專利名稱：可溶性多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)上皮細(xì)胞具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用和細(xì)胞增殖作用的新的可溶性多肽。
上皮組織的正常的形態(tài)發(fā)生受到來(lái)自于存在于上皮組織周圍的間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的因子的控制。而人們認(rèn)為起因于上皮組織形態(tài)發(fā)生異常的許多疾病的病因都是由于間充質(zhì)細(xì)胞的異常引起的。根據(jù)有關(guān)的知識(shí)闡明間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)上皮組織形態(tài)發(fā)生的控制機(jī)制引起了人們的興趣。然而，參與上皮組織形態(tài)發(fā)生的控制的物質(zhì)群在復(fù)雜的體系中受到時(shí)間上以及空間上的調(diào)控而表現(xiàn)的，由于分離這些物質(zhì)解析它們的功能是非常困難的，同時(shí)建立使上皮組織形態(tài)發(fā)生簡(jiǎn)單化的模型實(shí)驗(yàn)體系也很困難等理由，所以該領(lǐng)域的研究到現(xiàn)在為止也沒(méi)有看到很大的進(jìn)展。因此、為了闡明起因于上皮組織形態(tài)發(fā)生的疾病的發(fā)病機(jī)制以及確立這些疾病的治療方法等，上皮組織中形態(tài)發(fā)生的調(diào)控機(jī)制的解析是人們所急切盼望的。
在這樣的狀況下，與上皮組織形態(tài)發(fā)生的調(diào)控有關(guān)的上皮形態(tài)促成因子(epimorphin)被分離純化出來(lái)(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào))。已經(jīng)弄清楚了該物質(zhì)是以由277至289個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)為核心蛋白質(zhì)的生理活性物質(zhì)，主要是由間充質(zhì)細(xì)胞生物合成的。同時(shí)也已弄清楚了上皮形態(tài)促成因子作用于上皮細(xì)胞具有促進(jìn)上皮組織形態(tài)發(fā)生的作用、同時(shí)人們也已清楚如果在上皮形態(tài)促成因子沒(méi)有發(fā)揮其功能的條件下正常的組織形成不能進(jìn)行。
關(guān)于上皮形態(tài)促成因子的結(jié)構(gòu)特征、已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上皮形態(tài)促成因子分子在結(jié)構(gòu)上大致可以分為4個(gè)片段(歐洲專利公開(kāi)第0698666號(hào))。即、構(gòu)成上皮形態(tài)促成因子全長(zhǎng)的多肽從N末端一側(cè)開(kāi)始可以分為卷曲螺旋區(qū)(1)、功能域(2)、卷曲螺旋區(qū)(3)、以及C末端的疏水區(qū)。這些片段中，就功能域來(lái)說(shuō)該區(qū)域參與細(xì)胞粘著，可能與上皮形態(tài)促成因子的生理活性的表現(xiàn)有著密切的關(guān)系(上述歐洲專利公開(kāi)第0698666號(hào))。
由于上皮形態(tài)促成因子具有促進(jìn)正常的形態(tài)發(fā)生的作用，所以人們期待著該物質(zhì)用作預(yù)防和治療起因于形態(tài)發(fā)生異常的疾病的醫(yī)藥、或用作生發(fā)劑等醫(yī)藥的有效成分。然而、從哺乳動(dòng)物得到天然型上皮形態(tài)促成因子難溶于生理鹽水等水溶性的溶劑中，實(shí)際用作醫(yī)藥是困難的。因此、人們正嘗試創(chuàng)造能實(shí)質(zhì)上繼續(xù)保持天然型上皮形態(tài)促成因子的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用、溶解性優(yōu)良的上皮形態(tài)促成因子的衍生物。例如、已知有除去C末端的疏水區(qū)域的突變體(片段123)等衍生物(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào))。
有關(guān)作為上皮形態(tài)促成因子部分結(jié)構(gòu)的卷曲螺旋區(qū)(1)、以前人們清楚該區(qū)域具有使上皮形態(tài)促成因子可溶化的作用。然而、同時(shí)人們也清楚如果從上皮形態(tài)促成因子的N末端除去氨基酸，如除去卷曲螺旋區(qū)(1)的一部分，得到的突變體的細(xì)胞粘著活性降低(歐洲專利公開(kāi)第0698666號(hào))。就是說(shuō)、關(guān)于該區(qū)域的作用，就可溶性方面來(lái)說(shuō)，通過(guò)使片段(23)的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化等作用起著正作用，而就細(xì)胞粘著活性來(lái)說(shuō)、通過(guò)使功能域(2)屏蔽等作用起著負(fù)作用，這暗示著作為醫(yī)藥的可適用性被否定。而有關(guān)上皮形態(tài)促成因子的上述各區(qū)域(卷曲螺旋區(qū)(1)、功能域(2)、或卷曲螺旋區(qū)(3))的各種生理作用雖然也有關(guān)于細(xì)胞粘著活性的報(bào)告，但有關(guān)上皮形態(tài)促成因子中類似的促進(jìn)形態(tài)發(fā)生的作用到目前為止還不知道。
本發(fā)明的課題目的在于提供對(duì)上皮細(xì)胞具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的可溶性多肽。更具體講、提供作用于上皮細(xì)胞，促進(jìn)上皮組織形態(tài)發(fā)生、而且可溶解于生理鹽水等水性溶劑的多肽是本發(fā)明的課題。
而本發(fā)明的另一個(gè)課題是提供含有具有上述特征的多肽為有效成分的、在預(yù)防和/或治療起因于形態(tài)發(fā)生因子、例如上皮形態(tài)促成因子產(chǎn)生的量過(guò)少、或伴隨著組織或器官的破壞的疾病中有用的醫(yī)藥。本發(fā)明的另一個(gè)課題還可提供含有上述可溶性多肽為有效成分的促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)劑。
本發(fā)明人為解決上述課題銳意努力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)由構(gòu)成上皮形態(tài)促成因子的卷曲螺旋區(qū)(1)構(gòu)成的多肽是可溶于水性溶劑的、且作用于上皮細(xì)胞具有促進(jìn)上皮組織形態(tài)發(fā)生、以及對(duì)上皮細(xì)胞具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。本發(fā)明正是以上述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)完成的。這里、所謂的“促進(jìn)細(xì)胞增殖作用”意味著細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)日后可使其活細(xì)胞數(shù)目增加。就是說(shuō)、本發(fā)明提供的是具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的多肽、是通過(guò)下面的氨基酸序列(1)(序列表中的序列1)Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys ArgLys Asn Asp Asp Gly Asp Thr Val Val Val Val GluLys Asp His Phe Met Asp Asp Phe Phe His Gln ValGlu Glu Ile Arg Asn Ser Ile Asp Lys Ile Thr GlnTyr Val Glu Glu Val Lys Lys Asn His Ser Ile IleLeu Ser Ala Pro Asn Pro Glu Gly Lys Ile Lys GluGlu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Glu Ile Lys Lys ThrAla Asn Lys Ile Arg Ala Lys Leu Lys Ala Ile GluGln Ser Phe Asp Gln Asp Glu特定的多肽(本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中、該多肽有時(shí)也稱之“多肽(Ⅰ)”)。
