專利名稱：包含蛇床子提取物的用于殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子的組合物，其含有蛇床子(Torilidis Fructus)的提取物，并涉及一種使用該化合物殺菌的方法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)孢子微生物屬于需氧桿菌屬和專性厭氧梭菌屬，其天然地存在于從土壤里收獲的 例如蔬菜和香料的農(nóng)業(yè)原料中，其形成高度耐熱的孢子內(nèi)壁，并因此直接或間接地引起 加工食品質(zhì)量的變質(zhì)并威脅著食品的衛(wèi)生。
孢子核保持在脫水和干燥的狀態(tài)下，并通過被稱為皮層的肽聚糖層包圍。該皮層包 圍在由大量蛋白質(zhì)組成的外殼層中。由于其特有的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)性質(zhì)，孢子高度耐熱， 耐化學(xué)試劑，例如抗菌物質(zhì)或抗生素，耐溶菌酶，耐物理作用，耐UV輻射，耐高壓， 耐高壓脈沖電場等。孢子可以長時間保持休眠以在不利于生長的環(huán)境下存活。因此，對 于孢子的殺菌條件必須首先考慮以確保加工食品的微生物安全。
此外，由于產(chǎn)孢子微生物天然地存在于來自土壤中的例如蔬菜和香料的食品原料 中，其成為一種難題，在將蒸煮產(chǎn)品填充入例如罐頭，袋子和盤子的各種容器類型中的 殺菌中它們是重要的危險因素。就是說，產(chǎn)孢子微生物是由冷點產(chǎn)生的二次污染物，在 此點無法實現(xiàn)高于4。F的充分的熱處理，并且例如針孔的包裝材料問題，由此成為主要 的殺菌目標(biāo)。
因此，為了確保加工食品的衛(wèi)生和貨架期，研究并開發(fā)一種抑制萌發(fā)并殺滅產(chǎn)孢子 微生物的方法是很重要的。
由于不形成孢子的病原體對熱沒有耐受性并對化學(xué)處理有低耐受性，它們被充分的 抑制生長或通過低于100。C的溫度熱處理殺滅或通過例如有機(jī)酸，乙醇和細(xì)菌素的商品 化的殺菌劑處理殺滅。相反地，由于孢子的結(jié)構(gòu)，化學(xué)和生態(tài)學(xué)特性使其不容易被殺滅。 因此，耐熱性孢子通常使用基于12rC的高溫，1-1.5kg/cr^的高壓加熱幾分鐘到幾十分 鐘的蒸煮方法被殺滅。然而，這種高溫處理明顯地?fù)p害包括風(fēng)味，外觀和質(zhì)地的感官質(zhì) 量，并破壞許多營養(yǎng)素，因此影響了高質(zhì)量加工食品產(chǎn)品的開發(fā)。另一種商業(yè)殺菌方法 包括間接殺菌，其基于在65。C的適度溫度下5-6小時內(nèi)誘導(dǎo)孢子萌發(fā)，以將孢子轉(zhuǎn)變?yōu)?營養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行殺菌。這種方法的優(yōu)點在于允許耐熱孢子在低于ioor的溫度下殺菌而 質(zhì)量沒有下降，但具有一些缺點，包括當(dāng)其使用于工業(yè)生產(chǎn)時的費時和在夏天要承擔(dān)微 生物污染的高風(fēng)險的事實。同樣，可以使用抑制孢子萌發(fā)的方法，其使用乳酸鈉，溶血
卵磷脂，聚脂肪酸酯，L-苯基丙氨酸，精油，甘氨酸，L-絲氨酸等。然而，由于使用食
品添加劑的這些方法僅僅具有抑制孢子萌發(fā)的作用并沒有殺滅作用，潛在的風(fēng)險因素仍 然存在。
此外，對于各種殺菌劑組合物也進(jìn)行了研究。
根據(jù)Alkhayat，Huhtanen，Ueda，等，例如丁香，豆蔻，白胡沖權(quán)和黑胡才權(quán)，月桂和肉 豆蔻等香料的熱水和乙醇提取物在125ug/ml的最小抑制濃度(MIC)下已經(jīng)對肉毒桿菌 A和B型的孢子產(chǎn)生了抑制作用。根據(jù)Hara等，例如單寧酸，多酚，茶黃素和兒茶酚的 茶葉提取物有效抑制孢子的萌發(fā)。同樣，咖啡酸和精蛋白是結(jié)合到魚精子核DNA上的高 度堿性(highly-basic)的蛋白質(zhì)(肽)，其有效殺滅孢子和抑制孢子萌發(fā)。精蛋白通 過破壞細(xì)胞壁和質(zhì)膜殺滅桿菌的營養(yǎng)細(xì)胞，并通過抑制DNA， RNA和蛋白質(zhì)合成及ATP 水平的呼吸抑制對桿菌的孢子具有生長抑制作用。同樣，可以通過精蛋白和熱的協(xié)同作 用很好地刺激孢子死亡。