專利名稱:抗人淀粉樣蛋白單克隆抗體重輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
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本發(fā)明涉及抗人淀粉樣蛋白單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,具體涉及寡聚體高 親和性抗人Af3單克隆抗體A8的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述 基因和多肽在制備診斷試劑和藥物的用途。
背景技術(shù):
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)患者腦內(nèi)產(chǎn)生P-淀粉樣斑塊沉積是此病的典型病變。
針對淀粉樣蛋白(AP)分子的免疫療法來治療或預(yù)防阿爾茨海默病,是治療的一個重 要途徑。目的'已有人進行了一些工作,取得了不同程度的療效。但目前還不能特異性識別 A卩寡聚體,因此免疫效果不理想,需要有特異性識別和結(jié)合A(3寡聚體的單克隆抗體。
而發(fā)現(xiàn)高親和性,特異性好的單克隆抗體基因,是進一歩研制Ap寡聚體的單克隆抗 體的關(guān)鍵。
已知可溶性apl42寡聚體是最主要的阿爾茨海默病早期致病因子,對神經(jīng)元的毒性最
強。關(guān)于診斷和治療用途的針對16.5-25KDAPm2寡聚體単抗,目前尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗人AP單克隆抗體基因及其編碼的多肽,所述基因具有特異性 識別和結(jié)合A(3寡聚體的抗體活性片段,用于制備阿爾茨海默病的診斷試劑和治療藥物。
本發(fā)明應(yīng)用5'RACE技術(shù)通過基因特異引物和錨定引物成功的從培養(yǎng)的寡聚體高親 和性單抗A8雜交瘤細胞中克隆了抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因。所得重鏈和輕鏈可變區(qū)基 因可以正確編碼小鼠抗體可變區(qū)。所述輕鏈、重鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽可用于制備 抗人淀粉樣蛋白單克隆抗體。
基于上述已經(jīng)克隆到的A8抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因,采用基因重組的方法,構(gòu)建 和表達多種小分子的嵌合抗體、單鏈抗體以及Fab等基因工程抗體,以期用于阿爾茨海默病的診斷和治療目的。
本發(fā)明內(nèi)容詳述如下
本發(fā)明制備了寡聚體高親和性抗人A(3m2単克隆抗體,取名為A8。由北京交通大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程研究院建立和保存。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了抗A(5寡聚體的單克隆抗體A8 重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,重組后可表達出特異性識別和結(jié)合AP寡聚體的抗體活性片段。
單抗A8可以特異性識別表觀分子量為16.5-25KD的ApM2寡聚體和快速老化癡呆模 型小鼠(Senescence Accelerated Mouse, SAM)腦組織的A卩寡聚體。A8對A卩i-42寡聚體 的結(jié)合能力高于單體、APw、 A(3w2、和A(3w8A(3。其亞類為IgG3,抗原識別位點在A卩 多肽N端l-6位氨基酸,用于ELISA、蛋白質(zhì)免疫印跡的最佳稀釋度為1:106、 1:4,000。 Morris水迷宮結(jié)果提示,腹腔注射A8可以改善SAMP8的學(xué)習(xí)記憶能力。
本發(fā)明人使用5' RACE的方法克隆到AP寡聚體高親和性單抗A8輕鏈、重鏈可變區(qū) 基因。根據(jù)抗體恒定區(qū)CH-1區(qū)的最保守的一段序列設(shè)計引物,進行反轉(zhuǎn)錄,在cDNA產(chǎn) 物的5'端加上Poly(C)尾巴,然后使用針對多聚脫氧核苷酸尾巴設(shè)計的錨定引物與基因特 異性引物通過PCR方法將目的基因擴增出來。序列分析表明,A8抗體輕鏈和重鏈可變區(qū) 序列與已經(jīng)提交的小鼠IgG可變區(qū)序列同源性達卯%與92%。可以確定所得到的序列為 抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列,而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可編碼正確的小 鼠抗體可變區(qū)。
A8重鏈和輕鏈可變區(qū)基因是從能夠分泌較高活性的鼠源性寡聚體高親和性抗AP單抗 的雜交瘤細胞株中克隆的。其中所述的重鏈可變區(qū)基因全長為450bp,所述的輕鏈可變區(qū) 基因全長為429bp,兩個基因重組后可用于表達特異性識別和結(jié)合A(3寡聚體的抗體活性 片段。
所述抗人A卩k單克隆抗體A8的重鏈與輕鏈可變區(qū)如SEQ ID NO:l SEQ ID NO:4 所示。其中
SEQ ID NO:l是抗人ApM2單克隆抗體重鏈可變區(qū)DNA序列; SEQ ID NO:2是抗人ApM2單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列。 SEQIDNO:3是抗人A(3m2單克隆抗體輕鏈可變區(qū)DNA序列; SEQ ID NO:4是抗人A(3M2單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序
抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆。
分泌產(chǎn)生上述抗阿爾茨海默病單克隆抗體的細胞株為北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物 工程研究院采用傳統(tǒng)的骨髓瘤與脾細胞融合的方法獲得的一株A(3寡聚體高親和性的鼠源性抗人AP單抗雜交瘤細胞株,命名為A8,其抗原為A(M-42聚集物,其分泌的抗體分子 亞型為IgG3。