還有、通過(guò)本發(fā)明提供的多肽是具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的多肽、是通過(guò)下面的氨基酸序列(Ⅱ)(序列表中的序列2)Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys ArgThr Asn Asp Asp Gly Asp Thr Ala Val Val Ile ValGlu Lys Asp His Phe Met Asp Gly Phe Phe His GlnVal Glu Glu Ile Arg Ser Ser Ile Ala Arg Ile AlaGln His Val Glu Asp Val Lys Lys Asn His Ser IleIle Leu Ser Ala Pro Asn Pro Glu Gly Lys Ile LysGlu Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Glu Ile Lys LysThr Ala Asn Arg Ile Arg Gly Lys Leu Lys Ser IleGlu GIn Ser Cys Asp Gln Asp Glu特定的多肽(本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中、該多肽有時(shí)也稱之“多肽(Ⅱ)”)。
另外、如果根據(jù)本發(fā)明也可提供特征為在上述氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)中置換、附加、和/或缺失1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的多肽；實(shí)質(zhì)上具有與天然型上皮形態(tài)促成因子的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用同樣的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的上述各個(gè)多肽；以及具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的上述各個(gè)多肽。這里、“氨基酸的置換、附加、缺失”、例如可以通過(guò)稱之定點(diǎn)誘變(site-directed mutagenesis)的方法進(jìn)行。
按照本發(fā)明的另外的實(shí)施方案可以提供含有上述多肽為有效成分的醫(yī)藥。作為該醫(yī)藥的優(yōu)選的樣式可以提供用于治療和/或預(yù)防起因于形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)少、或伴隨著組織或器官的破壞的疾病的醫(yī)藥；以及作為促毛發(fā)生長(zhǎng)劑用的醫(yī)藥。此外還提供含有將上述多肽提供給包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的給藥步驟的、治療和/或預(yù)防起因于形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)少、或伴隨著組織或器官的破壞的疾病的方法；提供含有將上述多肽提供給包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的步驟的、診斷起因于形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)少的疾病的方法；以及提供含有將上述多肽提供給包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的給藥步驟的促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)方法。
按照本發(fā)明的另外的實(shí)施方案可以提供特異識(shí)別本發(fā)明的上述多肽的抗體、優(yōu)選的是單克隆抗體。作為上述抗體的優(yōu)選的樣式可以提供能特異結(jié)合于上述多肽的、能抑制上述多肽對(duì)上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生的促進(jìn)作用的抗體；同時(shí)能特異結(jié)合于具有卷曲螺旋區(qū)(1)的上皮形態(tài)促成因子類物質(zhì)、能抑制上述多肽對(duì)上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生的促進(jìn)作用的抗體。另外可以提供含有以上述抗體為有效成分的醫(yī)藥、優(yōu)選的是能用于預(yù)防和/或治療起因于上皮形態(tài)促成因子存在過(guò)多的疾病的醫(yī)藥、以及能用作毛發(fā)生長(zhǎng)抑制劑的醫(yī)藥。此外、還提供含有將上述抗體提供給包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的步驟的、起因于形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)多的疾病的治療和/或預(yù)防的方法；提供含有將上述抗體提供給包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的步驟的、起因于形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)多的疾病的診斷方法；以及提供含有將上述抗體提供給包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的步驟的毛發(fā)生長(zhǎng)抑制方法。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是顯微鏡下拍攝的作為例2的對(duì)照只用DH-medium培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)的形態(tài)的照片。圖2是顯微鏡下拍攝的在有本發(fā)明的多肽(15μg/ml)存在下培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的照片。圖3是顯示用比圖1和圖2更高倍數(shù)顯微鏡拍攝的在有本發(fā)明的多肽(15μg/ml)存在下培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的結(jié)果的照片。圖4是顯示顯微鏡下拍攝的作為例4的對(duì)照只用DH-medium培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)的形態(tài)的結(jié)果的照片。圖5是顯示作為例4的陽(yáng)性對(duì)照在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的照片。圖6是顯示在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)以及抗H1抗體(5.2μg/ml)培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及由該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的照片。圖7是顯示在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)以及抗H1抗體(26μg/ml)培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及由該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的照片。圖8是顯示在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)以及抗H1抗體(130μg/ml)培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)形態(tài)的照片。圖9是顯示在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)以及抗H3抗體(5.2μg/ml)培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及由該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的照片。圖10是顯示在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)以及抗H3抗體(26μg/ml)培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及由該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的照片。圖11是顯示在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)以及抗H3抗體(130μg/ml)培養(yǎng)的MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟的細(xì)胞株)以及由該細(xì)胞形成的組織形態(tài)的照片。