此外，已知的其它天然殺菌劑材料對" 包子萌發(fā)有抑制作用并對 孢子有殺菌作用，其它的天然殺菌劑材料包括下述多熔素，其通過作為表面活性劑影 響孢子結(jié)構(gòu)而具有生長抑制作用；肽和包括氨基酸的蛋白質(zhì)，例如細(xì)菌素，乳酸鏈球菌 肽和pediocines,其不直接影響休眠的孢子，但在孢子萌發(fā)的早期溶脹階段通過穿透孢 子的薄壁影響萌發(fā)孢子的核，從而抑制繁殖；及乙醇，其在孢子萌發(fā)或孢子形成過程中 具有生長抑制作用。然而，大多數(shù)殺菌劑對孢子具有生長抑制作用而不是對休眠孢子的 直接殺菌作用，或僅僅顯示出在孢子萌發(fā)或孢子形成期間的生長抑制作用。同樣，具有 直接殺菌作用的物質(zhì)顯示出大約101的令人不滿意的孢子殺滅效果。
下面回顧了相關(guān)國內(nèi)和國外文獻(xiàn)。韓國專利申請?zhí)?992-18019公開了一種對孢子 萌發(fā)有抑制作用的組合物，其由屬于蓖麻類的一種植物種類的脫脂淀粉和屬于黃連類的 另一個植物種類的根組成的混合物的提取物，并陳述黃連素是在孢子萌發(fā)抑制中的關(guān)鍵 物質(zhì)。韓國專利申請?zhí)?996-7000557公開一種用于殺滅或抑制酵母或產(chǎn)孢子微生物生 長的方法和組合物，其通過在過氧化物和氯化物或溴化物的存在下，以卣化過氧化物酶 和至少一種殺菌活性增效劑接觸微生物。該專利描述了殺菌活性增效劑包含一些a-氨基 酸，并優(yōu)選具有包含氫，未被取代的或羥基-或氨基-取代的，直鏈或支鏈的具有l(wèi)-6個 碳原子的烷基基團(tuán)，或未被取代或羥基-或氨基-取代的，具有7-12個碳原子的芳基烷
基基團(tuán)結(jié)構(gòu)的化合物。該專利同時描述該殺菌活性增效劑包含a-氨基酸，所述a-氨基 酸選自包含甘氨酸和丙氨酸的L-或D-對映體，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸， 蘇氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸，和其烷基酯的組。日本專利申請?zhí)?995-72164 公開了 一種用于抑制耐熱孢子的萌發(fā)和繁殖的雙甘油脂肪酸單酯組合物，該耐熱孢子在 飲料處理中產(chǎn)生一些問題，該組合物包括例如月桂酸，肉豆蔻酸和棕櫚酸的脂肪酸和單 酯。日本專利申請?zhí)?993-301163公開了 一種使用包含脂肪酸的組合物誘導(dǎo)抑制孢子萌 發(fā)的方法，該脂肪酸包括甘油單硬脂酸酯和異磷脂酰膽堿。上述發(fā)明主要目的是抑制孢 子的生長，并且在這些發(fā)明中所述的大多數(shù)殺菌劑材料被認(rèn)為是合成食品添加劑而不是 天然的殺菌劑材料。
基于這種背景，對具有完全殺滅孢子作用而沒有副作用的天然殺菌劑進(jìn)行了集中和 透徹的研究，在包含草藥，中草藥，熱帶水果和蔬菜的一百種可食用的植物材料中發(fā)現(xiàn) 蛇床子的提取物對枯草桿菌的孢子具有很強(qiáng)的殺菌作用，從而形成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子的組合物，其包 含蛇床子的有機(jī)溶劑提取物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子的方法，其基于使用該組 合物對孢子進(jìn)行處理。
附圖簡述
結(jié)合附圖通過下面的詳細(xì)說明將更清楚地理解本發(fā)明的上述及其它目的，特征和其 它優(yōu)點，其中


圖1顯示蛇床子的乙醇提取物對枯草桿菌孢子的殺菌作用； 圖2顯示制備蛇床子的乙醇提取物的過程；
圖3顯示蛇床子的乙醇提取物對枯草桿菌孢子的殺菌作用取決于其濃度； 圖4顯示隨著時間變化蛇床子的乙醇提取物對枯草桿菌孢子的殺菌作用； 圖5顯示由蛇床子的乙醇提取物制備己烷提取物和水提取物的過程； 圖6顯示乙酸冰片酯和乙酸香葉酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)和殺菌機(jī)理，其是蛇床子的乙醇提取 物的主要有效成分；
圖7顯示枯草桿菌孢子的顯微觀察，其不用任何提取物處理，或用由蛇床子的乙醇
提取物的己烷提取物或水提取物處理；和
圖8顯示枯草桿菌孢子的顯微觀察，其不用任何提取物處理，或用蛇床子的乙醇提 取物或用由蛇床子的乙醇提取物的己烷提取物或水提取物處理。
