專(zhuān)利名稱(chēng)：：轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：仔豬是養(yǎng)豬生產(chǎn)的基礎(chǔ)，是決定生產(chǎn)成本的關(guān)鍵，無(wú)論是哺乳仔豬或斷奶仔豬，由于其抗病弱、消化道不完善、死亡率高，從而對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，除飼養(yǎng)管理造成仔豬死亡外，由于消化不良和胃腸道菌群紊亂所導(dǎo)致的生長(zhǎng)停滯和死亡率居于首位。由于仔豬消化道結(jié)構(gòu)不完善，分泌淀粉酶能力較弱，易造成消化不良，為了彌補(bǔ)酶的不足，常常在仔豬料中添加淀粉酶，這樣勢(shì)必會(huì)增加飼養(yǎng)成本，經(jīng)研究，利用16SrDNA技術(shù)已經(jīng)鑒別了瘤胃乳桿菌"s"Wscj7^sr鵬j'/7is)是豬胃、小腸、大腸和盲腸的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，由乳酸菌等微生物產(chǎn)生的益生素在維持消化道內(nèi)微生物區(qū)系的平衡、抑制有害菌的生長(zhǎng)、減少腹瀉等消化道疾病發(fā)生及促生長(zhǎng)方面作用顯著，如果能在乳酸菌中轉(zhuǎn)入淀粉酶基因，靠瘤胃乳酸菌大量繁殖，就能解決仔豬消化道分泌淀粉酶能力弱的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌的制備及其應(yīng)用。轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌，是把來(lái)自枯草桿菌的淀粉酶基因轉(zhuǎn)入到豬消化道瘤胃乳桿菌中，其制備步驟如下1、制備枯草桿菌(^a"'W^s"力^7A)的菌體DNA作為模板，2、根據(jù)其基因文庫(kù)中的淀粉酶基因的堿基序列，設(shè)計(jì)引物正鏈為5，一TCTAGACTGCATCAGGGCTGCGGCA;負(fù)鏈為5，一CAAGCTTAATGAGGAAGAGAACCGCTTAAGC。3、對(duì)淀粉酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，提取和純化PCR產(chǎn)物。4、利用HindHI和Xbal兩種核酸內(nèi)切酶，分別處理可在大腸桿菌和乳酸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒(PHMSXDJ和PCR擴(kuò)增的a-淀粉酶基因，分離質(zhì)粒和淀粉酶基因后，用QIAEXII純化質(zhì)粒和DNA片段。5、利用T4DNA連接酶把質(zhì)粒(PHMSXD,)與淀粉酶基因連起來(lái)，構(gòu)建出一個(gè)新的質(zhì)粒載體(PHMSXD2)。6、乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備瘤胃乳酸桿菌厭氧培養(yǎng)后，稀釋?zhuān)x心，洗滌，定容。7、轉(zhuǎn)基因操作感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒載體混合移入到電擊槽內(nèi)，利用高壓電擊法，把質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入到瘤胃乳酸桿菌中。8、轉(zhuǎn)基因處理后的乳酸桿菌，加入培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)，然后涂抹到含有淀粉和氨芐青霉素的MRS平皿上，厭氧培養(yǎng)。9、菌落出現(xiàn)后，原位復(fù)制菌落，原菌落用碘液染色確定陽(yáng)性菌落的位置，從復(fù)制菌落中挑選陽(yáng)性菌落，在含有淀粉的MRS厭氧培養(yǎng)液中培養(yǎng)。10、測(cè)定厭氧培養(yǎng)液中淀粉酶的活力，加入15%的無(wú)菌甘油在-20或-7(TC保存。含有淀粉酶的豬消化道瘤胃乳酸桿菌的使用方法一是按每公斤飼料加入的轉(zhuǎn)淀粉酶基因的瘤胃乳酸桿菌(108個(gè)/ml),現(xiàn)用現(xiàn)配，適用于中大豬。二是采用口腔注入法，每次lOO)il，每周1-2次，適用于哺乳仔豬和小豬。