所述A8雜交瘤細胞己經(jīng)在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。
本發(fā)明在制備抗人AP單克隆抗體及其性質(zhì)和功能鑒定中進行了如下實驗
1、 抗原制備及抗體性質(zhì)的鑒定
A卩寡聚混合物(即本發(fā)明所用的免疫抗原)的制備(見實施例1, "1.A(3寡聚混合物 的制備")。其亞類為IgG3,抗原識別表位在AP多肽N端l-6位氨基酸。
可溶性A卩m2寡聚體是最主要的AD早期致病因子,對神經(jīng)元的毒性最強。目前,關(guān) 于診斷和治療用途的針對16.5-25KDAPm2寡聚體単抗,目前尚未見報道。
2、 間接ELISA實驗
結(jié)果表明A8可以很好識別以堿性包被液包被于96孔板的AP寡聚混合物。最低檢 測限為0.625嗎/ml (見實施例2)。 用于ELISA的最佳稀釋度為1:106。
3、 免疫印跡(Western blot)實驗
結(jié)果表明A8可以很好識別以SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜的Ap寡聚混 合物,主要識別16.5-25KD的寡聚物(見實施例3)。 用于蛋白質(zhì)免疫印跡的最佳稀釋度為1:4,000。
4、 免疫組化實驗
單抗A8可以特異性識別快速老化癡呆模型小鼠(Senescence Accelerated Mouse P8, SAMP8)腦組織的A卩寡聚體。結(jié)果顯示染色清晰,定位準(zhǔn)確,基本沒有背景干擾。在 進行免疫組化過程中,無須抗原修復(fù)(見實施例4)。
5、 Morris水迷宮檢測
結(jié)果顯示A8可以改善SAMP8的學(xué)習(xí)記憶能力(見實施例5)。
6、 單抗A8可變區(qū)基因的克隆
利用5'RACE的方法擴增抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因(見實施例6)。
用本發(fā)明獲得的抗人Af3單克隆抗體,利用雙抗體夾心ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附試驗)、 Western blot實驗、免疫組化等實驗方法,可以分別制備三種不同方法的檢測阿爾茨海默 病的試劑。基于上述已克隆到的抗人AP寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因,可以采用基因工程 方法,構(gòu)建和/或表達多種小分子基因工程抗體的載體、細胞株和抗體,如單鏈抗體、嵌 合抗體、Fab抗體等,以便用于AD診斷、預(yù)防和治療的基礎(chǔ)與臨床研究和應(yīng)用。因此, 所述抗人A(3單克隆抗體還可以制備成為藥物,用于診斷、預(yù)防和治療阿爾茨海默病。
所述的基因核酸序列克隆至相應(yīng)的表達載體,轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化相應(yīng)的受體細胞(包括細菌、 哺乳動物細胞以及酵母等),得到高表達所述抗體分子的細胞株。
此外,本發(fā)明的抗人A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因還有如下用途
構(gòu)建基因工程單克隆抗體表達體系將所述的抗人AP寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū) 基因的核苷酸序列克隆至相應(yīng)的表達載體,轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化相應(yīng)的受體細胞(包括細菌、哺乳 動物細胞以及酵母等),可以得到高表達所述抗體分子的細胞株。
表達后所獲得的蛋白產(chǎn)物晶體用于新藥開發(fā)研究將所述的抗人AP寡聚體單抗A8 輕、重鏈可變區(qū)基因在不同表達體系進行表達,所獲得的蛋白或多肽產(chǎn)物純化后,可制成 晶體。該晶體在新藥的研究開發(fā)中,可作為藥物靶點,用于新藥的結(jié)構(gòu)設(shè)計。
注本申請文件中所述的抗人A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因,均表示SEQID NO:l禾口/或SEQ IDNO:2;所述由這兩個基因編碼的多肽,均表示SEQ IDNO:3禾口/或SEQ ID NO:4序列的多肽。
本發(fā)明的優(yōu)點
首先,本發(fā)明用于免疫的抗原為APm2寡聚體混合物,免疫效果好,小鼠免疫血清效 價高。這一點優(yōu)于常用的"多肽偶聯(lián)載體蛋白方法"。
其次,提供的抗阿爾茨海默病單克隆抗體A8特異性識別16.5-22KD的A(3寡聚體, 具有AD早期診斷的應(yīng)用前景。由于A8特異性識別可溶性A卩寡聚體,在免疫治療實驗 中,有可能避免與纖維結(jié)合,從而降低腦出血等副反應(yīng)。
圖1為抗AP寡聚體單抗A8純化后的重、輕鏈。圖中1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Marker), 2為單抗A8的重鏈和輕鏈。
圖2為單抗A8的檢測靈敏度。
圖3為單抗A8和商品化單抗6E10對A P寡聚體識別的差異。1:蛋白質(zhì)分子量Marker; 2:檢測抗體為A8; 3:檢測抗體為6E10。圖4為單抗A8特異性識別快速老化癡呆模型小鼠大腦皮層及海馬區(qū)AP的情況。
圖5為Morris水迷宮檢測結(jié)果,圖中,橫坐標(biāo)為治療后的時間(第1, 2, 3, 4, 5 天),縱坐標(biāo)為各組找到平臺小鼠的數(shù)目(單位只)。
圖6為RT-PCR擴增的抗AP寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因的瓊脂糖凝膠電泳圖, 圖中M為DL-2000DNA分子量Marker, 1為A8重鏈可變區(qū)基因,2為A8輕鏈可變區(qū)基 因。
生物材料保藏信息
培養(yǎng)物名稱雜交瘤細胞株A8 保藏編號 CCTCC一C200926
保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心
保藏時間2009年4月15日
具體實施例方式
實施例1寡聚體高親和性抗人AP單克隆抗體A8的制備
1. A(3寡聚混合物的制備