通過(guò)本發(fā)明提供的上述的多肽(Ⅰ)相當(dāng)于由人的上皮形態(tài)促成因子的N末端的第1號(hào)氨基酸到第103號(hào)氨基酸所特定的卷曲螺旋區(qū)(1)(歐洲專利公開(kāi)第0698666號(hào))。而上述多肽(Ⅱ)相當(dāng)于由小鼠的上皮形態(tài)促成因子的N末端的第1號(hào)氨基酸到第104號(hào)氨基酸所特定的卷曲螺旋區(qū)(1)(上述歐洲專利公開(kāi)第0698666號(hào))。這些多肽與天然型上皮形態(tài)促成因子相比在水溶性方面更優(yōu)越、其特征是可溶于蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水等水性溶劑。例如、將該多肽溶解于水性溶劑后、即使通過(guò)100,000×g進(jìn)行1～2小時(shí)的離心處理，只要是0.2mg/ml以下的濃度實(shí)質(zhì)上也看不到有沉淀的生成。不過(guò)、并不是將本發(fā)明書(shū)中使用的“可溶”限定于上述的特定的溶解性來(lái)解釋。
而上述多肽(Ⅰ)或多肽(Ⅱ)的特征是實(shí)質(zhì)上具有與天然型上皮形態(tài)促成因子對(duì)上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用同樣的作用。所謂天然型上皮形態(tài)促成因子意味著例如通過(guò)哺乳類等動(dòng)物的間充質(zhì)細(xì)胞生物合成的上皮形態(tài)促成因子。作為天然型上皮形態(tài)促成因子例如有來(lái)自人、猴、牛、馬、羊、狗、貓、兔、大鼠、小鼠等的上皮形態(tài)促成因子，優(yōu)選的是來(lái)自人的上皮形態(tài)促成因子等。
天然型上皮形態(tài)促成因子中存在著通過(guò)基因剪接形成的多個(gè)同等型。例如、就人的上皮形態(tài)促成因子來(lái)說(shuō)，就象特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)所給出的那樣存在著由288個(gè)氨基酸構(gòu)成的人的上皮形態(tài)促成因子、以及分別由287個(gè)和277個(gè)氨基酸構(gòu)成的人的上皮形態(tài)促成因子的同等型A和B。就小鼠的上皮形態(tài)促成因子來(lái)說(shuō)，存在著由289個(gè)氨基酸構(gòu)成的小鼠的上皮形態(tài)促成因子、以及分別由288個(gè)和279個(gè)氨基酸構(gòu)成的小鼠的上皮形態(tài)促成因子的同等型A和B。在本說(shuō)明書(shū)中說(shuō)到天然型上皮形態(tài)促成因子時(shí)、是作為包括了所有的同等型的概念使用的。
本發(fā)明的多肽中除了包括上述多肽(Ⅰ)和多肽(Ⅱ)以外、還包括多肽(Ⅰ)和多肽(Ⅱ)的組成氨基酸中的1個(gè)或2個(gè)氨基酸被其它的氨基酸置換、缺失、和/或在上述多肽鏈中附加1個(gè)或2個(gè)以上的任意的氨基酸的上述多肽(Ⅰ)和多肽(Ⅱ)的氨基酸的變異體、實(shí)質(zhì)上對(duì)上皮細(xì)胞具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用和細(xì)胞增殖作用的多肽。雖然對(duì)置換和/或附加1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的種類沒(méi)有特別的限定、但最好是L-氨基酸。本發(fā)明的多肽中、包含上述多肽(Ⅰ)或多肽(Ⅱ)、或以它們的氨基酸變異體作為多肽中的部分序列、實(shí)質(zhì)上具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用或細(xì)胞增殖作用的多肽。例如、即便在上述多肽(Ⅰ)或多肽(Ⅱ)的N末端和/或C末端結(jié)合1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸也可以、最好是結(jié)合由2個(gè)以上的任意的氨基酸構(gòu)成的任意的寡肽。雖然這樣的氨基酸的種類沒(méi)有特別的限定、但最好是從L-氨基酸中選擇。例如、在上述多肽(Ⅰ)和多肽(Ⅱ)的N末端作為末端序列結(jié)合1～10個(gè)左右、優(yōu)選的是結(jié)合5～7個(gè)、特別優(yōu)選的是結(jié)合6個(gè)L-組氨酸的多肽作為標(biāo)記序列、該多肽由于可以利用特異結(jié)合于附加的標(biāo)記序列的抗體和鎳等物質(zhì)可以簡(jiǎn)便地純化、檢測(cè)、所以從生產(chǎn)效率的觀點(diǎn)看是優(yōu)選的多肽。以提高親水性或體內(nèi)的穩(wěn)定性等的功能性的改善和提高形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用等為目的將特定的末端序列附加在多肽也是可能的。此外、通過(guò)附加可結(jié)合于特定分子的末端序列、也可制造出改善了對(duì)特定的組織或器官的藥物釋放效率的融合蛋白質(zhì)等。
上述多肽即使是游離形態(tài)也是可以的、即便作為鹽酸鹽、醋酸鹽、或?qū)妆交撬岬人峒映甥}、或銨鹽或有機(jī)胺鹽等堿加成鹽提供也可以。因此、本說(shuō)明書(shū)中說(shuō)到多肽時(shí)、是應(yīng)當(dāng)解釋為包含上述那樣的鹽的形態(tài)的多肽。另外、除了上述各個(gè)多肽上結(jié)合了任意的糖類(單糖、二糖、寡糖、或多糖)的多肽和結(jié)合了脂類等物質(zhì)的多肽以外、磷酸化的多肽也包含在本發(fā)明的多肽的范圍。
在本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中就作為上述可溶性多肽的優(yōu)選樣式的多肽(Ⅰ)具體地說(shuō)明了對(duì)來(lái)自腎臟的MDCKⅡ細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的試驗(yàn)方法。因此、本領(lǐng)域技術(shù)人員參照這些試驗(yàn)例子、或?qū)@些方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖兒托揎検强梢院苋菀椎刈C實(shí)上述定義的各個(gè)多肽具有所期望的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的事實(shí)。而、上皮形態(tài)促成因子對(duì)上皮組織形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用因?yàn)樵诶缣亻_(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)的實(shí)施例中已有詳細(xì)記載、所以即使應(yīng)用這樣的試驗(yàn)體系確認(rèn)形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用也是可能的。
雖然并不拘泥于任何特定的理論、但天然型人的上皮形態(tài)促成因子通過(guò)存在于中央片段(功能域通過(guò)由N末端第104到第187的氨基酸殘基特定的片段)細(xì)胞粘著區(qū)結(jié)合于存在于上皮細(xì)胞外表面的上皮形態(tài)促成因子的受體在被固定于上皮細(xì)胞表面的基礎(chǔ)上、含有多肽(Ⅰ)的區(qū)域(天然型人的上皮形態(tài)促成因子的卷曲螺旋區(qū)從上皮形態(tài)促成因子的N末端到第103號(hào)氨基酸殘基的部分)結(jié)合乃至作用于參與形態(tài)發(fā)生的受體后表現(xiàn)出形態(tài)發(fā)生作用的可能性是存在的。