利用16SrDNA技術(shù)鑒別出瘤胃乳桿菌aa"Wacj'〃wsn/則7j's)是豬胃、小腸、大腸和盲腸的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，本發(fā)明通過(guò)把淀粉酶基因轉(zhuǎn)入到瘤胃乳桿菌中，把這種轉(zhuǎn)基因的瘤胃乳桿菌詞喂動(dòng)物后，轉(zhuǎn)基因的瘤胃乳酸桿菌在豬的胃腸道中大量繁殖，它具有微生態(tài)制劑和酶制劑的雙重功效，不僅起到微生態(tài)制劑的益生抑菌作用，而且又可分泌大量的淀粉酶，由此產(chǎn)生的益生素維持豬消化道內(nèi)微生物區(qū)系的平衡、抑制有害菌的生長(zhǎng)、減少腹瀉等消化道疾病發(fā)生，所產(chǎn)生的大量淀粉酶彌補(bǔ)了仔豬消化道結(jié)構(gòu)不完善及分泌淀粉酶能力較弱的缺陷，提高了飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，從而達(dá)到了促進(jìn)豬生長(zhǎng)的目的，轉(zhuǎn)淀粉酶基因的瘤胃乳酸桿菌可完全替代抗生素，使仔豬的消化道疾病的發(fā)病率降低90%，日增重提高5-10%，飼料效率提高約10%。圖1是轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的瘤胃乳桿菌菌落照片。淀粉酶酶活檢測(cè)利用UNIC7200分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司制造。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1，淀粉酶基因轉(zhuǎn)入豬消化道瘤胃乳桿菌采用以下步驟1、制備枯草桿菌OfeciWiASSi/Z7"7i'S)的菌體DNA作為模板(1)枯草桿菌的培養(yǎng)培養(yǎng)液的組成為(g/L):胰蛋白胨2、酵母浸出物2、Na風(fēng)5.4、KH2P042,4、NaCl2.0、可溶性淀粉10。在120。C下高壓滅菌20min，高壓滅菌后待冷至5(TC，再加入無(wú)菌的1MMgS042ml和100mMCaCl21ml。培養(yǎng)條件是37°C，在250r/min的旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)。貯存條件為加入無(wú)菌甘油使其濃度為15%,混勻后于-70°C保存。(2)從枯草桿菌中提取菌體DNA取5ml培養(yǎng)16小時(shí)的枯草桿菌培養(yǎng)液，置于離心管內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為1500Xg下，離心10min。用1mlTE(50mMTris-HCl，lOmMEDTA，pH8.0)懸浮菌體。利用0.2ml裂解酶(Lysozyme，5mg/ml)和RNA酶(0.1mg/ml)在37。C下作用15min。加入0.2mlTE、20W10%SDS及5W蛋白酶K(10mg/ml)，在55。C下作用30min后，置于37。C，反應(yīng)2h。利用苯酚氯仿(V/V，l:1)混合物浸提3次，最后用乙醇沉淀來(lái)制備菌體DNA。2、根據(jù)其基因文庫(kù)中的淀粉酶基因的堿基序列，設(shè)計(jì)引物及PCR擴(kuò)增淀粉酶基因正鏈，5，一TCTAGACTGCATCAGGGCTGCGGCA;負(fù)鏈，5，一CAAGCTTAATGAGGAAGAGAACCGCTTAAGC。PCR擴(kuò)增反應(yīng)物(總體積為50W)組成如下模板DNA250ng、每個(gè)引物100pmol、5W緩沖劑、5UTaqDNA聚合酶、12.5mMMgCl2、各20uMdNTPS，最后用去離子水調(diào)節(jié)體積至50Pl。PCR的循環(huán)程序?yàn)?5°C、5min—36個(gè)循環(huán)(95°C、15sec—56°C、30sec—68。C、3min)—72°C、5min—維持于4。C。禾U用GeneAMPPCRSystem2400(PerkinElmer，US)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。3、載體構(gòu)建利用HindIII和Xbal兩種核酸內(nèi)切酶，分別處理質(zhì)粒(P歷SXDi)和PCR擴(kuò)增的a-淀粉酶基因。在37°C下分別處理質(zhì)粒(P麗SXD,)和PCR擴(kuò)增的ex-淀粉酶基因16h。消化處理后的質(zhì)粒再用犢牛腸磷酸酶5ul(1U/ul)處理30min，以防質(zhì)粒再環(huán)狀化。利用0.8%瓊脂糖電泳分離質(zhì)粒和淀粉酶基因，最后用QIAEXIIKits(Germany)純化質(zhì)粒和DNA片段。在16。C的條件下，利用T4DNA連接酶把質(zhì)粒(PHMSXD,，3.26kb)與淀粉酶基因(2.3kb)連起來(lái)，處理10小時(shí)，構(gòu)建出一個(gè)新的質(zhì)粒載體(P麗SXD2，5.56kb)。其中含有抗氨芐青霉素基因，pSP72復(fù)制因子及淀粉酶基因(含有來(lái)自于枯草桿菌淀粉酶基因的調(diào)控區(qū)、信號(hào)肽、功能基因和終止因子)。4、乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備利用厭氧培養(yǎng)基(MRS),在37"C下厭氧培養(yǎng)瘤胃乳酸桿菌12h，然后用添加有20mM蘇氨酸的MRS溶液稀釋100倍，低溫超速離心。