專利名稱：用于通過近紅外輻射(nir－輻射)診斷神經(jīng)變性疾病的光學(xué)診斷劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過近紅外輻射(NIR-輻射)在體內(nèi)和體外診斷神經(jīng)變性疾病的化合物，該化合物作為光學(xué)診斷劑的應(yīng)用，以及包含這些化合物的診斷劑。
阿爾茨海默氏病(AD)是老年晚期癡呆中最常見的形式。AD的發(fā)病頻率隨著患者的年齡增大而提高，在85-90歲的年齡組中達(dá)到40-50％的值。AD只能在死后通過尸體解剖檢查患者大腦來得到確診。阿爾茨海默氏病患者的大腦在神經(jīng)元組織中有多個特征性淀粉樣蛋白斑，而且在血管周圍，包圍著營養(yǎng)不良的軸突和神經(jīng)原纖維“結(jié)“。阿爾茨海默氏病患者的大腦還表現(xiàn)為僅有少量的突觸。在該疾病的晚期時，還可進(jìn)一步形成神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的變性以及腦容量的明顯減小(Wiesniewski,H.M.,Weigel,J.,Alzheimer’s disease neuropathology.Current status of interpretation of lesion development.Ann NY Acad Sci1992,673:270-84)。
淀粉樣蛋白斑也稱為淀粉樣蛋白-β-肽(Aβ)，其是一個由40-42個氨基酸組成的β-淀粉樣蛋白前導(dǎo)蛋白(APP)片段(Master,C.L.,Simms,G.,Weinman,NA.等人，Amyloid plaque core protein in Alzheimerdisease and Down syndrome.Proc Natl Acad Sci USA 1985,82:4245-09；Kang,J.Lemaire,H.G.,Unterbeck,A.等人，The precursor ofAlzheimer’s disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor,Nature 1987,325:733-6)。蛋白斑的數(shù)量不與晚期癡呆的程度有相關(guān)關(guān)系，但對于阿爾茨海默氏病是一種較早且可靠的診斷劑。其假設(shè)是，AD產(chǎn)生不久后首先發(fā)生Aβ的積聚，然后才產(chǎn)生第一個臨床癥狀(Hardy,L.,Allsop,D.,Amyloid deposition as the central event in theaetiology of Alzheimer’s disease,Trends Pharmacol Sci 1991,12:383-8)。
如果能有在患者死亡之前盡早地定量檢測淀粉樣蛋白斑的方法，其將對進(jìn)一步研究AD產(chǎn)生重大影響，而且為治療AD提供新的有效方法。
目前，還沒有直接檢測在AD患者大腦中淀粉樣蛋白斑的方法?，F(xiàn)在，AD的程度還僅是間接地通過腦體積或腦受損區(qū)域內(nèi)的代謝紊亂(MRT和PET)來診斷。但該方法的重大缺陷是僅是間接檢測AD，而其結(jié)果經(jīng)常有非常高的統(tǒng)計學(xué)上的誤差。因此，該方法的檢測靈敏性與淀粉樣蛋白斑的直接檢測相比就低得多。
已知有許多方法用波長范圍在600-1200nm的長波長光來透射和成象診斷生理組織(近紅外診斷)。因為生理組織對上述光譜范圍的長波長光具有相對高的透過性，除現(xiàn)代成象法如放射照相法、核磁共振成象法、或超聲診斷法外，對于診斷人員近紅外診斷已成為組織成象的另一種方法(Haller,E.B.,Time-resolved transillumination and opticaltomography,J Biomed Optics 1996,1:7-17)。用近紅外輻射通過檢測血紅蛋白/脫氧血紅蛋白來位置獨立地記錄嬰兒腦中的血液流動和氧的生成程度是一種已知的方法，并已使用多年(Jobsis,F.F.，腦和心肌氧充足和循環(huán)參數(shù)的非侵入性紅監(jiān)測(Noninvasive infrared monitoring ofcerebral and myocardial oxygen sufficiency and circulatory parameters),Science 1977,198:1264-67；Chance,B.,Leigh,J.S.,Miyake,H.等人，Comparison of time-resolved and-unresolved measurements of deoxyglobinin brain,Proc Natl Acad Sci USA 1988,85:4971-75；Benaron DA.等人，Optical time-of-flight and absorbance imaging of biological media,Science1993,33:369A)。