另外、本發(fā)明的上述多肽雖然對(duì)上皮組織與天然型上皮形態(tài)促成因子具有實(shí)質(zhì)上的同樣的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用、但其作用的強(qiáng)弱并沒(méi)有特別限定。例如、在于天然型人的上皮形態(tài)促成因子同等程度或在其以下的濃度能夠發(fā)揮形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用就很優(yōu)選了。而、本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中雖然具體地記載了有代表性的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的試驗(yàn)方法(對(duì)來(lái)自腎臟細(xì)胞的管結(jié)構(gòu)形成作用的試驗(yàn)方法)、但上述多肽的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用并不限定于該作用。而本發(fā)明的多肽對(duì)上皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。因此、通過(guò)本發(fā)明的多肽達(dá)成的形態(tài)發(fā)生是以伴隨細(xì)胞增殖的形態(tài)發(fā)生為特征的。本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中雖然給出了本發(fā)明的多肽的細(xì)胞增殖促進(jìn)活性的試驗(yàn)例子、但本發(fā)明的多肽的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用并不限定于通過(guò)該試驗(yàn)例子所表明的特定的作用。
雖然有關(guān)天然型上皮形態(tài)促成因子的數(shù)種形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用已有報(bào)道、應(yīng)當(dāng)理解為這些作用可能是作為天然型上皮形態(tài)促成因子表現(xiàn)的各種各樣的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的部分作用。因此、所謂形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的用語(yǔ)不限于以往報(bào)道或已被確認(rèn)的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用、有必要以最廣義地解釋。例如、形態(tài)發(fā)生誘導(dǎo)活性、器官·形態(tài)發(fā)生支持作用等概念也是包含在形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用內(nèi)的概念。而所謂的實(shí)質(zhì)上同樣的用語(yǔ)也不應(yīng)當(dāng)限定解釋。本發(fā)明的多肽除了具有天然型上皮形態(tài)促成因子的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用、具有與該作用不同的其它形態(tài)發(fā)生作用的情形也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
上述多肽可以通過(guò)肽合成中通常使用的固相法和液相法等化學(xué)上的手法合成。作為肽合成中氨基等的保護(hù)基以及縮合反應(yīng)的縮合劑可以使用例如鈴木弘一編《蛋白質(zhì)工程-基礎(chǔ)和應(yīng)用》(1992年，丸善株式會(huì)社)；ボンダンスキ-等人著《肽的合成》(1976,John Wiley&Sons,N.Y.)；以及スチュヮ-ト等人著《固相肽合成》(1969年，W.H.Freeman andCo.,San Francisco)等記載的試劑。若用固相法可以利用市售的各種肽合成裝置。而按照通常的基因表達(dá)操作等生物學(xué)上的手法在制造含有編碼上述多肽的DNA序列的重組載體后、培養(yǎng)通過(guò)該載體轉(zhuǎn)化的微生物(轉(zhuǎn)化體)、從培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中可以分離純化所期望的上述可溶性多肽。而上述多肽的制造方法并不限定于這些化學(xué)的方法和生物學(xué)的方法。作為通過(guò)基因表達(dá)的制造方法可利用的DNA可以舉出下列的堿基序列ATG CGG GAC CGG CTG CCA GAC CTG ACG GCG TGT AGGAAG AAT GAT GAT GGA GAC ACA GTT GTT GTG GTT GAGAAA GAT CAT TTC ATG GAT GAT TTC TTC CAT CAG GTGGAG GAG ATT AGA AAC AGT ATT GAT AAA ATA ACT CAATAT GTT GAA GAA GTA AAG AAA AAC CAC AGC ATC ATTCTT TCT GCA CCA AAC CCG GAA GGA AAA ATA AAA GAAGAG CTT GAA GAT CTG AAC AAA GAA ATC AAG AAA ACTGCG AAT AAA ATT CGA GCC AAG TTA AAG GCT ATT GAACAA AGT TTT GAT CAG GAT GAG(省略了互補(bǔ)的堿基序列，只給出了有意義鏈、序列中、起點(diǎn)是5′末端、終點(diǎn)是3′末端)。
該DNA相當(dāng)于編碼天然型人的上皮形態(tài)促成因子的全長(zhǎng)的DNA(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)給出的式(6)所表示的核酸序列)當(dāng)中、從第1個(gè)到第309個(gè)的核苷酸序列、是編碼上述多肽(Ⅰ)的DNA。上述多肽(Ⅱ)的制造中、例如可以利用編碼天然型小鼠的上皮形態(tài)促成因子的全長(zhǎng)的DNA(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)給出的式(12)所表示的核酸序列)當(dāng)中、由從第1到第312的核苷酸序列所特定的DNA。
另外、利用上述來(lái)自人的DNA或來(lái)自小鼠的DNA通過(guò)常規(guī)方法制造氨基酸突變體可能是很容易的。作為這樣的方法可以利用例如《PCR實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(1991年，HJB出版局)第155～160頁(yè)記載的重組PCR法或《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊Vol.8,No.9》(1990年，羊土社)第63～67頁(yè)記載的PCR的制備變異基因的方法等。為了制造所期望的多肽作為可能利用的基因表達(dá)方法可以利用例如歐洲專利公開(kāi)第0698666號(hào)說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中詳細(xì)記載的方法、但并不限定于這些方法。
本發(fā)明的上述多肽作用于上皮細(xì)胞具有促進(jìn)上皮性組織或器官等形態(tài)發(fā)生。因此、本發(fā)明的多肽作為伴隨著起因于內(nèi)因性的形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)少等的組織和器官的形態(tài)發(fā)生的異常的疾病、或伴隨組織或器官的破壞引起的疾病的治療和/或預(yù)防的醫(yī)藥的有效成分或作為用于上述疾病的診斷的醫(yī)藥的有效成分是很有用的。而上述多肽作為用于毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑的醫(yī)藥的有效成分也是很有用的。本說(shuō)明書(shū)中說(shuō)到的醫(yī)藥用語(yǔ)除了用于在包含人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的病的預(yù)防、治療以及診斷外、通常從廣義上講還用作包含作為分類為外用藥的毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑和毛發(fā)生長(zhǎng)抑制劑等。
作為形態(tài)發(fā)生因子已知包含天然型上皮形態(tài)促成因子在內(nèi)的各種各樣的因子。本發(fā)明的醫(yī)藥在伴隨起因于上述的形態(tài)發(fā)生因子、特別是上皮形態(tài)促成因子的表達(dá)過(guò)少的組織和器官的形態(tài)發(fā)生異常的疾病的預(yù)防和/或治療中是很有用的。對(duì)于炎性疾病、癌、燒傷、手術(shù)、或創(chuàng)傷、以及它們的治療過(guò)程等、伴隨著上皮性的組織或器官的破壞的疾病(可以用作包含傷害在內(nèi)的概念)、以促進(jìn)上皮組織和器官的再生為目的使用本發(fā)明的醫(yī)藥是可能的。