細(xì)胞用272mM蔗糖溶液洗滌3次，最后定容為3ml。5、轉(zhuǎn)基因操作取lW質(zhì)粒載體與50W乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，置于預(yù)先已在冰花中冷卻過(guò)的電極槽內(nèi)(電極間距為O.lcm)，繼續(xù)在冰花中冷卻10min，取出擦干后置于高壓電極內(nèi)(1.7kv，250歐姆，5msec)。高壓電擊處理后，取出立即加入1ml的MRS無(wú)菌培養(yǎng)液混勻后注入到一無(wú)菌試管內(nèi)，在37"C的條件下靜止培養(yǎng)1h。然后按每個(gè)平皿為單位涂抹到含有抗生素和淀粉的MRS平皿上，在37'C下厭氧培養(yǎng)24h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。6、挑選陽(yáng)性菌落菌落出現(xiàn)后，標(biāo)記各個(gè)菌落的位置，把菌落按標(biāo)記的序號(hào)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)含有抗生素和淀粉的MRS空白平皿上進(jìn)行培養(yǎng)。然后在原始菌落的平皿上加入約10ml碘液(0.5M碘化鉀和1mM碘)，如圖1照片所示，含有轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的陽(yáng)性菌落可在其周?chē)a(chǎn)生一個(gè)明亮的光環(huán)，酶活越高，其光環(huán)也越大，而陰性菌落無(wú)光圈，其底色仍為藍(lán)色。最后根據(jù)光環(huán)的位置追蹤到陽(yáng)性菌落在復(fù)制平皿上的位置，從而可知哪個(gè)菌落為陽(yáng)性。陽(yáng)性菌落在含有淀粉的MRS液體培養(yǎng)基上，靜止培養(yǎng)48小時(shí)。轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌中淀粉酶酶活檢測(cè)(1)淀粉酶的純化上述培養(yǎng)液在4'C和15000Xg下離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一容器內(nèi)，加入濃度為100%的乙醇使乙醇的最終濃度達(dá)65%?；靹蚝笤诒ㄖ欣鋮s15min然后再離心，把離心管底部粗酶沉淀物溶解于pH為6.8的50mMKH2P04—化2朋04緩沖液中。(2)淀粉酶活力的測(cè)定方法①、基質(zhì)緩沖液(1L，pH7.0):Na2HP0426.6g、NaCl1.75g、苯甲酸8.6g、蒸餾水500ml。加熱沸騰后加入10ml含有400mg可溶性淀粉的懸濁液，再加熱至沸1min,室溫冷卻后定容至1L。②、碘液(1L):碘酸鉀0.3567g、碘化鉀4.5g、蒸餾水800ml，混勻后加入濃鹽酸0.9ml，最后定容至lL。③、操作規(guī)程在空白和測(cè)定試管中各加入基質(zhì)緩沖液5ml，在37。C水浴中保溫20min，分別加入O.lml預(yù)熱的蒸餾水(空白對(duì)照)及0.1ml酶液，混勻后在37。C水浴中反應(yīng)7.5min，然后馬上加入碘液5ml。混勻后把試管放入冰花中，最后在室溫下再加水40ml，混勻后用水調(diào)零點(diǎn)，利用UNIC7200分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司制造)，在660nm下測(cè)定其吸光度。淀粉酶活力(U/L)二(空白吸光度-測(cè)定吸光度)/空白吸光度X8000。(3)淀粉酶活力的測(cè)定結(jié)果結(jié)果表明，無(wú)淀粉酶分泌能力的瘤胃乳桿菌，被賦予了具有產(chǎn)生淀粉酶的功能，其淀粉酶活力達(dá)到88.6U/L，按照相同方法測(cè)定原始枯草桿菌的淀粉酶活力為4.8U/L，由此得知，轉(zhuǎn)淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌的淀粉酶活力提高了18.5倍。轉(zhuǎn)入豬消化道瘤胃乳酸桿菌中的淀粉酶基因的鑒別采用含有淀粉酶基因的質(zhì)粒載體再現(xiàn)法，其操作步驟如下(1)轉(zhuǎn)基因的瘤胃乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基上37r培養(yǎng)16小時(shí)，13000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，去除上清液；(2)向沉淀中加入380W6.7%蔗糖-50mMTris-lmMEDTA(pH8.0)，混勻，在37"C下預(yù)熱10分鐘；(3)加入97H1溶菌酶(20mg/ml，以25raMTris作溶劑，pH8.0)和變?nèi)芫?50U/ml)，混勻，在0'C下反應(yīng)60分鐘；(4)加入48W0.25MEDTA-50mMTris(pH8.0)，混勻后加入28|420%SDS-50mMTris-20mMEDTA(pH8.0)，混勻，在37。