近紅外診斷不僅可以檢測未被吸收的透射光，而且用近紅外光輻射后發(fā)射的熒光輻射還可提供組織特異性信息。
用近紅外輻射的主要問題是光線散射過強，使得足夠清晰的物體以及該物體周圍的不同光物理性質(zhì)差異變得不明顯。隨著物體與表面的距離增加，該問題則變得更加嚴(yán)重，而且被認(rèn)為是透照和熒光輻射檢查中的主要限制因素。
因此，本發(fā)明的目的是提供可避免現(xiàn)有技術(shù)之缺陷的新型化合物。
本發(fā)明的目的是通過以下通式Ⅰ的化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽來解決的Fm(-Al)(-Bn)(-Wo)(Ⅰ)其中F是染料信號分子，其至少在600-1200nm的范圍內(nèi)具有一個最大吸收，A是結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的生物分子，B是結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的染料，W是結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的、親水性的低分子結(jié)構(gòu)單元，m是1或2的整數(shù)，或者當(dāng)n和o是零時，其為3-20的整數(shù)，l和n相互獨立地是0、1、或2，o是0、1、2、3、或4的整數(shù)，其條件是，l、n和o的和大于等于1。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物可積聚、結(jié)合或者富集在淀粉樣蛋白斑或者淀粉樣蛋白斑的組成部分上，并由此使待檢測區(qū)域中后者的吸收和熒光均勻且增高。
用NIR輻射體內(nèi)檢測β-淀粉樣蛋白斑沉積需要染料作為顯影劑，其在600-1200nm的波長范圍內(nèi)具有高吸收并產(chǎn)生熒光量子，而且選擇性地結(jié)合累積的β-淀粉樣蛋白斑。
聚次甲基型染料的吸收和熒光性質(zhì)的特征是，在600-1200nm之間具有高摩爾吸收系數(shù)，而且產(chǎn)生足夠的熒光量子。該類型的染料通常具有高的光穩(wěn)定性。
出乎意料地發(fā)現(xiàn)，為提高正常組織和病態(tài)組織之間的差異，富集在病態(tài)組織中或者選擇性地結(jié)合病理變化組織的組成部分而且具有特殊的吸收和發(fā)射性質(zhì)的染料是合適的。
在本發(fā)明中令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通式Ⅰ之本發(fā)明化合物可結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑。檢測由于染料吸收而導(dǎo)致的(散射)輻射光變化或者由激發(fā)輻射誘導(dǎo)的熒光，并提供真實的組織特異性信息，該信息即可作為光變化程度的證據(jù)。
根據(jù)本發(fā)明，用此等染料作為信號分子F，該分子共價鍵地與選擇性地結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的結(jié)構(gòu)連接或者被此等結(jié)構(gòu)取代。
根據(jù)本發(fā)明之通式Ⅰ的化合物是例如其中a)l和n是零，m是1，而o是1-4，或者b)n和o是零，m是3-20，而1是1-2，或者c)l和o是零，m是1-2,n是1-2，其條件是，n與m的和小于等于3。
通式Ⅰ之本發(fā)明化合物優(yōu)選為，其中F是花青、Squarilium、Croconium、部花青、或Oxonol染料。
通式Ⅰ之化合物特別優(yōu)選是，其中F是通式Ⅱ-Ⅳ的花青、Squarilium、或Croconium染料
其中，R1-R4以及R7-R10相互獨立地是氟、氯、溴、碘原子或者是硝基或-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、SO2NHE1、-E1，其中E1和E2相互獨立地是氫，飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C50烷基鏈，該鏈或部分該鏈可選擇性地形成一個或多個芳香性或飽和環(huán)狀C5-C6單元或二環(huán)C10單元，而且所述C1-C50烷基鏈被0-15個氧原子和/或0-3個羰基中斷和/或被0-5個羥基取代，而且每個相鄰的R1-R4和/或R7-R10可相互連接形成六元芳香碳環(huán)，或者是連接A、B或W的一個鍵，R5和R6相互獨立地是如上述定義的基團-E1或者是C1-C4磺基烷基鏈，Q是以下基團
其中R11為氫、氟、氯、溴、碘原子或者是硝基或者為-NE1E2、-OE1或-E1基團，其中E1和E2如上所述，R12是氫原子或者如上所述的E1基團，b為0、2、或3，X和Y相互獨立地是O、S、-CH=CH-或者以下基團
其中R13和R14相互獨立地是氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C10烷基鏈，該烷基鏈可被最多至5個氧原子中斷和/或被最多至5個羥基取代，而且基團R13和R14可相互連接形成5或6元環(huán)。通式Ⅰ之化合物特別優(yōu)選的是，其中F是通式Ⅴ的花青染料，