更具體地說(shuō)，例如、慢性腎炎等腎臟疾??；肺炎、肺氣腫、肺結(jié)核、慢性閉塞性肺病、塵肺、吞咽性肺炎等慢性和急性肺病；慢性支氣管炎等氣管和支氣管病；急性肝炎；慢性肝炎；肝硬變、重癥肝炎等肝病；癌；良性前列腺肥大；消化性潰瘍；創(chuàng)傷；皮膚潰瘍等疾病通過(guò)其它的具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的生理活性物質(zhì)(例如HGF和EGF等)治療是可能的，可期望本發(fā)明的醫(yī)藥對(duì)這些疾病也有效。
在將本發(fā)明的醫(yī)藥用于起因于上皮形態(tài)促成因子的表達(dá)過(guò)少的疾病的患者時(shí)、一般都可看出該疾病癥狀的減輕、所以可以對(duì)該疾病進(jìn)行確診。就象本發(fā)明的實(shí)施例所具體給出的那樣、本發(fā)明的多肽特別對(duì)腎細(xì)胞具有強(qiáng)有力的細(xì)胞增殖作用和形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用。因此、在治療時(shí)，例如對(duì)腎小管上皮細(xì)胞需要再生和需要保證的腎病患者、本發(fā)明的醫(yī)藥特別適用。例如、本發(fā)明的醫(yī)藥可能適用于急性腎小球腎炎、急速進(jìn)行性腎炎、慢性腎小球腎炎等慢性腎炎、腎變病綜合癥、慢性腎衰竭、腎癌等腎病患者。
本發(fā)明的醫(yī)藥適用的對(duì)象并不限定于上述例子中給出的患者、應(yīng)該理解為對(duì)認(rèn)為與1種或2種以上的形態(tài)發(fā)生因子的表達(dá)過(guò)少、特別是上皮形態(tài)促成因子的表達(dá)過(guò)少有關(guān)的疾病、以及伴隨組織或器官的實(shí)質(zhì)性破壞的患者都有可能適用。而含有本發(fā)明的多肽作為有效成分的毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑的用途應(yīng)該從最廣義上解釋為包含促進(jìn)毛發(fā)發(fā)育和促進(jìn)生發(fā)等用途。
作為本發(fā)明的醫(yī)藥可以直接從上述多肽中選擇出1種或2種以上的物質(zhì)使用也可以，通常、優(yōu)選的是使用制劑學(xué)上容許的1或2種以上的制劑用添加劑制造成含有1種或2種以上的上述物質(zhì)作為有效成分的醫(yī)藥組合物、用于上述患者的治療和/或預(yù)防。從溶解度、吸收以及排泄等體內(nèi)動(dòng)態(tài)、和/或的制造方法等觀點(diǎn)看、上述多肽即使是生理學(xué)上容許的鹽的形態(tài)也可以。作為上述醫(yī)藥組合物的給藥途徑、例如有從靜脈給藥、直腸內(nèi)給藥、口服給藥等全身給藥以外、也可外用、點(diǎn)眼、點(diǎn)鼻、點(diǎn)耳、局部注射等局部給藥。
例如靜脈內(nèi)給藥用針劑或點(diǎn)滴劑等全身給藥劑、或軟膏、乳膏劑、貼劑、或局部注射劑等局部給藥劑都是本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的優(yōu)選形態(tài)。通過(guò)使用將有效成分封入了脂質(zhì)體等的醫(yī)藥組合物和結(jié)合了抗體等的醫(yī)藥組合物、有時(shí)可以改善對(duì)靶器官的親和性和選擇性。再者、給藥途徑可根據(jù)適用對(duì)象的患者的種類、治療或預(yù)防的目的、患部的種類、患者的狀態(tài)等適當(dāng)選擇、不用說(shuō)可以適當(dāng)選擇最適于給藥途徑的各種各樣的制劑形態(tài)。用作診斷藥的形態(tài)也沒(méi)有特別的限定、但診斷方法中除了包含將本發(fā)明的醫(yī)藥給予患者外，也包含使用從患者分離和采集的生物體樣品進(jìn)行分析的情況。
含有1種或2種上述多肽作為有效成分的毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑最好是提供乳膏劑、噴霧劑、涂布用的溶液制劑、或貼劑等、作為非常適合于作為毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用目的形態(tài)的制劑。上述可溶性多肽即使是生理學(xué)上容許的鹽的形式也可以、為了使透過(guò)皮膚的膠原層作為有效成分的上述多肽有效地經(jīng)皮膚吸收、將適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┖椭苄晕镔|(zhì)等摻入到乳膏劑等制劑中也是合適的。而本發(fā)明的多肽的用途并不限定于上述的醫(yī)藥上、例如、作為對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基的添加劑使用也是可能的。
按照本發(fā)明的第二種實(shí)施方案能夠提供特異識(shí)別本發(fā)明多肽的抗體、優(yōu)選的是特異識(shí)別上述多肽(Ⅰ)或(Ⅱ)的抗體、最好是單克隆抗體。本發(fā)明的抗體能夠?qū)Ρ景l(fā)明的多肽(優(yōu)選的是識(shí)別上述多肽(Ⅰ)或(Ⅱ))、或者具有卷曲螺旋區(qū)(1)的上皮形態(tài)促成因子類(最好是來(lái)自人或小鼠的天然型上皮形態(tài)促成因子)特異結(jié)合、對(duì)上述物質(zhì)的促進(jìn)上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生作用具有抑制作用。本說(shuō)明書(shū)中上皮形態(tài)促成因子類用語(yǔ)是以包含天然型上皮形態(tài)促成因子以及具有與天然型上皮形態(tài)促成因子實(shí)質(zhì)上同樣生理作用的天然型上皮形態(tài)促成因子變化體(上皮形態(tài)促成因子變化體)、以及具有與天然型上皮形態(tài)促成因子實(shí)質(zhì)上同樣的生理作用的它們的氨基酸的突變體的概念使用的。
本說(shuō)明書(shū)中所謂的上皮形態(tài)促成因子變化體是指具有與天然型上皮形態(tài)促成因子實(shí)質(zhì)上同樣生理作用的(例如對(duì)上皮細(xì)胞的細(xì)胞粘著作用和對(duì)上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用)多肽、來(lái)自上述天然型上皮形態(tài)促成因子的多肽序列(通常是由277乃至289個(gè)氨基酸組成的多肽)的部分多肽序列、或是含有來(lái)自天然型上皮形態(tài)促成因子的多肽序列的上述部分多肽序列作為其部分序列的多肽。例如除去天然型上皮形態(tài)促成因子C末端的多肽(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào))就是上皮形態(tài)促成因子變化體的代表化合物。而在本說(shuō)明書(shū)中所謂的天然型上皮形態(tài)促成因子或上皮形態(tài)促成因子的變化體的氨基酸突變體是指實(shí)質(zhì)上具有與天然型上皮形態(tài)促成因子同樣的上述生理作用的多肽、構(gòu)成上述天然型上皮形態(tài)促成因子或上皮形態(tài)促成因子變化體的多肽鏈的氨基酸中的1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸被別的氨基酸置換后、它們的構(gòu)成氨基酸的1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸缺失后、和/或在上述多肽鏈中插入1個(gè)或2個(gè)以上的任意的氨基酸后形成的多肽。
除了上述公報(bào)等公布的上皮形態(tài)促成因子變化體之外、按照公布的方法、或在公布的多肽變化體中通過(guò)改變以至修飾的方法可能制造的上皮形態(tài)促成因子變化體只要是滿足任一種上述的定義都應(yīng)理解為包含在本說(shuō)明書(shū)中的上皮形態(tài)促成因子變化體。而有關(guān)天然型上皮形態(tài)促成因子或上皮形態(tài)促成因子的變化體的氨基酸突變體的制造方法雖然在特愿平7-175539號(hào)說(shuō)明書(shū)以及特愿平8-99684號(hào)說(shuō)明書(shū)中具體地說(shuō)明了、但并不限定于這些方法、無(wú)論通過(guò)哪種方法制造的氨基酸突變體都可以。而通過(guò)這些上皮形態(tài)促成因子變化體或它的氨基酸突變體的生理活性的檢測(cè)方法可以按照特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)或國(guó)際公開(kāi)W097/40158中詳細(xì)說(shuō)明的天然型上皮形態(tài)促成因子的生理活性檢測(cè)方法進(jìn)行。例如、如果能確認(rèn)特愿平8-102553號(hào)說(shuō)明書(shū)實(shí)施例記載的胎小鼠肺的支氣管的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用和、胎小鼠上顎皮膚的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用等就可以。作為結(jié)合于上皮形態(tài)促成因子類抑制它們的作用的抗體、以前已知有MC-1(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)；《細(xì)胞》CELL,69,pp.471-481,1992)。本發(fā)明的抗體與上述的MC-1同樣在為闡明上皮形態(tài)促成因子類引起的上皮組織的正常的形態(tài)發(fā)生的機(jī)制方面是有用的、同時(shí)可以用于闡明起因于天然型上皮形態(tài)促成因子的表達(dá)異常(表達(dá)過(guò)多)的疾病的發(fā)病機(jī)制、以及也可用作這些疾病的預(yù)防和/或治療的醫(yī)藥的有效成分。而本發(fā)明的抗體也用作毛發(fā)生長(zhǎng)抑制劑的醫(yī)藥的有效成分。