發(fā)明詳述
一方面，本發(fā)明涉及一種用于殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子的組合物，其包含蛇床子的 有機(jī)溶劑提取物。
在此使用的術(shù)語"提取物"是從植物中分離的活性成分，是指具有殺菌和對產(chǎn)孢子 微生物的孢子和營養(yǎng)細(xì)胞有殺滅活性的物質(zhì)。提取物使用例如乙醇的有機(jī)溶劑通過萃取 過程制備。該提取物包含有機(jī)溶劑提取物，其干粉，和使用其制備的所有配方。本發(fā)明 的提取物是蛇床子提取物。
在本發(fā)明中，"蛇床子"指屬于傘形科(Family Umbelliferae ),小竊衣光葉水 菊(Torilis japonica Decandolle)和蟲它床(Cnidium monnieri (L.) Cussion)植物 的干燥的果實，并包含所有蛇床子的野生型，雜交和突變型。
蛇床子在中草藥中已經(jīng)使用了很長時間，用于治療包含癢，皮膚傷口，濕滲和疔的 各種皮膚疾病。同樣，已知蛇床子對滴蟲陰道炎具有一定的治療作用。除了在中草藥中 使用治療皮膚病之外，蛇床子最近作為殺蟲劑使用。Nurayama等報導(dǎo)蛇床子具有收斂和 消炎作用(Shokubutsu Kenkyn Zasshi， 3, 181, 1926) 。 Itokawa等報導(dǎo)蛇床子通過 倍半萜(sesquiterpene)的作用實現(xiàn)鎮(zhèn)靜作用(Shoyakugaku Zasshi, 37， 223, 1983)。 Shindo報導(dǎo)蛇床子提取物具有大于80%的補(bǔ)體抑制作用(Wakakanyaku Symposium, 16， 76， 1983)。韓國專利申請?zhí)?000-0006823公開了一種包含蛇床子提取物用于減輕皮膚 騷癢的組合物。韓國專利申請?zhí)?995-013750公開了抗風(fēng)濕，消炎和止痛的藥。
蛇床子的主要成分包括L-莰烯，佛手內(nèi)酯，e-桉油醇，二氫山芽醇，圓當(dāng)歸素，
白芷素，異茴芽內(nèi)酯和anthotoxol。蛇床子也包含大約1. 3%的精油。
雖然傳統(tǒng)上在中草藥中蛇床子是作為皮膚病的治療劑而被使用的，但它對孢子的殺 菌作用還不是已知的。本發(fā)明的蛇床子提取物特征在于殺滅上述產(chǎn)孢子微生物和孢子的 營養(yǎng)細(xì)胞，該孢子可以在例如高溫，酸，堿，干燥，化學(xué)試劑和輻射等惡劣環(huán)境下存活。 本發(fā)明人通過測量0D值和全部細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量，分析100種植物乙醇提取物對枯草桿菌 孢子的殺菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛇床子提取物具有將枯草桿菌孢子減少到103-104 CFU/ml (99.9-99.99%失活)的優(yōu)秀的殺菌效果。該殺菌效果比傳統(tǒng)大約10'孢子的殺滅效果高
ioo倍以上。此外，本發(fā)明的蛇床子提取物的特征在于通過誘導(dǎo)孢子皮層的破裂損傷來
誘導(dǎo)孢子死亡，而不是簡單地抑制耐熱桿菌屬孢子的萌發(fā)。
在此使用的術(shù)語"產(chǎn)孢子微生物"指產(chǎn)生孢子的所有微生物，并包含真菌和細(xì)菌。 本發(fā)明的蛇床子提取物對所有產(chǎn)孢子微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和孢子具有優(yōu)秀的殺菌效果，并 且特別地對產(chǎn)孢子細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞和孢子具有優(yōu)秀的殺菌效果。產(chǎn)孢子細(xì)菌的實施例包
含桿菌屬的細(xì)菌，其包含納豆菌(Bacillus natto),枯草桿菌(Bacillus subtilis), 巨大芽孑包桿菌(Bacillus megaterium) ， Bacillus stearothermopjilus， 和凝結(jié)芽胞桿 菌(Bacillus coagulans );禾口4炎菌屬(Clostridium) 6々纟田菌，其包含丁酸梭菌 (Clostridium botulinum), 丙酉同丁醇梭4干菌(Clostridium acetobutylicum )， 肉毒 梭菌(Clostridium botulinum),梭狀芽孢桿菌(Clostridum sporgenes),和魏氏梭 菌(Clostridium welchii)。