其中p是2或3的整數(shù)，X和Y相互獨立地是O、S、-CH=CH-或CH(CH3)2,R19和R20相互獨立地是基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3H、-SO3H、-E1，其中E1和E2如上所述，其條件是，E1和E2不同時為氫原子，R21和R22相互獨立地是如上所述的基團-E1,C1-C4磺基烷基鏈，或者R19、R20、R21、R22、E1或E2為連接上述A、B或W的一個鍵。
通式Ⅰ之化合物進(jìn)一步特別優(yōu)選是，其中F是通式Ⅵ的花青染料
其中p、X、Y、R21和R22如上所述，R23是-OE3、-COOE3、-CONHE3、-CONH(CH2)1-6-NHE3、-CONH(CH2)1-6-OE3、-CONH(CH2)1-6-COOE3或者-CONH(CH2)1-6-CONHE3，其中E3是具有至少一個-SO3H基團的單糖、寡糖或多糖。
通式Ⅰ之其它特別優(yōu)選的化合物是，其中F是通式Ⅶ的Oxonol染料
其中p、R19和R20如上所述，R24和R25相互獨立地是被羥基、羧基、硫酸、磺酸、烷基或烷氧基或羧酸酯基單取代-三取代的苯環(huán)。
通式Ⅰ之本發(fā)明化合物是，其中A例如是抗體、抗體片段、特異性肽和蛋白質(zhì)、受體、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸、脂蛋白、碳水化合物、單糖、二糖或三糖、線性或分枝寡糖或多糖或它們的衍生物或者是右旋糖。
優(yōu)選的肽是β-淀粉樣蛋白1-40、1-42和1-43及其部分結(jié)構(gòu)和衍生物。特別優(yōu)選的是用氨基酸半胱氨酸改性的β-淀粉樣蛋白和β-淀粉樣蛋白的部分結(jié)構(gòu)，其中，通過馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)在半胱氨酸的巰基上連接F。
單體氨基糖例如是葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、古洛糖胺、果糖胺、3-氨基-3-脫氧-核糖、Kanosamin、海藻糖胺、碳霉糖、德糖胺、Rhodosamine、6-氨基-6-脫氧-葡萄糖、Neosamin、Paromose。
氨基糖-羧酸例如是葡糖胺酸、葡糖胺醛酸、胞壁酸、海藻糖胺、軟骨生及衍生物、殼三糖。
通式Ⅰ的化合物優(yōu)選是，其中在氨基糖的氨基和染料的羧基之間形成酰胺基由此連接F。
通式Ⅰ的其它化合物優(yōu)選是，其中A為單糖、二糖、三糖、和寡糖，其配糖中羥基轉(zhuǎn)化為氨基，然后通過形成酰胺基實現(xiàn)與染料F之羧基的連接。
單糖-寡糖是丙醛糖和丙酮糖至庚醛糖和庚酮糖、辛酮糖和壬酮糖、脫水氨基糖、賽克拉特(Cyclite)、氨基糖和二氨基糖、脫氧糖、氨基脫氧糖、單羧酸糖、氨基糖-羧酸、氨基賽克拉特、單糖至寡糖的含磷衍生物。
合適的多糖是巖藻依聚糖、阿糖基半乳聚糖、軟骨素及其硫酸酯、皮膚素、肝素、類肝素、乙酰肝素、透明質(zhì)酸、角質(zhì)素、聚半乳糖醛酸、聚葡萄糖醛酸、聚甘露糖醛酸、胰島素、聚乳糖、聚乳糖胺、聚肌苷酸、聚蔗糖、支鏈淀粉酶、糖原、黑曲霉多糖、出芽短梗霉聚糖、Asparagosin、海蔥糖、Sitosin、半乳卡洛糖、淡黃青霉糖、半乳聚糖、甘露聚糖、Guaran、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、磷酸甘露聚糖、巖藻聚糖、果膠、環(huán)糊精、以及這些高分子化合物通過化學(xué)和/或酶法制得的衍生物、分解產(chǎn)物和裂解產(chǎn)物。
特別優(yōu)選的單糖、寡糖和多糖是經(jīng)硫酸化或磷酸化的結(jié)構(gòu)。
經(jīng)硫酸化的結(jié)構(gòu)例如是葡糖胺-3-硫酸酯、葡糖胺-6-硫酸酯、以及例如根據(jù)Jaurand,G.等人，Carbohydrate Research 1994,255:295-301:Bocker,T.等人，Carbohydrate Research,1992,230:245-256的硫酸化法，用合適的試劑對上述單糖、二糖、三糖至寡糖及多糖進(jìn)行硫酸化而得到的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明之選擇性結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的染料B是重氮染料，其共價鍵地與所述信號分子結(jié)合。合適的重氮染料例如是剛果紅、柯胺G、Evans蘭、Chicago天蘭6B、Direct Red染料、Direct Yellow染料、Ponceau染料、活性黑5、和Calcion。
通式Ⅰ之化合物優(yōu)選是，其中B是通式Ⅷ重氮染料