A卩M2肽由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。參照文獻(Lambert M, 1998)
方法,并且進行必要的調(diào)整,將其在近似天然的條件下體外組裝得到A(3,-42寡聚混合物。
先將ApM2肽lmg溶于冰預(yù)冷的六氟異丙醇(l,U3,3,3-hexafluoro-2-propannol, HFIP) (Sigma),使AI3M2肽單體化,室溫,lh后使HFIP揮發(fā)殆盡。然后用無水二甲基亞砜 (DMSO) (Sigma) 20^1溶解Ap 1-42單體,最后將其置于F12培養(yǎng)基(Sigma)或磷酸鹽
緩沖體系(體積相應(yīng)補足lml)、置4。C, 24 h,使其自然聚合,用Western blot檢測A卩M2
寡聚混合物的制備情況。
2. 小鼠的免疫接種
取6-8周齡雌性BALB/c小鼠5只。分別用A(3寡聚混合物共進行4次免疫首次按 50嗎/只劑量將AP寡聚混合物與等體積福氏完全佐劑(Sigma)混勻后,腹腔注射。間隔 2周后重復(fù)注射,使用福氏不完全佐劑(Sigma),偶聯(lián)多肽劑量為30pg/只。間隔2周后 重復(fù)一次;再間隔兩周,用純抗原50嗎進行脾內(nèi)加強免疫,3-4d后取脾融合。
3. 飼養(yǎng)細胞的制備取6-8周齡BALB/c小鼠,引頸處死,無菌條件下RPMI 1640 培養(yǎng)液(Sigma)沖洗腹腔數(shù)次,將沖洗液2000rpm,離心10min。棄上清,用含20%小 牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮沉淀,細胞計數(shù),調(diào)整細胞濃度為1()S個/ml,加入96孔板中,100-孔,置于37'C, 5%(202培養(yǎng)箱中孵育。
4. 細胞融合取強化免疫3-4d的小鼠,眼球放血后,收集血清,拉頸處死,無菌取出 脾臟,制成單細胞懸液后,按10:1的比例將脾細胞與處于對數(shù)生長期的Sp2/0細胞(經(jīng) 8-氮鳥嘌呤,即8-Azaguanine,簡稱8-AG篩選)混合,1000rpm離心10min,棄上清,輕 彈管底使沉淀細胞呈糊狀,37。C水浴中加入0.7ml 50% PEG 4000 (polyethylene glycol, Sigma),邊加邊旋轉(zhuǎn)離心管,使細胞保持混勻狀態(tài),lmin加完,37。C水浴中靜置90s,立 即緩慢加入20ml RPMI 1640液,800rpm離心8min,棄上清,加入含20%小牛血清(杭 州四季青生物工程材料有限公司)、2%HAT (Sigma)、 1%青鏈霉素(Sigma)的1640培養(yǎng) 液,輕輕混勻,調(diào)整細胞濃度為2xl(^個/ml,加入已備有詞養(yǎng)細胞的96孔板中,10(^1/ 孔,置于37'C, 5%<:02培養(yǎng)箱中孵育,逐日觀察細胞生長情況,1周后補加含20%小牛 血清、1%HT (Sigma)、 1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液,按下列公式計算克隆生長率。
克隆生長率(%)=(細胞克隆生長孔/接種孔)xl00%
5. 陽性克隆的篩選及亞克隆
待細胞克隆長至視野的1/3時(顯微鏡放大倍數(shù)4X10),小心吸取細胞上清液,10 y g ml"A(3寡聚混合物為包被抗原,ELISA方法檢測上清中的抗體,具體方法及判斷標(biāo) 準(zhǔn)見"4.細胞融合",按下列公式計算克隆陽性率。
克隆陽性率(%)=(抗體陽性孔/檢測的細胞克隆生長孔)X100% 采用有限稀釋法對抗體分泌陽性的孔進行反復(fù)克隆化,至所有單克隆孔上清抗體陽性 率為100%。
6. 雜交瘤細胞株的建立
將克隆化的陽性克隆移入24孔板、6孔板和T25細胞培養(yǎng)瓶,擴大培養(yǎng)60-90d并建株。
7. 單克隆抗體的亞類鑒定
按照Sigma公司的小鼠IgG亞類鑒定試劑盒(Sigma)操作雜交瘤細胞株分泌單抗A8 的IgG亞類為IgG3。
8. 單克隆抗體的表位分析
使用競爭ELISA法測定單克隆抗體的抗原識別表位將單克隆抗體與濃度梯度的各 個肽段(Apl-6, A(31-11, Apl2-28)孵育lh后加入到包被有A卩寡聚體的酶標(biāo)板上進行 間接ELISA檢測。結(jié)果表明其表位為N端多肽Api-6。
9. 單抗的大量制備及純化接種雜交瘤細胞至降植垸(Sigma)預(yù)處理的BABL/c小鼠腹腔,^107個雜交瘤細胞 /只,7-10天后抽取腹水,使用AKTA explore100蛋白層析系統(tǒng)通過Protein A親和層析柱 純化單克隆抗體,見圖1 。用BCA試劑盒(美國PIERCE公司)測定抗體濃度,為3mg/ml。
實施例2間接ELISA實驗
1. 方法
(1) 包被10iig'ml"Ap寡聚混合物為包被抗原,加入酶標(biāo)板(SUNRISE公司)中, 每孔100yl, 4"過夜。
(2) PBS-T (NaC18g, KC1 0.2g, Na2HP04. 1.44g, KH2P04. 0.44g, Tween-20 0.05ml, 補ddH20至1L, pH7.2 7.4)洗板3次,每次5min。
(3) 封閉加含0.2。/oBSA的PBS-T,每孑Ll00ul。 37°C, 2h。
(4) 將倍比稀釋的單抗A8,加入96孔板中,每孔100ul。 37°C, 2h。同時設(shè)空白對 照、陰性對照和陽性對照(分別用小鼠抗人A(3血清、Calbiochem公司的抗人Apl-17)。
(5) PBS-T洗板3次,每次5min。
(6) 加1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),每 孔100 yl。 37°C, lh。
(7) PBS-T洗板3次,每次5min。
(8) 加底物TMB,每孔100 u 1, 20 min后,450nm波長檢測爿值。 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)如下
(樣品孔J值-空白對照^值)/ (陰性對照孔^值-空白對照^值)》2 檢測的最大稀釋度為該抗體的效價。
2. 結(jié)果與結(jié)論
應(yīng)用我們制備的單抗A8能夠識別包被的A卩寡聚混合物。最低檢測限為0.625 pg/ml。 見圖2。