在本發(fā)明中，蛇床子是用有機(jī)溶劑提取的。得到的提取溶液可以立即使用，但優(yōu)選 地可以在過濾和干燥后使用。本發(fā)明的提取物通過包含研磨蛇床子，以溶劑提取它，過濾提取物和干燥該濾液的 過程制備。
蛇床子可以用例如曱醇，乙醇，異丙醇，丁醇，乙烯，丙酮，乙醚，氯仿，乙酸乙 酯，N, N-二曱基曱酰胺(DMF),或二曱基亞砜(DMS0)的有機(jī)溶劑，在草藥的有效 成分不被破壞的條件下，或在這種破壞最小化的條件下，在室溫或稍高的溫度下提取。 優(yōu)選地，在20°C-30。C下提取大約12至大約48小時。由于草藥的有效成分的提取程度 和損失可能根據(jù)使用的有機(jī)酸而變化，因此應(yīng)該選擇適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸。過濾是從該提取物 中去除懸浮的固體顆粒的步驟。固體顆粒的去除可以通過經(jīng)過棉花，尼龍或類似物實現(xiàn)， 或通過冷凍過濾，或離心實現(xiàn)，但本發(fā)明不被限制在這些方法中。濾液的干燥可以通過 冷凍干燥，真空干燥，熱空氣干燥，噴霧干燥，壓力干燥，泡沫干燥，高頻干燥，和紅 外線干燥實現(xiàn)，但本發(fā)明不被限制在這些方法中。該過程還可以在干燥步驟前包含濃縮 濾液的步驟。如果需要，該過程還可以包含研磨最終干燥提取物的步驟。
在本發(fā)明的詳細(xì)實施例中，蛇床子用乙醇在25。C下進(jìn)行24小時攪拌提取，并通過 Whatman濾紙以過濾掉不溶于水的物質(zhì)。該濾液在44。C下的真空中濃縮并冷凍干燥以獲 得蛇床子的提取物。
根據(jù)本過程制備的蛇床子的有機(jī)溶劑提取物包含乙酸冰片酯和乙酸香葉酯。
用己烷提取蛇床子的乙醇提取物并鑒定得到的己烷提取物中具有對孢子殺菌有殺
菌活性的有效成分。結(jié)果，其中成分包含松碎，曱基.異丙基苯，1，8萜二烯，蛇床子 素，莰烯，乙酸冰片酯和乙酸香葉酯，乙酸冰片酯和乙酸香葉酯成分具有疏水和親水基 團(tuán)并因此可以作用表面活性劑，對產(chǎn)孢子微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和孢子顯示出主要的殺菌效 果。
兩種主要的有效成分乙酸冰片酯和乙酸香葉酯通過直接破壞由大量蛋白質(zhì)組成的 孢子最外層的皮層的表面結(jié)構(gòu)殺死孢子。這些成分都具有親水的羥基(0H )，酯基(RC00R ) 和羧基(RC00H)及疏水的曱基(CH3)，由于這種類似表面活性劑的結(jié)構(gòu)，這些成分的 一個分子同時結(jié)合到營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的親水和疏水基上，使?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞改變并 損傷，并且也同時結(jié)合到孢子皮層的親水和疏水基上，使蛋白質(zhì)成分改變，從而引起芽 孢外被的破裂損傷，從而最終殺滅營養(yǎng)細(xì)胞和孢子。
此外，根據(jù)本方法制備的蛇床子的有機(jī)溶劑提取物包含丙氨酸，甘露醇和木糖醇。 當(dāng)將蛇床子的乙醇提取物的水提取物添加到孢子懸浮液中時，孢子萌發(fā)的最初階段 由萌發(fā)刺激物啟動。萌發(fā)刺激物包含在蛇床子的乙醇提取物中，它們是丙氨酸，甘露醇 和木糖醇。
目前已知的萌發(fā)刺激物包含具有例如L-丙氨酸，L-氨基丁酸，氨基異丁酸，L-纈氨 酸，L-異亮氨酸，L-半胱氨酸和L-谷氨酸鹽的疏水烷基基團(tuán)的氨基酸，焦糖，和L-天 冬酰胺，其與L-丙氨酸有不同的誘導(dǎo)萌發(fā)機(jī)理。此外，例如葡萄糖，甘露糖，木糖，鼠 李糖和蔗糖的醛糖，和搭糖的脫氧衍生物，2-脫氧葡萄糖，和醛糖的內(nèi)酯衍生物，葡萄 糖-1， 4-內(nèi)酯和半乳糖-l， 4-內(nèi)酯，甘露醇，山梨醇，木糖醇，等等，它們都是已知的 基于碳水化合物的萌發(fā)誘導(dǎo)劑。此外，鈉離子，鉀離子和磷酸鹽離子已知通過L-丙氨酸 觸發(fā)很大程度上刺激萌發(fā)，但它們本身不作為萌發(fā)刺激物。GC-MS分析顯示，根據(jù)本發(fā) 明的蛇床子乙醇提取物包含大量的丙氨酸，甘露醇和木糖醇。