其中R15和R16相互獨立地是被一個或多個羥基、羧基、氨基、磺酸、烷氧羰基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或者芳基磺酰基取代的苯基或萘基，所述烷基中有最多6個碳原子，而所述芳基磺?；械姆蓟疃嘤?個碳原子；或者是染料F；R17和R18相互獨立地是羥基、羧基、磺酸、帶有最多至6個碳原子的烷基、烷氧基。
通式Ⅰ之本發(fā)明化合物進(jìn)一步優(yōu)選是，其中W是-OSO3H或者-SO3H，最多帶有60個碳原子的直鏈、支鏈、環(huán)狀或多環(huán)烷基、烯基、多烯基、炔基、芳基、烷芳基或芳烷基，它們被最多5個羥基、最多3個羧酸基和至少一個-OSO3H或-SO3H基團取代。
通式Ⅰ的化合物優(yōu)選是，其中W是經(jīng)硫酸化的結(jié)構(gòu)，其通過硫酸化相應(yīng)的羥基化合物來制備。
合適的例如是氨基醇，其中氨基和染料中的羧基通過形成酰胺基而實現(xiàn)連接，然后將羥基硫酸化。氨基醇的例子是2-氨基-1-乙醇、3-氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇、6-氨基-1-己醇、3-氨基-1,2-丙二醇、2-氨基1,3-丙二醇、3-氨基-1,2,4-丁三醇、羥基苯胺、4-氨基間苯二酚。
信號分子和特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元是通過常規(guī)官能基而相互連接在一起的。此等官能基例如是酯、醚、仲胺和叔胺、酰胺、以及以下結(jié)構(gòu)
通式Ⅰ之本發(fā)明化合物的制備是按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過聚亞甲基染料基體的修飾來進(jìn)行，所述染料基體包含可偶聯(lián)官能度(如羧基、氨基、羥基)。
因此，在得到起始化合物結(jié)構(gòu)的同時，這些基團可按照本領(lǐng)域已知的方式，通過與相應(yīng)的取代基反應(yīng)來進(jìn)行修飾。
聚亞甲基染料基體的合成根據(jù)文獻(xiàn)已知的方法來進(jìn)行，例如F.M.Hamerin The Cyanine Dyes and Related Compounds,John Wiley and Sons,New Yor,1964；Cytometry,10(1989),3-10；11(1990)418-430；12(1990)723-30；Bioconjuate Chem.4(1993)105-11；Anal.Biochem.217(1994)197-204；Tetrahedron 45(1989)4845-66；EP-0591 820 A1；J.Org.Chem.60(1995)2361-95。
本發(fā)明之染料-生物分子加成物(通式Ⅰ中l(wèi)不等于零)是根據(jù)文獻(xiàn)已知的方法通過使染料與生物分子A反應(yīng)來制備的。染料因此必須有可偶聯(lián)的活性基團，或者染料必須通過原位或者事先產(chǎn)生這些基團來進(jìn)行活化。對于生物分子中的氨基和巰基，活性基團例如是N-羥基琥珀酰亞胺基酯、N-羥基-琥珀酰亞胺基酯-3-硫酸、異硫氰酸酯、異氰酸酯、馬來酰亞胺基、鹵代乙?；⒁蚁┗撬峄?。偶聯(lián)優(yōu)選在含水介質(zhì)中進(jìn)行。在此情況下加料可根據(jù)化學(xué)計量和反應(yīng)時間來調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)Synth.Commun.23(1993)3078-94；DE-OS 3912046；CancerImmunol.Immunother.41(1995)257-263；Cancer Research 54(1994)2643-49。
本發(fā)明的又一個目的是通式Ⅰ之本發(fā)明化合物通過NIR-輻射體內(nèi)診斷神經(jīng)變性疾病的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是通式Ⅰ之本發(fā)明化合物在體外診斷中的應(yīng)用。
為此，得到組織樣品或活組織樣品，并檢查它們的β-淀粉樣蛋白折疊結(jié)構(gòu)的含量。
出乎意料地，本發(fā)明的染料選擇性地結(jié)合在待檢查的樣品上，并借助于在近紅外光譜范圍內(nèi)的特異性發(fā)射的熒光而得到利用。
本發(fā)明的再一個目的是提供用于體內(nèi)診斷的診斷劑，其包括通式Ⅰ的化合物以及常規(guī)助劑和載體及稀釋劑。
根據(jù)本發(fā)明，在用于體內(nèi)診斷時，優(yōu)選通過鞘內(nèi)、腰髓內(nèi)或靜脈內(nèi)向組織給藥一種或多種所述物質(zhì)，然后輻射出近紅外范圍內(nèi)的光。同時/單獨記錄未被吸收并散射出的光和/或由染料發(fā)射并散射出的熒光輻射。該方法優(yōu)選是，其中組織大面積地輻射，并用CCD照相機拍攝局部釋放的熒光輻射，或者用光導(dǎo)體掃描待成象的組織區(qū)域，然后用計算機將得到的信號轉(zhuǎn)化為合成圖象。此外，光譜和/或相選擇性地以及穩(wěn)定和/或分辨時間地利用熒光。