上述結(jié)果說明單抗A8能夠有效識別體外組裝的A(3寡聚混合物,其反應(yīng)靈敏度較好。
實施例3 免疫印跡(Western blot)實驗
1.方法
取50 100略樣品,5x樣品緩沖液,混勻后上樣,先以100V電壓使蛋白通過濃縮膠。當(dāng)樣品進入分離膠時,調(diào)節(jié)電壓使其恒定在120V。當(dāng)溴酚藍泳動至凝膠底部時,結(jié)束電 泳,取下凝膠,常規(guī)用考馬斯亮藍R-250染色法染色;將凝膠和硝酸纖維素膜分別放入裝 有印跡緩沖液的容器里平衡10min,依次在放入濾紙、凝膠、NC膜、濾紙,成"三明治" 狀,倒入轉(zhuǎn)膜緩沖液,膠面朝負極,NC膜面朝向正極,小心避免并趕去氣泡。接通電源, 使恒流80mA連續(xù)轉(zhuǎn)移2h,切斷電源。
轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用麗春紅S染色液(10X麗春紅S貯存液配制方法為稱取麗春紅S2g, 三氯乙酸30g,璜基水楊酸30g,加水至100ml;用時按照1: 10的比例用用去離子水稀 釋)確定蛋白條帶位置,做相應(yīng)的標(biāo)記。用封閉液封閉硝酸纖維素膜(稱取脫脂奶粉5g, 溶于0.1mol/L PBST (NaCl 8g, KC1 0.2g,Na2HPO4. 1.44g, KH2P04. 0.44g, Tween-20 0.05ml, 補ddH20至1L, pH7.2 7.4) 100ml), 4。C封閉過夜。用封閉液液稀釋單抗A8,濃度一 般為0.2,g/ml,于4。C孵育12 14 h,或于20 37。C孵育2 h。用O.lmol/L PBST洗滌硝 酸纖維素膜4次,每次5 10min。用PBS稀釋HRP標(biāo)記的二抗,稀釋度為1: 1000,室 溫孵育1 h。用O.lmol/L PBST洗滌硝酸纖維素膜4次,每次5 min。按照P正RCE化學(xué)發(fā) 光試劑盒說明,將A液和B液等體積混合,加在硝酸纖維素膜上,2 5min后,用X光片 曝光顯影,觀察結(jié)果。用Quantity One software (BIO-RAD)軟件進行條帶半定量。
2.結(jié)果與結(jié)論
Western Blot結(jié)果,純化的A8主要識別低分子量寡聚體(以識別寡聚混合物中16.5KD 左右成分),此外與單體、高分子量寡聚體和原纖維又交叉反應(yīng)。6E10對單體、低分子量 寡聚體、高分子量寡聚體和原纖維的識別沒有差異。見圖3。
上述結(jié)果說明,單抗A8對AP寡聚混合物中16.5KD左右成分反應(yīng)最強,與6E10對 寡聚混合物的識別效果明顯不同。單抗A8可以利用WestemBlot進行樣本的Ap檢測。
實施例4免疫組化實驗 1.方法
(1) 脫蠟、水化。
(2) PBS洗兩次各5分鐘
(3) 用蒸餾水或PBS配置新鮮的3y。H202,室溫封閉5 10分鐘,蒸餾水洗3次。
(4) 抗原修復(fù)。
(5) PBS洗5分鐘。
(6) 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。(7) 滴加單抗A8,室溫1小時或者4'C過夜或者37t:i小時(4'C過夜后在37。C復(fù)溫 45分鐘)。
(8) PBS洗三次每次2分鐘。
(9) 滴加生物素化二抗(山羊抗小鼠IgG), 20。C 37。C20分鐘。
(10) PBS洗3次每次2分鐘。
(11) 滴加試劑SABC, 20'C 37'C20分鐘。
(12) PBS洗4次每次5分鐘。
(13) DAB顯色DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
(14) 蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。
(15) 脫水、透明、封片、鏡檢。 2.結(jié)果與結(jié)論
結(jié)果顯示,皮質(zhì)與海馬區(qū)染色清晰,定位準(zhǔn)確,背景較低。見圖4。單抗A8可以作 為腦皮質(zhì)與海馬區(qū)AP檢測的抗體。
實施例5 Morris水迷宮檢測
1、 實驗?zāi)康臋z測單抗A8對快速老化癡呆模型小鼠的治療作用
2、 實驗動物
實驗動物SAMP8購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,委托北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī) 學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。分組情況如下
按照注射藥物不同分為抗體A8治療組、小鼠非特異性IgG注射組、生理鹽水注射組、 SAMP8空白對照組,每組12只。
3、 實驗方法
參照文獻(Lee EB, 2006)的方法,以單抗A8腹腔注射8月齡雄性SAMP8小鼠(400嗎/ 只),每周1次,治療8周以后,進行Morris水迷宮檢測(在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)實驗動 物中心完成)。
Morris水迷宮檢測步驟
(1) 設(shè)計特制的水迷宮主要由一圓柱型水池和一可移動位置的平臺組成。水池高 70cm,直徑80cm,平臺直徑8cm,水池上空通過一個數(shù)字攝相機與計算機相連接。
(2) 預(yù)先在水池中注入清水,水深15cm,池壁及池底均為黑色,使池水變?yōu)椴煌该鞯?黑色,平臺表面為黑色,使小鼠不能看到,水面高出平臺表面0.5cm。(3) 水溫控制在22i0.5T:,在水池上標(biāo)定相同一點作為每次實驗小鼠的入水點。每個 象限對應(yīng)的側(cè)壁上粘貼不同形狀的標(biāo)志。平臺置于離入水點較遠的象限中間,實驗過程保 持平臺位置不變。
(4) 每次實驗在隔音的房間內(nèi)進行,水池,光源,鼠籠等實驗室各物件的位置保持不變。
(5) 治療結(jié)束后第3天開始訓(xùn)練,如果動物在120s內(nèi)找到平臺,讓其在平臺上停留 20s,如果動物沒有找到平臺,將其放在平臺上使其停留20s。
(6) 每次實驗以120s為限,紀錄每次各組動物能夠到達平臺的小鼠只數(shù)。若設(shè)定時間 內(nèi)未找到平臺,計算機停止跟蹤,記錄時間為120s。
(7) 于治療結(jié)束后4、 5、 6、 7、 8天繼續(xù)學(xué)習(xí)和測試,記錄每組小鼠找到平臺的情況。