孢子萌發(fā)是包含如下階段的過程階段1，萌發(fā)刺激物結(jié)合到孢子受體；階段2， 觸發(fā)萌發(fā)的最初階4殳；階)爻3，水滲透進(jìn)入脫水的孢子核，因而發(fā)生耐熱損失，并且吡 咬二羧酸和鈣離子從孢子核釋放出來；階段4，此時這種核心的再水化引起孢子皮層的 水解；階段5，此時由于孢子核心的膨脹，該核的中心區(qū)域形成裂縫；和階段6，此時 釋放核細(xì)胞，完成該萌發(fā)過程。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，包含在蛇床子的乙醇提取物 的水提取物中的孢子萌發(fā)刺激物在孢子萌發(fā)的階段1和階段2產(chǎn)生作用。同樣，由于蛇 床子的乙醇提取物的水提取物不包含除萌發(fā)刺激物外的特殊營養(yǎng)物，因此在階段4不會 導(dǎo)致皮層水解，但僅僅引起芽孢外被的局部損傷，也就是說，通過產(chǎn)生裂縫形成通道允
許己烷提取物的殺菌成分?jǐn)U散進(jìn)入芽孢外被。也就是說，丙氨酸，甘露醇和木糖醇僅僅 具有導(dǎo)致芽孢外被改變的萌發(fā)刺激作用，而不會影響涉及孢子DNA從孢子核心釋放出來 和將孢子轉(zhuǎn)變成營養(yǎng)細(xì)胞的階段。
根據(jù)本發(fā)明的蛇床子的有機(jī)溶劑提取物顯示對于孢子殺菌的增效作用，其由丙氨 酸，甘露醇和木糖醇的萌發(fā)刺激物和作為表面活性劑的乙酸冰片酯和乙酸香葉酯的天然 殺菌物質(zhì)的協(xié)同作用產(chǎn)生。當(dāng)孢子萌發(fā)的最初階段通過萌發(fā)刺激物激活時，在該芽孢外 被層表面形成裂縫。隨后，作為表面活性劑的天然殺菌物質(zhì)乙酸水片酯和乙酸香葉酯通 過所形成的裂縫滲透進(jìn)入該孢子并破壞該孢子皮層和核心的成分和結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致該孢 子的死亡。這種殺滅孢子的效果比單獨使用己烷提取物更有效。也就是說，蛇床子的有 機(jī)溶劑提取物，優(yōu)選乙醇提取物，具有比殺滅孢子的效果大約是10'的傳統(tǒng)殺菌材料高 100倍的優(yōu)秀的殺滅孢子的效果，通過乙酸冰片酯和乙酸香葉酯成分介導(dǎo)的直接殺菌機(jī) 制提供大約10'的殺菌效果，和通過包括丙氨酸，甘露醇和木糖醇的萌發(fā)誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的 間接殺菌機(jī)制提供大約102的殺菌效果。此外，由于本發(fā)明的蛇床子提取物允許在食品 加工中在低溫沒有熱處理下殺滅孢子，其不會引起營養(yǎng)物的破壞或質(zhì)量變質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)孢子微生物的孢子殺菌的方法，其基于用該組合物對 孢子進(jìn)行處理。
該組合物在有效量中使用，但該處理方法不被具體限制。
通過下面的實施例可以更好的理解本發(fā)明，該實施例是為了說明本發(fā)明，并不是為 了限制本發(fā)明。
實施例1:植物提取物的制備
參見圖2,植物提取物根據(jù)下述程序從包含蛇床子的植物材料中制備。 洗滌和研磨
包含蛇床子的植物材料用純水洗滌以去除存在于該植物材料表面的污染物，如粉塵 和其它雜質(zhì)。然后洗滌過的植物材料使用研磨機(jī)分別精細(xì)地研磨，并測量每個研磨產(chǎn)物 的含水量。
乙醇揭—耳又物
將75°/。的可食用乙醇添加到粉末狀蛇床子和其它粉末狀材料中，最終濃度為0. 1%， 在室溫(25°C )下攪拌24小時混合。 過濾
與乙醇混合完成后，每種植物材料通過Whatman濾紙NO. 2過濾。剩下的顆粒再次
經(jīng)過乙醇提取步驟并隨后過濾。該一次和二次濾液混合在一起并用于下一步驟中。 通過溶劑蒸發(fā)濃縮
為濃縮該混合的濾液，在真空中44。C下蒸發(fā)溶劑。 冷凍干燥
冷凍干燥經(jīng)真空濃縮的蛇床子乙醇提取物提供具有低含水量的漿狀，并用于產(chǎn)孢子 微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和孢子的殺菌試驗。 己烷提取物的制備