與放射診斷法相比，本發(fā)明化合物的優(yōu)點例如在于，由于使用了更為穩(wěn)定的染料，可以在施用后的較長時間范圍內(nèi)通過激發(fā)染料產(chǎn)生熒光信號，并進(jìn)行檢測。這滿足了診斷所需要的較長時間，因為例如由于半衰期產(chǎn)生的限制就不存在了。
利用本發(fā)明就可以不必使用侵入性診斷方法，而直接在體內(nèi)檢測淀粉樣蛋白斑。
以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例1制備N-(2,3-二硫酸根)丙基-1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸酰胺，三鈉鹽1)1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸-N-羥基琥珀酰基酯，三鈉鹽在0.5g(0.7mmol)1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸和0.1g(0.9mmol)N-羥基琥珀酰亞胺在30ml無水DMF的溶液中，于0℃下在氬氣中滴加0.15g(0.75mmol)N,N′-二環(huán)己基碳化二亞胺。在室溫下攪拌72小時。然后在高真空下于40℃蒸發(fā)溶劑至約為5ml，并將殘留物在200ml乙醚中攪拌。傾析乙醚后，將產(chǎn)生的沉淀物重新用5ml二甲基甲酰胺溶解，并重復(fù)所述過程。所得的沉淀物在高真空下干燥，并于-20℃下在氬氣中保存。
產(chǎn)率0.55g(97％)，深蘭色粉末2)N-(2,3-二羥基)丙基-1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸酰胺，三鈉鹽0.5g(0.61mmol)1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸-N-羥基琥珀酰基酯溶解在20ml二甲基甲酰胺中，加入0.15g(0.92mmoL)2-氨基甲基-5,5-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-鹽酸鹽和0.1g(1.1mmol)三乙基胺在20ml二甲基甲酰胺中的溶液，在室溫下攪拌24小時。如上所述進(jìn)行處理。粗產(chǎn)物在室溫下于30ml水/甲醇/乙酸(3∶1∶2)中攪拌18小時，該溶液直接進(jìn)行色譜純制(Europrep,60-30C18,60A,20-45μ，洗脫劑水/甲醇)。
產(chǎn)率0.25 g(52％)，蘭色凍干物3)N-(2,3-二硫酸根)丙基-1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸酰胺，三鈉鹽在室溫下使0.25g(0.32mmol)N-(2,3-二羥基)丙基-1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸酰胺與0.22g(1.6mmol)三氧化硫-三甲基胺復(fù)合物在15ml二甲基甲酰胺中一起攪拌48小時。蒸發(fā)濃縮反應(yīng)混合物，用乙醚攪拌，然后色譜純化所沉淀的固體物質(zhì)(Europrep,60-30C18,60A,20-45μ，洗脫劑0.5％NaCl溶液/甲醇)。
產(chǎn)率0.20g(64％)，蘭色凍干物
λmax，吸收(H2O)=746nmλmax，熒光(H2O)=780nm實施例2二-1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸-α-D-葡糖胺-3″-硫酸酯，二鈉鹽(2)在0.5g(0.7mmol)1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸和0.1g(1.0mmol)三乙胺在20ml無水DMF的溶液中加入0.23g(0.7mmol)苯并三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基尿-四氟硼酸(TBTU)。在室溫下攪拌30分鐘后，滴加0.36g(1.4mmol)α-D-葡糖胺-3-硫酸酯和0.15g(1.5mmol)三乙基胺在25ml無水二甲基甲酰胺中的溶液。在室溫下繼續(xù)攪拌3小時。在高真空下于40℃蒸發(fā)溶劑，并將殘留物在乙醚中攪拌。過濾所形成的固體物質(zhì)，在RP硅膠柱(Europrep,60-30 C18,60A,20-45μ，洗脫梯度100％ 0.5％NaCl溶液-＞90％0.5％NaCl溶液/10％甲醇-＞90％水/10％甲醇-＞50％甲醇)上進(jìn)行色譜純制，然后冷凍干燥。
產(chǎn)率0.51g(76％)，深蘭色粉末
λmax，吸收(H2O)=745nmλmax，熒光(H2O)=779nm實施例3二-1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5,5′-二羧酸-二-α-D-葡糖胺-二-3″-硫酸酯，三鈉鹽(3)類似于實施例2進(jìn)行制備和純制，不同之處在于，用0.5g(0.66mmol)1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5,5′-二羧酸，0.2g(2.0mmol)三乙胺在25ml二甲基甲酰胺中，添加0.43g(1.32mmol)TBTU以及0.69g(2.64mmol)α-D-葡糖胺-3-硫酸酯和0.3g(3mmol)三乙基胺在30ml二甲基甲酰胺中。