4、 結(jié)果
A8治療組學(xué)習(xí)記憶改善情況明顯優(yōu)于小鼠非特異性IgG注射組、生理鹽水注射組、 SAMP8空白對照組。各組找到平臺小鼠的數(shù)目情況,測試第1天至第5天分別為A8治 療組(0、 2、 3、 4、 4只);非特異性IgG注射組(1、 1、 0、 0、 0)、生理鹽水注射組、 SAMP8空白對照組(0、 0、 1、 1、 0)見圖5 (橫坐標(biāo)為治療后的天數(shù),縱坐標(biāo)為各組找 到平臺小鼠的數(shù)目)。
5、 結(jié)論
單抗A8有改善快速老化癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。 實施例6單抗A8可變區(qū)基因的克隆
取處于對數(shù)生長期的A8雜交瘤細胞(5xl06),采用Trizol試劑法提取雜交瘤細胞株 A8的總RNA,取少量進行紫外分光光度計定量及1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。利用 5'RACE的方法擴增抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因。分別跟據(jù)小鼠IgG輕鏈和 重鏈恒定區(qū)CH-1區(qū)基因序列設(shè)計基因特異性引物L(fēng)-GSP1: ACTGGATGGTGGGAAGATGG禾B H-GSP1: CAGTGGATAGACCGATGGGGG。根據(jù)試齊U 盒說明書以總RNA為模板,分別以L-GSP1和H-GSP1為引物,使用SuperScripII反轉(zhuǎn)錄 酶合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)方案為總RNA5嗎,GSP 100n mol/L,補加無Rnase 水至18nL, 70。C孵育10min后立即置冰浴上;繼續(xù)向反應(yīng)液中加入10xbuffer2.5pL, 25m mol/L MgCl2 2.5pL, 10m mol/L dNTP lpL, 42。C孵育lmin后加入l^L 200U/pL SuperScrip II 反轉(zhuǎn)錄酶,42。C反應(yīng)50mm, 70。C孵育10 min。反轉(zhuǎn)錄完畢后加入RNase水解RNA,使 產(chǎn)物中只含有cDNA第一鏈。使用S.N.A.P離心柱純化cDNA第一鏈,然后通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶TdT以dCTP為底物向cDNA第一鏈5'端加上Poly(C)尾巴。
分別用 以 AAP:GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 與 L-GSP2:GGGGAA GATGGATACAGTTGGTGCAGC 禾Q AAP 與 H-GSP2 GATAGCCGATGGGGGTGTTGTTT TGG兩對引物以已經(jīng)加上Poly(C)尾巴的cDNA第一 鏈為模板擴增抗體輕鏈和重鏈(VL、 VH)可變區(qū)基因。擴增產(chǎn)物VH (約450bp)和VL (約429bp)經(jīng)瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳鑒定,見圖6。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Omega) 回收純化后,將目的片段克隆至T載體,測序分析(見序列表l-4)。
PCR擴增反應(yīng)按照常規(guī)方法進行以上述產(chǎn)物為模板,分別用重鏈和輕鏈引物擴增抗 體輕、重鏈可變區(qū)基因。反應(yīng)體系為cDNA5yL,上下游引物(10mmol/L)各1 y L, 10m mol/L dNTP 2 u L, 10 Xbuffer 5 U L,補加雙蒸水至50 u L, Ex Taq DNA聚合酶1.25^1, 加水至50pd,混勻,瞬時離心后,置PCR儀內(nèi)反應(yīng)。PCR條件為95預(yù)變性5min,循 環(huán)參數(shù)為94變性40 s, 55退火40 s, 72延伸1 min,共30個循環(huán),最后72延伸51 min。
目的片段T載體克隆測序方案如下將PCR產(chǎn)物以試劑盒(Omega)純化回收后, 連入pMD18-T載體。連接反應(yīng)體系為pMD18-T載體lpl, PCR產(chǎn)物純化重鏈(或輕鏈) 4^1,連接緩沖液5pl,混勻后置4r過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,篩選重組克隆并測序。
抗A(5寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因在制備用于診斷、預(yù)防和治療AD的試劑(盒) 及藥物中的應(yīng)用
抗Ap寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因應(yīng)用方面的研究主要有(1)建立可用于分 析AP寡聚體的夾心ELISA法;(2)AD的預(yù)防及早期治療研究:用于低齡SAMP8或Tg2576 轉(zhuǎn)基因鼠等AD動物模型,靜脈、腹腔或顱內(nèi)注射抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基 因相關(guān)的多肽或抗體,通過觀察學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)、組織病理學(xué)以及分子細胞生物學(xué)改變, 得到實驗室數(shù)據(jù);(3) AD的治療研究用于高齡或老年SAMP8或Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠等 AD動物模型,靜脈、腹腔或顱內(nèi)注射抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因相關(guān)的多 肽或抗體,通過觀察學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)、組織病理學(xué)以及分子細胞生物學(xué)改變,得到實驗室 數(shù)據(jù);(4); A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因相關(guān)的多肽或抗體用于各期臨床試驗 研究;(5) A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因相關(guān)的多肽或抗體應(yīng)用的副作用及并發(fā) 癥研究。(腦膜腦炎、出血)。