作為本發(fā)明的抗體的制造方法的一個(gè)例子實(shí)施例中詳細(xì)地記載了利用上述多肽(Ⅱ)的多克隆抗體制造方法。因此、本發(fā)明的多肽在適宜的條件下作為抗原可作用于哺乳動(dòng)物、按照通常的方法免疫哺乳動(dòng)物、以及按照眾所周知的或慣用的方法很容易地制造特異識(shí)別包含本發(fā)明的多肽在內(nèi)的任意多肽的多克隆抗體或單克隆抗體，這些過(guò)程容易為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。
作為起因于1種或2種以上的形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)多的疾病、例如有慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎細(xì)胞癌和皮膚癌等癌癥、動(dòng)脈硬化、膠原病、造血器官疾病、腎病、肌營(yíng)養(yǎng)障礙、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)纖維瘤、Sturge-Weber綜合癥、結(jié)節(jié)性硬化癥、神經(jīng)管閉塞性障礙、節(jié)性異常、迷走障礙、胼胝體發(fā)生、腦孔癥、以及腦積水等疾病、以本發(fā)明的抗體為有效成分的醫(yī)藥有希望作于上述疾病的治療和/預(yù)防、以及診斷。
還有、本發(fā)明的醫(yī)藥的適用對(duì)象并不限定于這些疾病、與1種或2種以上的形態(tài)發(fā)生因子表達(dá)過(guò)多、特別是與天然型上皮形態(tài)促成因子的表達(dá)過(guò)多有關(guān)的疾病都可理解為適用的對(duì)象。還有、上述抗體作為有效成分的毛發(fā)生長(zhǎng)抑制劑的用途也應(yīng)當(dāng)最廣義地理解為包含脫毛、抑制毛發(fā)發(fā)育、以及抑制生發(fā)等用途。而、含有本發(fā)明的抗體作為有效成分的醫(yī)藥通常使用制劑學(xué)上容許的1種或2種以上的制劑用的添加劑制備成醫(yī)藥組合物、醫(yī)藥的形態(tài)、制備方法、以及醫(yī)藥組合物的給藥途徑等可利用上述給出的說(shuō)明。
以下、通過(guò)實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明、但本發(fā)明的范圍并不限定于以下的實(shí)施例。實(shí)施例1本發(fā)明的多肽的制造通過(guò)PCR制備在位于由小鼠的天然型上皮形態(tài)促成因子的N末端氨基酸開(kāi)始的1～104號(hào)氨基酸的DNA序列(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)給出的式(12)給出的核酸序列中、由第1個(gè)到第312個(gè)核苷酸所特定的DNA)5′側(cè)添加編碼蛋氨酸以及6個(gè)組氨酸的ATGCATCATCATCATCATCAT(編碼合計(jì)111個(gè)氨基酸)、3′末端添加終止子密碼的cDNA。將該cDNA重組到缺失了2個(gè)EcoRV位點(diǎn)間的區(qū)域的pET3C載體的NdeI,NhelI位點(diǎn)、制備表達(dá)用的載體。
利用Hanahan法(《實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)遺傳工程》、丸善株式會(huì)社發(fā)行)將得到的表達(dá)載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21菌株。作為導(dǎo)入方法如下、在冰上溶解感受態(tài)細(xì)胞、向100μl感受態(tài)細(xì)胞溶液中添加適量的表達(dá)載體(加入1μl的1mg/ml的DNA溶液)、于冰上放置10分鐘后進(jìn)行。然后、于42℃的培養(yǎng)箱中放置2分鐘、最后再于冰上放置30分鐘完成導(dǎo)入。
接下來(lái)、將上述的轉(zhuǎn)化體涂布于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB平板上(1％Bacto-tryptone,0.5％Bacto-yeast extract,1％NaCl,1.5％Bacto-agar)、選擇生長(zhǎng)下來(lái)的菌落進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化體的篩選。而作為最終確認(rèn)含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體、通過(guò)PCR確認(rèn)編碼目的多肽的DNA的有無(wú)(此時(shí)10個(gè)克隆中有9個(gè)克隆保持著DNA)、得到含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。將得到的轉(zhuǎn)化體用含有氨芐青霉素(50μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基(1％Bacto-tryptone,0.5％Bacto-yeast extract,1％NaCl)、通過(guò)37℃的振蕩培養(yǎng)大量增殖后、在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)表達(dá)的物質(zhì)IPTG,使其最終濃度為1mM。然后繼續(xù)于37℃的振蕩2小時(shí)、使目的多肽在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)的多肽的純化按照使用了QIAGEN公司的Ni2+-NTA-Agarose(Cat.No.30230)的程序進(jìn)行。純化的多肽通過(guò)SDS-PAGE(CBB染色)確認(rèn)具有95％以上的純度。純化后的多肽對(duì)磷酸緩沖生理鹽水(PBS)的溶解度是0.15mg/ml。實(shí)施例2本發(fā)明的多肽對(duì)MDCKⅡ細(xì)胞(來(lái)自腎臟細(xì)胞株)的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用象以下那樣評(píng)價(jià)實(shí)施例1中制備的多肽對(duì)器官的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用。
將滅菌的トレフ試管立在冰中、加入1/10容積的10×DH-medium(Dulbecco改進(jìn)的MEM培養(yǎng)基和ハムF12培養(yǎng)基等量混合培養(yǎng)基)、1/10容量的再構(gòu)成緩沖液(260mM NaHCO3,200mM HEPES,50mM NaOH)。再向該試管中加入8/10容量的新田明膠制的膠原溶液Ⅰ-P、利用移液管反復(fù)吸放混合。將實(shí)施例1制備的多肽對(duì)DH-medium透析后、加到トレフ試管，終濃度為15μg/ml。作為對(duì)照加入等量的DH-medium。然后、向試管中加入取自腎臟的細(xì)胞株MDCKⅡ(104cells/well)，通過(guò)移液管反復(fù)吸放混合。
按照每個(gè)孔為200μl/well那樣將上述混合物添加到48孔的多孔盤(pán)中、于37℃的培養(yǎng)箱中保溫1小時(shí)使混合物凝膠化。然后按800μl/well添加無(wú)血清的DH-medium于37℃使其平衡1小時(shí)、除去培養(yǎng)基、但注意不要弄壞凝膠。繼續(xù)按500μl/well添加無(wú)血清的DH-medium、于37℃的5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周、觀察形態(tài)。