產(chǎn)率0.56g(66％)，蘭色凍干物
λmax，吸收(H2O)=754nmλmax，熒光(H2O)=790nm實施例4N-軟骨生-二-1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸酰胺，鈉鹽(4)類似于實施例2進(jìn)行制備，不同之處在于，用0.5g(0.7mmol)1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-二羧酸，并使用0.43g(1.2mmol)軟骨生。反應(yīng)時間為5小時。用HPLC進(jìn)行純制(柱250×20mm,Nucleosil 100C18,7mm，洗脫劑50mM磷酸鹽緩沖液pH4/甲醇，在60分鐘內(nèi)甲醇由5％上升至95％)，隨后在RP-硅膠上脫鹽，并進(jìn)行冷凍干燥。
產(chǎn)率0.35g(48％)，蘭色凍干物
λmax，吸收(H2O)=746nmλmax，熒光(H2O)=779nm實施例5麥芽三糖-Indotricarbo花青加成物1)制備1-氨基-1-脫氧-麥芽三糖0.2g麥芽三糖在5ml飽和碳酸氫銨中于30℃攪拌7天。除去過量的碳酸氫銨，將溶液多次凍干至恒重。2)與1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸偶聯(lián)0.1g(0.14mmol)1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸和15mg三乙基胺在5ml二甲基甲酰胺中的溶液加入0.05g(0.15mmol)O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基尿-四氟硼酸(TBTU)，然后在室溫下攪拌30分鐘。繼續(xù)加入0.14g(0.28mmol)1-氨基-1-脫氧-麥芽三糖，并在室溫下再攪拌5小時。在40℃下真空除去二甲基甲酰胺后，用乙醚攪拌殘留物，過濾，并用色譜純制(Europrep,60-30 C18,60A,20-45μ，洗脫劑水/甲醇)。凍干后產(chǎn)率50％。
λmax，吸收(H2O)-748nmλmax，熒光(H2O)=779nm實施例6肝素-Indotricarbo花青-加成物根據(jù)類似于Nagasawa K.和Inoue Y.的方法(Carbohydrate Chemistry,Vol.Ⅲ,1980,291-294)對0.25g肝素(低分子量，M約為6000g/mol,Sigma制造)進(jìn)行部分去-N-硫酸化(25℃下3小時產(chǎn)率0.20g)。
將0.10g部分去-N-硫酸化的低分子量肝素溶解在40ml磷酸鹽緩沖液(0.1M磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，pH8.3)中，加入0.12g(0.15mmol)1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸-N-羥基琥珀?；モc鹽(見實施例1)在4ml二甲基甲酰胺中的溶液，在室溫下攪拌2小時。用蒸餾水(Centriprep 3000,Amicon制造)進(jìn)行超過濾來純制，冷凍干燥，在真空下于50℃干燥5小時。硫含量(用ICP-AES測量)S(％)肝素 11.55S(％)部分去-N-硫酸化的10.02S(％)用染料標(biāo)記后的 10.89λmax，吸收(H2O)=750nmλmax，熒光(H2O)=782nm實施例7Indotricarbo花青-Cys-β-淀粉樣蛋白-加成物1)制備N-[3-(3-馬來酰亞胺基芐氧基)氨基丙基]-二-1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸酰胺，鈉鹽根據(jù)已知的文獻(xiàn)方法通過與3-氨基丙基-叔丁基氨基甲酸酯的反應(yīng)，用三氟乙酸進(jìn)行酸性裂解使氨基游離，然后與3-馬來酰亞胺基苯甲酰氯反應(yīng)，由此使1,1′-二(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。2a)用Cys-β-淀粉樣蛋白(1-40)標(biāo)記用氬氣飽和，使所有溶劑除去氧。
10mg經(jīng)凍干的Cys-β-淀粉樣蛋白(1-40)溶解在1ml磷酸鹽緩沖液pH 7.8/DMF(2∶1混合物)中，然后添加10mg的N-[3-(3-馬來酰亞胺基芐氧基)氨基丙基]-二-1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青-5-羧酸酰胺鈉鹽。室溫下攪拌3小時，用5ml水稀釋，然后凍干溶液。
用HPLC(柱Merck Select B,5μ；洗脫劑水+0.05％三氟乙酸，乙腈)純制，得到4mg產(chǎn)物。