蛇床子的乙醇提取物與100%的己烷混合，在室溫(25°C)下攪拌24小時。回收上 清夜用于產(chǎn)孢子微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和孢子的殺菌試驗。 水提取物的制備
包含蛇床子的植物材料的乙醇提取物分別用水混合，在室溫(25°C)下攪拌24小 時?；厥丈锨逡翰⒂糜诋a(chǎn)孢子微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和孢子的殺菌試驗。 實施例2:桿菌孢子的制備
選擇枯草桿菌(Bacillus subtilis)孢子用于產(chǎn)孢子微生物的殺菌試驗。特別是， 使用枯草桿菌ATCC 6633，其天然并豐富地存在于食品例如混合有紅胡椒的濃豆?jié){，醬， 紅胡椒粉，香料，干制蔬菜等等中。
繼代培養(yǎng)枯草桿菌ATCC 6633的營養(yǎng)細(xì)胞，在胰酶大豆瓊脂(TSA)平板上劃線接 種，在30。C下培養(yǎng)48小時。然后該平板在5'C的低溫下存放并用作種子培養(yǎng)。通過顯 微鏡觀察鑒定種子培養(yǎng)沒有形態(tài)學(xué)異常后，將其涂布在含好u酸鎂(NAMS)的營養(yǎng)瓊脂平 板上，在30。C下培養(yǎng)48小時。在產(chǎn)生101()-1012的孢子后，平板用生理鹽水洗滌，并且 該孢子用白金圏刮除并轉(zhuǎn)移到無菌試管。然后該孢子在4。C， 12000rpm下離心兩分鐘， 并再一次進(jìn)行該種離心。顯微鏡觀察確定孢子的狀態(tài)，該顆粒經(jīng)開關(guān)超聲波處理5分鐘 僅使?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞受到破壞，然后并再次離心。通過Dorner方法進(jìn)一步確認(rèn)孢子形成，并 且該孢子在-20°C下存放直到使用于殺菌試驗。 實施例3:蛇床子提取物對孢子的殺菌效果的評估
為了尋找對孢子具有殺菌作用的天然物質(zhì)，使用共有IOO種已知的具有殺菌活性的 植物材料，其中包括包含多香果，羅勒，黑胡椒，香菜，芹菜，桂皮，丁香，胡荽，孜 然芽，茴香，和馬郁蘭的36種草本香料；包含韭，艾蒿，紅胡椒，青椒(grossum green pimentos),豆瓣菜，橄欖，蘿卜芽，番茄，馬鈴薯，生姜，綠茶，葡萄，金色奇異果 (golden kiwis),桃，葡萄柚，和檸檬的27種蔬菜和熱帶水果；在傳統(tǒng)中藥中使用的
37種藥材，其含有連翹，當(dāng)歸，木瓜，木通，升麻，金4艮花，黃連，和蛇床子。殺菌植 物材料用75%的乙醇提取，在真空中濃縮，并冷凍干燥以形成含水的或粉末狀的殺菌材 料。然后，篩選該乙醇提取物以確定對產(chǎn)孢子微生物的孢子和營養(yǎng)細(xì)胞的殺菌有效的殺 菌植物材料。通過600nm下的光密度分析并通過在營養(yǎng)瓊脂平板上生長的活細(xì)胞的總數(shù) 計數(shù)對典型產(chǎn)孢子微生物的枯草桿菌孢子進(jìn)行殺菌試驗。
光密度分析是一種通過對在胰酶大豆肉湯(TSB)中37。C下培養(yǎng)18小時的營養(yǎng)細(xì)胞 和孢子在600nm下的OD值測定來間接分析營養(yǎng)細(xì)胞和孢子生長程度的方法。首先通過 光密度分析將認(rèn)為在殺菌中有效的植物材料進(jìn)行篩選作為候選者。然后，通過活細(xì)胞計 數(shù)法對候選者進(jìn)一步評估它們的殺菌效果。具體地，將孢子懸浮液與生理鹽水和天然殺 菌材料(1%的最終濃度)混合。該混合物在30。C下攪拌3小時，然后在12000rpm下離 心。將認(rèn)為含有添加的殺菌材料的上清夜去除后，在Ependorf試管中剩余的顆粒用蒸 餾水覆蓋并再次離心以消除殘留的殺菌材料。重復(fù)該洗滌步驟三次以獲得僅僅用天然殺 菌材料處理的孢子。這樣做是為了評估天然殺菌材料對純孢子樣品的殺菌效果。如果該 殺菌物質(zhì)沒有完全去除，殘留的殺菌物質(zhì)可能對由總活細(xì)胞計數(shù)得到的孢子中產(chǎn)生的營 養(yǎng)細(xì)胞顯示出它們的殺菌效果，從而就使得它難以評估對于孢子的準(zhǔn)確殺菌效果。在這 點上，該殺菌材料通過水洗滌完全去除，并且該孢子顆粒再懸浮在0.85%的生理鹽水中， 涂抹在TAS平板上，并在37。C下培養(yǎng)24小時和48小時。然后計數(shù)活細(xì)胞總數(shù)以確定天 然殺菌材料對孢子和營養(yǎng)細(xì)胞的殺滅效果。此外，該殺菌效果也在天然殺菌材料的不同 濃度下檢測，以確定最佳的濃度和營養(yǎng)細(xì)胞和最小生長抑制濃度(MICs)，用于殺滅孢 子的有效濃度。