以本發(fā)明所述的輕、重鏈可變區(qū)基因重構(gòu)成一定形式的蛋白藥物,可以直接用于AD
的診斷及免疫治療。
以本發(fā)明所述及的輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽,可重組成的新型抗體主要有下列幾種形式(1)嵌合抗體是用鼠MAb的V區(qū)與人IgG的C區(qū)連接而成為人-鼠嵌合抗
體。由于其完整地保存了鼠MAb的特異性和親和力,同時降低了HAMA等不良反應(yīng),故
在免疫治療中顯示出良好的效果。(2)人源化抗體針對可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)的人源化改造,
包括CDR移植、表面氨基酸殘基修飾、骨架區(qū)交換、定位保留和表位導(dǎo)向選擇等,從而 不但降低了可變區(qū)的鼠源性同時又保持了鼠MAb的特異性和親和力。(3)小分子抗體 主要有由VH-CH1和VL-CH1組成的Fab抗體、用一條多肽(Gly4Ser) 3接頭連接VH 基因和VL基因而成的單鏈抗體、由VH和VL以非共價鍵結(jié)合而成Fv片段抗體、由VH 或VL—個功能結(jié)構(gòu)域組成的單域抗體、由單個CDR構(gòu)成的最小識別單位等。(4)多價 微型抗體主要有雙鏈抗體(ScFv) 2、 Flex微型抗體、LD微型抗體、F (ab,) 2、 F (ab,) 3、 (ScFv)4等。由于有多價抗原結(jié)合位點,親和力高,分子大小適中,在腎臟中的清除 率較慢的特點而具有較高的臨床應(yīng)用價值。(5)雙特異性抗體是一類具有雙重特異性和 雙重功能的抗體,又稱雙功能抗體。(6)重組抗體融合蛋白把Fab或Fv等基因片段, 與非抗體的核酸或酶等其它生物功能分子連接形成的具有靶特定的生物活性重組蛋白。
(7)噬菌體抗體把Ig的V區(qū)基因與絲狀噬菌體DNA上基因III或基因VIII連接經(jīng)轉(zhuǎn) 染宿主菌后,使其在膜表面外殼蛋白表達Fab或ScFv的融合蛋白產(chǎn)物。通過對此產(chǎn)物多 輪相關(guān)抗原的親和吸附,從中篩選出所需的特異性抗體。
以本發(fā)明所述及的輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽,以及重構(gòu)成一定形式的抗體,進 行各種酶、生物素、熒光(Cy3、 Cy5等)等標(biāo)記。
在上述研究的基礎(chǔ)上,利用合成或原核表達的A(3及寡聚化的A(3作為標(biāo)準(zhǔn)抗原樣品, 建立夾心ELISA法分析最適的包被抗體及濃度,最適的生物素化的檢測抗體(Ap寡聚體 特異性單克隆抗體)及濃度,同時以辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素和TMB為檢測系統(tǒng), 獲得可溶性A(3寡聚體夾心ELISA分析方法,建立AD早期診斷方法的實驗室標(biāo)準(zhǔn)。
以上述由輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽重組或衍生的抗體分子組裝的AD以及AD 相關(guān)疾病診斷試劑盒。抗人淀粉樣蛋白序列表.txt
〈110〉北京交通大學(xué)
<120>抗人淀粉樣蛋白單克隆抗體重輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用 <160〉 4
<170〉 Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1039 <212〉 DNA
<213〉 人(Homo sapiens) <400> 1
GGGCTCGTAG TGCAGCTTGC ATGCCTGCAG GTCGACGATT TATGCGGCCG CATGGACAGG 60 CTTACTTCTT CATTCCTGCT GCTGATTGTC CCTGCATATG TCTTGTCCCA AGTTACTCTA 120 AAAGAGTCTG GCCCTGGGAT ATTGAAGCCC TCACAGACCC TCAGTCTGAC TTGTTCTTTC 180 TCTGGGTTTT CACTGAGCAC TTCTGGTATG GGTGTAGGCT GGATTCGTCA GCCTTCAGGG 240 AAGGGTCTGG AGTGGCTGGC ACACATTTGG TGGGATGATG ATAAGTACTA TAACCCATCC 300 CTGAAGAGCC GGCTCACAAT CTCCAAGGAT ACCTCCAGAA ACCAGGTATT CCTCAAGATC 360 ACCAGTGTGG ACACTGCAGA TACTGCCACT TACTACTGTG CTCGAAGGGG GATCTACTAT 420 GATTACGACA ACTTTAACTA CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCAGCCAAA 480 ACAACACCCC CATCGGTCTA TCGGATCCCT CAATCTCTAG AGGATCCCCG GGTACCGAGC 540 TCGAATTCGT AATCATGGTC ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT 600 CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC 660 TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC 720 CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT 780 TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA 840 GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC 900 ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTA嵐AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT 960 TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAMATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 1020 CGAAACCCGA CAGGACTAT 1039