λmax，吸收(H2O)=747nmλmax，熒光(H2O)=780nm2b)用Cys-β-淀粉樣蛋白(12-20)標(biāo)記類似2a)進(jìn)行反應(yīng)。使5mgCys-β-淀粉樣蛋白(12-20)與10mg染料反應(yīng)，然后在室溫下攪拌2.5小時。用HPLC純制后得到6mg產(chǎn)物。
實施例8通過熒光檢測測定染料結(jié)構(gòu)與βA4-肽結(jié)合的結(jié)合實驗1)制備涂敷βA4-肽的膜并溫育結(jié)合βA4的染料結(jié)構(gòu)本結(jié)合實驗在涂敷βA4-肽的硝基纖維素膜(纖維素硝酸酯膜過濾器CN；0.4μm,Schleicher&Schuell制造)上進(jìn)行。膜的涂敷在一個Dot-Blot室(Stratagene制造)中進(jìn)行。該膜和吸墨紙(GB002,Schleicher&Schuell制造)用水弄濕，然后在TBST緩沖液(20mM Tris/HCl pH7.6；127mM NaCl；0.1％Tween 20；0.01％NaN3)中平衡。
將在0.2ml TBST緩沖液中的10、5和2.5μg肽涂敷在從βA4-肽的水溶液(2mg/ml)中取出的膜上。溫育15分鐘后，通過膜吸入肽溶液，用0.2ml TBST緩沖液沖洗，從Dot-Blot室中取出膜，然后在37℃干燥30分鐘。
在與染料溫育前，溫育經(jīng)干燥的膜，同時與TBST-Block緩沖液(TBST，同上；5％乳色粉末)輕輕搖動2小時，然后用TBST緩沖液洗滌5分鐘。與染料的溫育通過輕輕搖動在0.005-0.05％染料之TBST溶液中的膜來進(jìn)行。然后用TBTS緩沖液洗滌5次，在室溫下干燥膜，并封接住。2)熒光檢測評估將激光誘導(dǎo)的熒光照片轉(zhuǎn)化為實際的熒光成象系統(tǒng)。用波長為740nm的單色激光通過光導(dǎo)系統(tǒng)輻射的輸出耦合和纖維素膜的均勻照明來進(jìn)行激發(fā)。反射的激發(fā)光被縫隙式過濾器分流，而激光誘導(dǎo)的熒光在740nm以上，用CCD(電荷偶聯(lián)裝置)照相機對其進(jìn)行攝像，并將數(shù)據(jù)存儲為黑白圖象。
在

圖1和2中，顯示了膜熒光照片的例子。圖1在與二-1,1′-(4-磺基丁基)indotricarbo花青鈉鹽(0.005％溶液)溫育后纖維素膜的熒光照片激發(fā)波長740nm；檢測＞780nm1:2.5μg β-淀粉樣蛋白(1-42)2:5μg β-淀粉樣蛋白(1-42)3:10μg β-淀粉樣蛋白(1-42)4在纖維素膜上具有類似結(jié)合性質(zhì)的對照肽圖2在與4-[5-[3-羧基-3-羥基-1-(4-磺基苯基)-1H-吡唑-4-基]-2,4-戊二烯基]-4,5-二氫-5-氧-1-(4-磺基丁基)-1H-吡唑-3-羧酸二鉀鹽(0.005％溶液)溫育后纖維素膜的熒光照片激發(fā)波長650nm；檢測＞680nm5:2.5μg β-淀粉樣蛋白(1-42)6:5μg β-淀粉樣蛋白(1-42)7:10μg β-淀粉樣蛋白(1-42)8在纖維素膜上具有類似結(jié)合性質(zhì)的對照肽
權(quán)利要求
1.通式Ⅰ的化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽Fm(-Al)(-Bn)(-Wo)(Ⅰ)其中F是染料信號分子，其至少在600-1200nm的范圍內(nèi)具有一個最大吸收，A是結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的生物分子，B是結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的染料，W是結(jié)合β-淀粉樣蛋白斑的、親水性的低分子結(jié)構(gòu)單元，m是1或2的整數(shù)，或者當(dāng)n和o是零時，其為3-20的整數(shù)，l和n相互獨立地是0、1、或2，o是0、1、2、3、或4的整數(shù)，其條件是，l、n和o的和大于等于1。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中F是花青、Squarilium、Croconium、部花青、或Oxonol染料。
3.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中F是通式Ⅱ-Ⅳ的花青、Squarilium、或Croconium染料
其中，R1-R4以及R7-R10相互獨立地是氟、氯、溴、碘原子或者是硝基或-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NEuE2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、SO2NHE1、-E1，其中E1和E2相互獨立地是氫，飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C50烷基鏈，該鏈或部分該鏈可選擇性地形成一個或多個芳香性或飽和環(huán)狀C5-C6單元或二環(huán)C10單元，而且所述C1-C50烷基鏈被0-15個氧原子和/或0-3個羰基中斷和/或被0-5個羥基取代，而且每個相鄰的R1-R4和/或R7-R10可相互連接形成六元芳香碳環(huán)，或者是連接A、B或W的-個鍵，R5和R6相互獨立地是如上述定義的基團-E1或者是C1-C4磺基烷基鏈，Q是以下基團