每種候選者殺菌材料以相對孢子懸浮液1°/。的濃度添加到孢子懸浮液中，在3crc下
培養(yǎng)3小時，并對殺菌和生長抑制效果進(jìn)行評估。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛇床子的乙醇提取物顯示 出對營養(yǎng)細(xì)胞和孢子的103最高殺菌效果(
圖1)。此外，蛇床子的乙醇提取物，中藥材， 梔子和牛蒡子胖大海，及草本香料，胡荽(Coriandum sativum),顯示出大約10'CFU/ml 的減少枯草桿菌孢子的殺菌效果。發(fā)現(xiàn)剩余的96種植物材料沒有殺菌效果或有較小的 殺菌效果，其中觀察到的差異不明顯。
相關(guān)文獻(xiàn)和專利公開檢索導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)具有大約10'的殺菌和生長抑制效果 的天然殺菌材料相比，本發(fā)明的乙醇提取物具有大約IOO倍或者更高的優(yōu)秀的殺菌效果。 實施例4:根據(jù)蛇床子的來源和種類評價其對孢子的殺菌效果
為了確定不同來源和種類的蛇床子對枯草桿菌孢子的殺菌效果，根據(jù)實施例1中的 相同方法處理產(chǎn)于韓國和中國的小竊衣光葉水菊(Torilis japonica Decandolle)和 蛇床(Cnidium monnieri (L.) Cussion)并對其殺菌效果進(jìn)行相互比較。結(jié)果，在不 同來源和種類的蛇床子之間沒有觀察到太大的差異，蛇床子主要顯示出對枯草桿菌孢子 的102至103的殺菌效果。同時，它們都顯示出10%的相似產(chǎn)率。這些結(jié)果顯示所有種 類的蛇床子都可用于殺滅孢子。
實施例5:根據(jù)蛇床子提取物的濃度和時間評價其對孢子的殺菌效果
為了研究蛇床子的乙醇提取物的濃度對枯草桿菌孢子的殺菌作用，蛇床子的乙醇提 取物以相對孢子懸浮液的0. 01%, 0.05%， 0.1%, 0. 5%和1. 0%的濃度添加到孢子懸浮液 中。蛇床子的乙醇提取物在0. 1%的濃度下顯示出102的孢子減少(99%失活)，并在0. 5% 和1.0%濃度下顯示出103-104的孢子減少(99. 9-99. 99。/。失活)。考慮感官和包含風(fēng)味、 生產(chǎn)成本和銷售價格的經(jīng)濟(jì)因素后最佳的最小生長抑制濃度發(fā)現(xiàn)是0. 1%,和0. 5%-1. 0% 濃度(圖3 )。
為了研究蛇床子的乙醇提取物隨時間變化對枯草桿菌孢子的殺菌作用，孢子懸浮液 用蛇床子乙醇^是取物處理，并在所給時間點0. 5小時，1小時，2小時，3小時和6小時 測定殺菌效果。蛇床子的乙醇提取物在30分鐘后顯示102孢子減少(99%失活)的有效 殺菌效果，并在1小時后顯示103- 104的孢子減少(99. 9%_99. 99%)的最高殺菌效果。 在處理大約1小時后觀察到優(yōu)秀的殺菌和生長抑制效果，由殺菌物質(zhì)的直接殺菌效果和 萌發(fā)刺激物質(zhì)的間接殺菌效果產(chǎn)生具有103或更多的孢子減少(圖4)。 實施例6:蛇床子的乙醇提取物的上層相和下層相對孢子殺菌效果的評估
檢測蛇床子乙醇提取物的上層相和下層相對枯草桿菌孢子的殺菌效果。發(fā)現(xiàn)下層相 幾乎沒有殺菌效果。相反地，上層相顯示出102的孢子減少，這相似于使用蛇床子全部 乙醇提取物的孢子減少效果。這些結(jié)果表明蛇床子的乙醇提取物的殺菌效果由上層相的 殺菌成分產(chǎn)生。
實施例7:蛇床子乙醇提取物的己烷提取物的制備
為了確定對產(chǎn)孢子微生物起殺菌活性的主要成分，用己烷提取蛇床子的乙醇提取物 (圖5)。文獻(xiàn)檢索和使用試驗設(shè)備的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用己烷提取的包含疏水基團(tuán)的殺 菌成分包含松萜，曱基'異丙基苯，1，8萜二烯，蛇床子素，莰烯，乙酸冰片酯和乙酸 香葉酯，乙酸冰片酯和乙酸香葉酯，其由于具有疏水和親水基團(tuán)的結(jié)構(gòu)上的特點可以用 作表面活性劑，是對產(chǎn)孢子微生物起殺菌活性的主要成分。圖6顯示兩種成分的化學(xué)結(jié) 構(gòu)。
例子8:蛇床子乙醇提取物的水提取物的制備