圖1至圖3為在顯微鏡下拍攝的進(jìn)行了2周培養(yǎng)后的細(xì)胞以及由該細(xì)胞形成的組織的照片。圖給出的是對(duì)照的結(jié)果(只加DH-medium)、圖2給出的是添加了本發(fā)明的多肽(15μg/ml)后培養(yǎng)的結(jié)果。圖1和圖2的照片都是用相同倍數(shù)(40倍)拍攝的結(jié)果、圖3給出的是用高倍數(shù)(100倍)拍攝的在凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(15μg/ml)后培養(yǎng)的結(jié)果。在將本發(fā)明的多肽添加到膠原凝膠中時(shí)細(xì)胞(MDCKⅡ)形成三維的管結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果表明本發(fā)明的多肽具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用(器官的形態(tài)發(fā)生支持作用)實(shí)施例3本發(fā)明多肽的制備用編碼來(lái)自人的天然型上皮形態(tài)促成因子的從N末端開(kāi)始的1～103的氨基酸的DNA序列(特開(kāi)平6-25295號(hào)公報(bào)給出的式(6)代表的核酸序列中、由第1個(gè)到第309個(gè)核苷酸所特定的DNA)取代編碼來(lái)自小鼠的天然型上皮形態(tài)促成因子的從N末端開(kāi)始的1～104的氨基酸的DNA序列、與實(shí)施例1一樣制備本發(fā)明的多肽。將該多肽進(jìn)行與實(shí)施例2同樣的試驗(yàn)時(shí)確認(rèn)該多肽對(duì)取子腎臟細(xì)胞株MDCKⅡ細(xì)胞具有與實(shí)施例1同樣的器官的形態(tài)發(fā)生支持作用。實(shí)施例4特異結(jié)合于本發(fā)明多肽的抗體的制備以及通過(guò)該抗體對(duì)形態(tài)發(fā)生的抑制分別使用在實(shí)施例1得到的多肽(以下稱H1)、以及作為對(duì)照在沒(méi)有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的自小鼠的天然型上皮形態(tài)促成因子的部分多肽(由N末端的189至263的氨基酸序列特定的多肽)的N末端添加了蛋氨酸和6個(gè)組氨酸的多肽(以下稱H3)、按照通常的方法(講談社Scientific《單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》pp.184～188)免疫大鼠、得到相應(yīng)的各個(gè)多肽的抗血清。使用Pharmacia制造的HiTrap Protein G(code No.17-0404-01)進(jìn)行IgG級(jí)分的分離得到多克隆抗體。純化操作按照附加的程序進(jìn)行。將得到的多克隆抗體進(jìn)行免疫印記、檢測(cè)各個(gè)抗體的特異性、調(diào)配效價(jià)以備以下實(shí)驗(yàn)用。
使用通過(guò)本發(fā)明多肽使來(lái)自腎臟細(xì)胞株MDCKⅡ細(xì)胞形成管結(jié)構(gòu)的實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)條件、在最終培養(yǎng)前分別將多克隆抗體加入到無(wú)血清的DH-medium(500μl/well)研究上述抗體對(duì)本發(fā)明的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的影響。表1和圖4至圖11給出了研究的結(jié)果。表中(++)表示形態(tài)發(fā)生、(+)表示形態(tài)發(fā)生被抑制了80％、(-)表示形態(tài)發(fā)生被100％抑制。圖4至圖11是表示顯微鏡下拍攝的培養(yǎng)了11天的細(xì)胞以及由該細(xì)胞形成的組織的照片。圖4給出的是對(duì)照的結(jié)果(只加DH-medium)、圖5給出的是凝膠中添加了本發(fā)明的多肽(H1,3μg/ml)培養(yǎng)的結(jié)果。圖6、圖7、和圖8給出的是分別添加了本發(fā)明的多肽H1抗體5.2μg/ml，26μg/ml，以及130μg/ml的結(jié)果。無(wú)論那一個(gè)照片都是用相同的倍數(shù)(40倍)拍攝的。表1
就象這些結(jié)果所表明的那樣抗H1抗體抑制本發(fā)明的多肽(HI)對(duì)MDCKⅡ細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生誘導(dǎo)活性抑制具有濃度依賴性、但抗H3抗體對(duì)上述形態(tài)發(fā)生誘導(dǎo)活性沒(méi)有抑制作用。從這一事實(shí)可以證明在實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)中觀察到的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用并不是例如由大腸桿菌等的雜質(zhì)引起的、而是源于本發(fā)明的多肽(H1)自身的作用。另外從本發(fā)明的抗H1抗體有效地抑制多肽H1的上皮形態(tài)促成因子形式的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用也可證明該抗體作為治療和/或預(yù)防起因于上皮形態(tài)促成因子的表達(dá)過(guò)剩導(dǎo)致的疾病的醫(yī)藥也是有用的。實(shí)施例5本發(fā)明多肽對(duì)細(xì)胞增殖的作用象以下那樣評(píng)價(jià)實(shí)施例1中制備的本發(fā)明多肽對(duì)細(xì)胞增殖的效果。作為培養(yǎng)基使用無(wú)血清的DH-medium或使用溶解0.003～0.15mg/ml的本發(fā)明多肽的無(wú)血清的DH-medium、按12,000cell/ml將MDCKⅡ細(xì)胞加到組織培養(yǎng)用的24孔盤(pán)中。在37℃的5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后、除去培養(yǎng)基、用PBS(-)洗2次。用胰蛋白酶-EDTA將細(xì)胞從孔中剝離下來(lái)后、用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)算活的細(xì)胞數(shù)目。就象表2所給出的那樣、MDCKⅡ細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行單層培養(yǎng)時(shí)如果培養(yǎng)液中不添加本發(fā)明的多肽、5天后活細(xì)胞大約減少1/10(對(duì)照)。另外、培養(yǎng)液中添加本發(fā)明的多肽時(shí)、盡管是無(wú)血清培養(yǎng)、MDCKⅡ細(xì)胞的增殖的誘導(dǎo)依賴于本發(fā)明的多肽的濃度。當(dāng)培養(yǎng)液中添加本發(fā)明的多肽0.075mg/ml、培養(yǎng)5天后可以看出活細(xì)胞數(shù)目是培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的10倍以上、這一結(jié)果可以與添加了10％胎牛血清的效果相接近、很清楚本發(fā)明的多肽具有極強(qiáng)的細(xì)胞增殖活性。
表2
培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)細(xì)胞數(shù)12000本發(fā)明的多肽是可溶于生理鹽水等水性溶劑的多肽、由于具有對(duì)上皮組織形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用、可以用作起因于形態(tài)發(fā)生異常引發(fā)的疾病的預(yù)防和/或治療藥物的有效成分等。