其中R11為氫、氟、氯、溴、碘原子或者是硝基或者為-NE1E2、-OE1或-E1基團，其中E1和E2如上所述，R12是氫原子或者如上所述的E1基團，b為0、2、或3，X和Y相互獨立地是O、S-CH=CH-或者以下基團
其中R13和R14相互獨立地是氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C10烷基鏈，該烷基鏈可被最多至5個氧原子中斷和/或被最多至5個羥基取代，而且基團R13和R14可相互連接形成5或6元環(huán)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中F是通式Ⅴ的花青染料
其中p是2或3的整數(shù)，X和Y相互獨立地是O、S、-CH=CH-或CH(CH3)2，R19和R20相互獨立地是基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3H、-SO3H、-E1，其中E1和E2如上所述，其條件是，E1和E2不同時為氫原子，R21和R22相互獨立地是如上所述的基團-E1,C1-C4磺基烷基鏈，或者R19、R20、R21、R22、E1或E2為連接上述A、B或W的一個鍵。
5.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中F是通式Ⅵ的花青染料
其中p、X、Y、R21和R22如上所述，R23是-OE3、-COOE3、-CONHE3、-CONH(CH2)1-6-NHE3、-CONH(CH2)1-6-OE3、-CONH(CH2)1-6-COOE3或者-CONH(CH2)1-6-CONHE3，其中E3是具有至少一個-SO3H基團的單糖、寡糖或多糖。
6.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中F是通式Ⅶ的Oxonol染料
其中p、R19和R20如上所述，R24和R25相互獨立地是被羥基、羧基、硫酸、磺酸、烷基或烷氧基或羧酸酯基單取代-三取代的苯環(huán)。
7.如前述權(quán)利要求之一所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中A是抗體、抗體片段、特異性肽和蛋白質(zhì)、受體、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸、脂蛋白、碳水化合物、單糖、二糖或三糖、線性或分枝寡糖或多糖或它們的衍生物或者是右旋糖。
8.如前述權(quán)利要求之一所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中B是通式Ⅷ重氮染料
其中R15和R16相互獨立地是被-個或多個羥基、羧基、氨基、磺酸、烷氧羰基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或者芳基磺?；〈谋交蜉粱?，所述烷基中有最多6個碳原子，而所述芳基磺酰基中的芳基最多有9個碳原子；或者是染料F；R17和R18相互獨立地是羥基、羧基、磺酸、帶有最多至6個碳原子的烷基、烷氧基。
9.如前述權(quán)利要求之一所述的化合物，其特征在于，在通式Ⅰ中W是-OSO3H或者-SO3H，最多帶有60個碳原子的直鏈、支鏈、環(huán)狀或多環(huán)烷基、烯基、多烯基、炔基、芳基、烷芳基或芳烷基，它們被最多5個羥基、最多3個羧酸基和至少一個-OSO3H或-SO3H基團取代。
10.如前述權(quán)利要求之一所述的化合物，其特征在于，F(xiàn)與A、B和/或W相互獨立地通過酯、醚、仲胺或叔胺基、酰胺基或以下基團而連接在一起
11.如權(quán)利要求1所述的化合物在通過NIR輻射體內(nèi)診斷神經(jīng)變性疾病中的應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求1所述的化合物在通過NIR輻射體外診斷神經(jīng)變性組織中的應(yīng)用。
13.通過NIR輻射體內(nèi)診斷神經(jīng)變性疾病的光學(xué)診斷劑，其特征在于，其包含至少一種如權(quán)利要求1所述的化合物以及常規(guī)助劑和載體及稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式Ⅰ的化合物F
文檔編號C07H15/26GK1237911SQ97199895
公開日1999年12月8日 申請日期1997年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月19日
發(fā)明者喬納森·特納, 托馬斯·迪爾克斯, 沃爾夫哈德·澤姆勒, 凱·利夏, 比約恩·里夫克 申請人:柏林自由大學(xué)診斷研究所有限公司