為了確定蛇床子乙醇提取物的殺菌機(jī)理，蛇床子的乙醇提取物用水提取，并且分析 7K提取物的成分。
水提取物使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行成分分析。發(fā)現(xiàn)水提取物包含大量 丙氨酸，甘露醇和木糖醇，它們是已知的萌發(fā)刺激物。這些分析結(jié)果表明當(dāng)枯草桿菌孢 子用7]C提取物處理時，萌發(fā)刺激物通過誘導(dǎo)孢子萌發(fā)引起外層的破裂損傷，該外層是高 度耐化學(xué)殺菌物質(zhì)的，并且蛇床子乙醇提取物中的殺菌成分乙酸冰片酯和乙酸香葉酯的 作為表面活性劑通過形成的裂縫滲透進(jìn)入該孢子，最終^皮壞該孢子核。圖7顯示枯草桿 菌孢子的顯微鏡觀察圖。該孢子未用任何提取物處理，或用蛇床子乙醇提取物的己烷提 取物或水提取物在3CTC下處理3小時，并在5小時后顯孩i鏡下觀察。當(dāng)包含在孢子懸浮 液中的孢子在TSB營養(yǎng)基中培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)并生長成營養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)孢子用己烷提 取物處理時，沒有觀察到萌發(fā)的孢子，表明由于芽孢外被受到破壞而發(fā)生局部直接殺菌。 當(dāng)孢子用7jc提取物處理時，孢子萌發(fā)的最初階段由萌發(fā)刺激物啟動。由于通過水提取物 產(chǎn)生了最初階段的萌發(fā)，該孢子變得對殺菌成分有較少的耐受性，并且在這種情況下， 己烷提取物的殺菌成分效果加倍。圖8顯示枯草桿菌孢子的掃描電子顯微鏡觀察，用或 不用蛇床子提取物對其進(jìn)行處理。當(dāng)枯草桿菌孢子用蛇床子乙醇提取物處理時，孢子結(jié) 構(gòu)被破壞，并且孢核消失，表明孢子被殺滅。己烷提取物的處理引起芽孢外被的局部損 傷。水提^4勿的處理通過萌發(fā)初期階段的誘導(dǎo)引起孢子結(jié)構(gòu)的改變。
工業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明用于殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子和營養(yǎng)細(xì)胞的包含蛇床子有機(jī)溶劑提取 物的組合物顯示對產(chǎn)孢子微生物孢子和營養(yǎng)細(xì)胞的優(yōu)秀的殺菌效果，并因此具有在低溫 無須熱處理下能夠有效殺滅孢子以作為天然殺菌材料的多種商業(yè)應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種用于殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子的組合物，包含蛇床子的有機(jī)溶劑提取物。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其是乙醇提取物。
3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述產(chǎn)孢子微生物是桿菌屬(Bacillus )或梭菌屬 細(xì)菌(Clostridium)。
4. 如權(quán)利要求l所述的組合物，其包含一種或多種選自乙酸冰片酯和乙酸香葉酯的成分。
5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其包含一種或多種選自丙氨酸，甘露醇和木糖醇的成分。
6. —種殺滅產(chǎn)孢子微生物的孢子的方法，包含用權(quán)利要求1的組合物處理產(chǎn)孢子微生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有蛇床子有機(jī)酸提取物的組合物，其對包含真菌和細(xì)菌的產(chǎn)孢子微生物的孢子具有殺菌效果，并公開了一種使用該組合物殺滅孢子和營養(yǎng)細(xì)胞的方法。
文檔編號A01P1/00GK101098624SQ200680001789
公開日2008年1月2日 申請日期2006年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月4日
發(fā)明者卡俞亮, 尹熙南, 崔峻鳳, 李炳坤, 菊武昌, 趙元一, 趙錫哲 申請人:希杰株式會社