<210〉 2
〈211〉 346
<212> PRT
〈213〉 人(Horao sapiens) 〈400〉 2
Leu Ala Cys Leu Gin Val Asp Asp Leu Cys Gly
10 化 Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala
25 30 Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu
40 45 Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser
55 60 Met Gly Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly 70 ' 75 80
Leu Ala His lie Ti'p Trp Asp Asp Asp Lys Tyr
90 95 Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser
' 105 110
Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr
120 125 Ala Arg Arg Gly lie Tvr Tyr Asp Tyr Asp Asn
135 _ 140
Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys 150' 155 160
Val Tyr Arg lie Pro Gin Ser Leu Glu Asp Pro
170 L75 Asn Ser End Ser Trp Ser End Leu Phe Pro Val
185 190 Leu Thr lie Pro His Asn lie Arg Ala Gly Ser
200 205 Trp Gly Ala End End Val Ser End Leu Thr Leu
215 220 Leu Pro Ala Phe Gin Ser Gly Asn Leu Ser Cys 230 235 240
GlyLeuValValGin
15
ArgMetAspArgLeu
20
TyrValLeuSerGin
35
LysProSerGinThr
50
LeuSerThrSerGly
65
LysGlyLeuGluTrp
85
丁yrAsnProSerLeu
100
ArgAsnGinValPhe
115
AlaThrTyrTyrCys
130
PheAsnTyrTrpGly
145
ThrThrProProSer
165
ArgValProSerSer
180
EndAsnCysTyrPro
1^5
lieLysCysLysAla
210
lieAlaLeuArgSer
225抗人淀粉樣蛋白序列表.txt
GinLeuHisEndEndlieGly Gin ArgAlaGlyArgGlyGlyLeuArg
245250255
lieGlyArgSerSerAlaSer Ser LeuThrAspSerLeuArgSerVal
260265270
ValArgLeuArgArgAlaVal Ser AlaHisSerLysAlaVallieArg
275280285
LeuSerThrGluSerGlyAsp Asn AlaGlyLysAsnMetEndAla匕ys
290295300
GlyGinGinLysAlaArgAsn Arg LysLysAlaAlaLeuLeuAlaPhe
305310315320
PheHisArgLeuArgProPro Asp GluHisHislysAsnArgArgSer
325330335
SerGinArgTrpArgAsnPro Thr GlyLeu
340 345
〈210〉3
〈211〉1045
<212>腿
〈213〉人(Homo sapiens)
<400> 3
ATGAAAAACG
TTGCCTGTTA
ATGACCCAAA
AGATCTAGTC
AAACCAGGCC
CCAGACAGGT
GAGGCTGAGG
GGTGCTGGGA
CCCGAATTCT
CATAGCTGTT
GAAGCATAAA
TGCGCTCACT
GCCAACGCGC
ACTCGCTGCG
TACGGTTATC
AAAAGGCCAG
CTGACGAGCA
AAAGATACCA
TCAGTGCAAG GGCTGTTGGT CTCCACTCTC AGAGCATTGT AGTCTCCAAA TCAGTGGCAG ATCTGGGAAT CCAAGCTGGA AGAATCTCTA TCCTGTGTGA GTGTAAAGCC GCCCGCTTTC GGGGAGAGGC CTCGGTCGTT CACAGAATCA GAACCGTAAA TCACAAAAAT GGCGTTTCCC
CTTGCATGCC GCTGATGTTC CCTGCCTGTC ACATAGTAAT GCTCCTGATC TGGATCAGGG TTATTACTGC GCTGAAACGG GAGGATCCCC AATTGTTATC TGGGGTGCCT CAGTCGGGAA GGTTTGCGTA CGGCTGCGGC GGGGATAACG AAGGCCGCGT CGACGCTCAA CCTGG
TGCAGGTCGA TGGATTCCTG AGTCTTGGAG GGAAACACCT TACAAAGTTT ACAGATTTCA TTTCAAGGTT GCTGATGCTG GGGTACCGAG CGCTCACAAT AATGAGTGAG ACCTGTCGTG TTGGGCGCTC GAGCGGTATC CACGAAAGAA TGCTGGCGTT GTCAGAGGTG
