，F(xiàn)EBSLett.383(1996)，213-218*Zheng等，PlantJ.4(1993)，357-36權(quán)利要求1.基因修飾植物細(xì)胞，其特征在于在質(zhì)體中具有齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的酶活性，并且其中與對(duì)應(yīng)的非基因修飾野生型植物細(xì)胞所合成的淀粉相比，所述的基因修飾植物細(xì)胞合成改性淀粉。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因修飾植物細(xì)胞，其中植物細(xì)胞合成改性淀粉，與對(duì)應(yīng)的非基因修飾的野生型植物細(xì)胞所合成的淀粉相比，改性淀粉具有增加的T-起始溫度、和/或增加的最小黏度、和/或增加的終祐度和/或改變的顆粒形態(tài)學(xué)。3.植物和/或其后代，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的基因修飾植物細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物和/或其后代，其是淀粉貯藏植物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物和/或其后代，其是馬鈴薯植物。6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述植物的繁殖材料，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞。7.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述植物的可收獲部分，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞。8.用于制造根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述基因修飾植物的方法，其中a)用核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該核酸分子包含編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子，b)從步驟a)中所得到的植物細(xì)胞再生植物，并且c)根據(jù)需要，從步驟b)中所得到的植物產(chǎn)生另外的植物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟a)中編碼齒斑葡IMI蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子與編碼質(zhì)體信號(hào)序列的核酸分子翻譯性融合。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子整合至植物的質(zhì)體基因組。11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞，或根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的植物，其中編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子選自a)核酸分子，其編碼具有SEQIDNO:2所示^酸序列或其部分并具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力的蛋白質(zhì)；b)核酸分子，其編碼其M酸序列與SEQIDNO:2所示M酸序列或其部分具有至少70%的同一性并具有催化從蔗糖合成齒斑葡聚糖的能力的蛋白質(zhì)；c)核酸分子，其包含SEQIDNO:l中所示核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或者它們的部分，所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或者它們的部分編碼具有催化從蔑糖合成齒斑葡聚糖的能力的蛋白質(zhì)；d)核酸分子，其核酸序列與a)或c)所述核酸序列具有至少70。/。的同一性；e)核酸分子，其核苷酸序列因遺傳密碼子簡(jiǎn)并性而自a)、b)、c)或d)中所確定的核酸分子的序列衍生；以及f)核酸分子，其代表在a)、b)、c)、d)或e)中所確定的核酸分子的片段、等位變體和/或衍生物。12.用于制造改性淀粉的方法，其包括從權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述植物細(xì)胞、a利要求3至5中任一項(xiàng)所^i物、a利要求7所述植物的可收獲部分或者從通過(guò)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述方法可得到的植物提取淀粉的步驟。13.改性淀粉，其可通過(guò)權(quán)利要求12所述的方法得到。14.用于產(chǎn)生衍生淀粉的方法，其中從根據(jù)權(quán)利要求13所述的改性淀粉衍生。15.衍生淀粉，其可通過(guò)權(quán)利要求14所述的方法得到。16.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求3至S中任一項(xiàng)所述的植物、根據(jù)權(quán)利要求7所述植物的可收獲部分或根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述方法可得到的植物的用途，其用于產(chǎn)生改性淀粉。17.編碼齒斑葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)的核酸分子的用途，其用于制造根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的基因修飾植物細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的基因修飾植物、根據(jù)權(quán)利要求6所述的繁殖材料或根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物的可收獲部分。全文摘要本發(fā)明涉及經(jīng)基因修飾的植物細(xì)胞和植物，其中該基因修飾在此類植物細(xì)胞和植物的質(zhì)體中引起具有齒斑葡聚糖蔗糖酶活性的酶表達(dá)。此外，本發(fā)明還涉及用于制造此類植物細(xì)胞和植物的手段及方法。這種類型的植物細(xì)胞和植物合成改性淀粉。本發(fā)明因此還涉及由本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物合成的淀粉及用于產(chǎn)生該淀粉的方法和這種改性淀粉的淀粉衍生物的制造。文檔編號(hào)A01H5/00GK101103115SQ200680002074公開日2008年1月9日申請(qǐng)日期2006年1月9日優(yōu)先權(quán)日2005年1月10日發(fā)明者C·弗羅貝格,G·科克-亞科恩,J-P·溫肯,L·Cjm·蘇爾斯,R·Gf·菲瑟申請(qǐng)人:拜爾作物科學(xué)股份公司