序列表序列號(hào)1序列長(zhǎng)度103序列類型氨基酸拓?fù)湫椭辨溞蛄蟹N類肽序列Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys Arg Lys Asn Asp1 5 10 15Asp Gly Asp Thr Val Val Val Val Glu Lys Asp His Phe Met Asp16 20 25 30Asp Phe Phe His Gln Val Glu Glu Ile Arg Asn Ser Ile Asp Lys31 35 40 45Ile Thr Gln Tyr Val Glu Glu Val Lys Lys Asn His Ser Ile Ile46 50 55 60Leu Ser Ala Pro Asn Pro Glu Gly Lys Ile Lys Glu Glu Leu Glu61 65 70 75Asp Leu Asn Lys Glu Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Ile Arg Ala76 80 85 90Lys Leu Lys Ala Ile Glu Gln Ser Phe Asp Gln Asp Glu91 95 100序列號(hào)2序列長(zhǎng)度104序列類型氨基酸拓?fù)湫椭辨溞蛄蟹N類肽序列Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys Arg Thr Asn Asp1 5 10 15Asp Gly Asp Thr Ala Val Val Ile Val Glu Lys Asp His Phe Met16 20 25 30Asp Gly Phe Phe His Gln Val Glu Glu Ile Arg Ser Ser Ile Ala31 35 40 45Arg Ile Ala Gln His Val Glu Asp Val Lys Lys Asn His Ser Ile46 50 55 60Ile Leu Ser Ala Pro Asn Pro Glu Gly Lys Ile Lys Glu Glu Leu61 65 70 75Glu Asp Leu Asn Lys Glu Ile Lys Lys Thr Ala Asn Arg Ile Arg76 80 85 90Gly Lys Leu Lys Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp Gln Asp Glu91 95 100序列號(hào)3序列長(zhǎng)度309序列類型核酸拓?fù)湫椭辨溞蛄蟹N類cDNA to mRNA序列ATG CGG GAC CGG CTG CCA GAC CTG ACG GCG TGT AGG AAG AAT GAT 45GAT GGA GAC ACA GTT GTT GTG GTT GAG AAA GAT CAT TTC ATG GAT 90GAT TTC TTC CAT CAG GTG GAG GAG ATT AGA AAC AGT ATT GAT AAA 135ATA ACT CAA TAT GTT GAA GAA GTA AAG AAA AAC CAC AGC ATC ATT 180CTT TCT GCA CCA AAC CCG GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTT GAA 225GAT CTG AAC AAA GAA ATC AAG AAA ACT GCG AAT AAA ATT CGA GCC 270AAG TTA AAG GCT ATT GAA CAA AGT TTT GAT CAG GAT GAG 309
權(quán)利要求
1．具有序列1記載的氨基酸序列的多肽。
2．由權(quán)利要求1記載的氨基酸序列中缺失、置換、和/或付加1個(gè)或2個(gè)氨基酸后的氨基酸序列構(gòu)成的、且對(duì)上皮細(xì)胞具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的多肽。
3．權(quán)利要求2記載的多肽，上述對(duì)上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用是象天然型上皮形態(tài)促成因子那樣的作用。
4．權(quán)利要求2或3任一項(xiàng)記載的多肽，是還具有細(xì)胞增殖作用的多肽。
5．權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)記載的多肽、是上述氨基酸序列中的氨基酸殘基被從糖類、脂類、磷酸基組成的組中至少選出的一個(gè)基團(tuán)修飾的多肽。
6．以權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的醫(yī)藥。
7．以權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的、能夠治療和/或預(yù)防起因于形態(tài)因子表達(dá)過(guò)少的疾病的醫(yī)藥。
8．權(quán)利要求7記載的醫(yī)藥，上述形態(tài)發(fā)生因子為上皮形態(tài)促成因子。
9．以權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的、能夠治療和/或預(yù)防伴隨組織或器官破壞的疾病的醫(yī)藥。
10．權(quán)利要求9記載的醫(yī)藥，上述疾病為腎病。
11．以權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑。
12．具有序列2記載的氨基酸序列的多肽。
13．由權(quán)利要求12記載的氨基酸序列中缺失、置換、和/或付加1個(gè)或2個(gè)以上氨基酸后的氨基酸序列構(gòu)成的、且對(duì)上皮細(xì)胞具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用的多肽。
14．權(quán)利要求13記載的多肽，上述對(duì)上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用是象天然型上皮形態(tài)促成因子那樣的作用。
15．權(quán)利要求13或14任一項(xiàng)記載的多肽，還具有細(xì)胞增殖作用。
16．權(quán)利要求12～15任一項(xiàng)記載的多肽、是上述氨基酸序列中的氨基酸殘基與從糖類、脂類、磷酸基組成的組中至少選擇出的一個(gè)基團(tuán)結(jié)合的多肽。
17．以權(quán)利要求12～16任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的醫(yī)藥。
18．以權(quán)利要求12～16任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的、能夠治療和/或預(yù)防起因于形態(tài)因子表達(dá)過(guò)少的疾病的醫(yī)藥。
19．權(quán)利要求18記載的醫(yī)藥，上述形態(tài)發(fā)生因子為上皮形態(tài)促成因子。
20．以權(quán)利要求12～16任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的、能夠治療和/或預(yù)防伴隨組織或器官破壞的疾病的醫(yī)藥。
21．權(quán)利要求20記載的醫(yī)藥，上述疾病為腎病。
22．以權(quán)利要求12～16任一項(xiàng)記載的多肽為有效成分的毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑。
23．含有權(quán)利要求4或15任一項(xiàng)記載的多肽的細(xì)胞培養(yǎng)基。
24．對(duì)權(quán)利要求1～5、或12～16任一項(xiàng)記載的多肽的抗體。
25．權(quán)利要求24記載的抗體、是抑制上述多肽的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用或細(xì)胞增殖作用的抗體。
26．權(quán)利要求24記載的抗體、是能特異結(jié)合于具有卷曲螺旋區(qū)域(1)的上皮形態(tài)促成因子類的、抑制上述多肽對(duì)上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用或細(xì)胞增殖作用的抗體。
27．以權(quán)利要求24或26任一項(xiàng)記載的抗體為有效成分的醫(yī)藥。
28．權(quán)利要求27記載的醫(yī)藥，能夠治療或預(yù)防上皮形態(tài)促成因子表達(dá)過(guò)多引起的疾病。
29．以權(quán)利要求24或26任一項(xiàng)記載的抗體為有效成分的毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供作為對(duì)上皮細(xì)胞具有形態(tài)發(fā)生促進(jìn)作用和細(xì)胞增殖作用的多肽、是由人的上皮形態(tài)促成因子的N末端的第1個(gè)氨基酸到第103個(gè)氨基酸所特定的多肽、以及由小鼠的上皮形態(tài)促成因子的N末端的第1個(gè)氨基酸到第104個(gè)氨基酸所特定的多肽、和以該多肽為有效成分的醫(yī)藥。所述多肽是可溶于水的多肽，可以用作伴隨形態(tài)發(fā)生異常引起的疾病、例如炎癥性疾病、燒傷、創(chuàng)傷等病癥的治療或預(yù)防的醫(yī)藥和用作用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的醫(yī)藥等醫(yī)藥的有效成分。
文檔編號(hào)C07K14/475GK1237982SQ9719974
公開(kāi)日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月18日
發(fā)明者越田將悟 申請(qǐng)人:住友電氣工業(yè)株式會(huì)社