CGATTAAGAA CTTCCAGCAG ATCAAGCCTC ATTTAGAATG CCAACCGATT CACTCAAGAT CACGTGTTCC CACCAACTGT CTCGAATTCG TCCACACAAC CTAACTCACA CCAGCTGCAT TTCCGCTTCC AGCTCACTCA CATGTGAGCA TTTCCATAGG GCGAAACCCG
GCTTATGAAG TGATGTTTTG CATTTCTTGC GTACCTGCAG TTCTGGGGTC CAGCAGAGTG GCTCACGTTC ATCCATCTTC TAATCATGGT ATACGAGCCG TTAATTGCGT TAATGAATCG TCGCTCACTG AAGGCGGTAA AAAGGCCAGC CTCCGCCCCC ACAGGACTAT
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
■
960
1020
1045
〈210〉 4
〈211〉 348
<212> PRT
〈213〉 人(Homo sapiens) 〈400〉 4
MetLysAsnValSerAlaSerLeuHisAlaCysArgSerThrlieLys
151015
LysLeuMetLys 20LeuProValArgLeu 25LeuValLeuMetPhe 30Trplie
ProAlaSer 35SerSerAspValLeu 40MetThrGinThrPro 45LeuSerLeu
ProVal 50SerLeuGlyAspGin 55AlaSerlieSerCysArgSerSerGin
SerlieValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGin
65707580
LysProGlyGinSer 85ProLysLeul>eulie 90Tyr匕ysValSerAsn 95Arg
PheSerGlyVal 100ProAspArgPheSer 105GlySerGlySerGly libThrAsp
PheThrLeu 115tyslieSerArgVal 120GluAlaGluAspLeu 125GlylieTyr
TyrCysPheGinGlySerArg 135ValProLeuThrPhe 140GlyAlaGlyThr
LysLeuGluLeuLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerliePhe
145150155160抗人淀粉樣蛋白序列表.txt
ProGluPheEndAsn 165LeuEndArgliePro 170Gly丁yrArgAlaArg 175lie
ArgAsnHisGly 180HisSerCysPheLeu 185CysGluIleVallie 190ArgSer
GinPheHis 195ThrThrTyrGluPro 200GluAlaEndSerVal 205LysProGly
ValPro 210AsnGluEndAlaAsn 215SerHisEndLeuArg 220CysAlaHisCys
ProLeuSerSerArgGluThrCysArgAlaSerCyslieAsnGluSer
225230235240
AlaAsnAlaArgGly 245GluAlaValCysVal 250LeuGlyAlaLeuPro 255Leu
ProArgSerl>eu 260ThrArgCysAlaArg 265SerPheGlyCysGly 270GluArg
TyrGinLeu 275ThrGinArgArgEnd 280TyrGlyTyrProGin 285AsnGinGly
lieThr 290HisGluArgThrCysGluGinLysAlaSer 300LysArgProGly
ThrValLysArgProArgCysTrpArgPheSerlieGlySerAlaPro
305310315320
LeuThrSerlieThr 325LyslieAspAlaGin 330ValArgGlyGlyGlu 335Thr
ArgGinAspTyr 3^0LysAspThrArgArg 345PheProLeu
權(quán)利要求
1、SEQ ID NO1所示的DNA序列及其編碼的多肽SEQ ID NO2。
2、 SEQ ID NO: 3所示的DNA序列及其編碼的多肽SEQ ID NO: 4。
3、 權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2所述的基因及多肽在制備抗人淀粉樣蛋白單克隆抗 體中的應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2所述的基因及多肽在制備診斷阿爾茨海默病試劑和 治療藥物中的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2所述的基因在構(gòu)建基因工程單克隆抗體表達體系中 的應(yīng)用。
6、 權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2所述的基因表達后所獲得的蛋白晶體在藥物研究中的r^r m
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人淀粉樣蛋白單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述基因和多肽在制備診斷阿爾茨海默病試劑和藥物的用途。本發(fā)明從培養(yǎng)的寡聚體高親和性單抗A8雜交瘤細胞中克隆了抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因。所得基因可以正確編碼小鼠抗體可變區(qū)。基于上述已經(jīng)克隆到的A8抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因,可采用基因重組的方法構(gòu)建和表達多種小分子的嵌合抗體、單鏈抗體以及Fab等基因工程抗體,以期用于阿爾茨海默病的診斷和治療。
文檔編號G01N33/577GK101555477SQ20091008207
公開日2009年10月14日 申請日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者何金生, 瑩 張, 濤 洪, 鑫 王 申請人:北京交通大學(xué)