C下預(yù)熱5-10分鐘，快速搖動(dòng)30秒，以混合均勻；(5)加入3NNaOH，輕輕地上下顛倒10分鐘，加入2MTris-HC1(pH7.0)，再輕輕地上下顛倒3分鐘；(6)加入72W5MNaCl，再加入700W用3%NaCl平衡的苯酚(V/V，1:1)，混勻，靜置5分鐘后，13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；(7)上清液放入到另一個(gè)干凈的離心管中，加入700W氯仿-異戊醇(V/V，24:1)，混勻，靜置5分鐘后，13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘;(8)上清液放入到另一個(gè)干凈的離心管中，加入異丙醇(V/V，l:2)，混勻，在4。C的冰箱中放置60分鐘，13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，去除上清液；(9)沉淀晾干10分鐘后，加入10mMTris-lmMEDTA(pH7.5)2(￥1，室溫放置20分鐘后，進(jìn)行電泳分析；(10)利用0.7%的瓊脂糖，在70V電壓下進(jìn)行電泳分析，提取的目的質(zhì)粒載體的大小為5.56kb，確定含有淀粉酶基因的質(zhì)粒載體存在于轉(zhuǎn)基因的瘤胃乳酸桿菌。實(shí)施例2，選用哺乳仔豬20只，其中IO只除采用常規(guī)方法飼養(yǎng)外，每周兩次口腔注入轉(zhuǎn)淀粉酶基因的豬瘤胃乳桿菌，對(duì)照組10只，只按照常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)，喂養(yǎng)45天后，結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上表可知，仔豬的消化道疾病的發(fā)病率降低90%，日增重提高10%，詞料效率提高約10%。權(quán)利要求1、轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌，其特征在于，把來(lái)自枯草桿菌的淀粉酶基因轉(zhuǎn)入到豬消化道瘤胃乳桿菌中，其制備步驟如下(1)、制備枯草桿菌(Bacillussubtilis)的菌體DNA作為模板，(2)、根據(jù)其基因文庫(kù)中的淀粉酶基因的堿基序列，設(shè)計(jì)引物正鏈為5’-TCTAGACTGCATCAGGGCTGCGGCA；負(fù)鏈為5’-CAAGCTTAATGAGGAAGAGAACCGCTTAAGC。(3)、對(duì)淀粉酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，提取和純化PCR產(chǎn)物。(4)、利用HindIII和XbaI兩種核酸內(nèi)切酶，分別處理可在大腸桿菌和乳酸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒(PHMSXD1)和PCR擴(kuò)增的α-淀粉酶基因，分離質(zhì)粒和淀粉酶基因后，用QIAEXII純化質(zhì)粒和DNA片段。(5)、利用T4DNA連接酶把質(zhì)粒(PHMSXD1)與淀粉酶基因連起來(lái)，構(gòu)建出一個(gè)新的質(zhì)粒載體(PHMSXD2)。(6)、乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備瘤胃乳酸桿菌厭氧培養(yǎng)后，稀釋?zhuān)x心，洗滌，定容。(7)、轉(zhuǎn)基因操作感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒載體混合移入到電擊槽內(nèi)，利用高壓電擊法，把質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入到瘤胃乳酸桿菌中。(8)、轉(zhuǎn)基因處理后的乳酸桿菌，加入培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)，然后涂抹到含有淀粉和氨芐青霉素的MRS平皿上，厭氧培養(yǎng)。(9)、菌落出現(xiàn)后，原位復(fù)制菌落，從復(fù)制菌落中挑選陽(yáng)性菌落，在含有淀粉的MRS厭氧培養(yǎng)液中培養(yǎng)后即得產(chǎn)物。2、轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳酸桿菌在仔豬喂養(yǎng)上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種轉(zhuǎn)入淀粉酶基因的豬消化道瘤胃乳桿菌及其應(yīng)用，按照轉(zhuǎn)基因方法把來(lái)自枯草桿菌的淀粉酶基因轉(zhuǎn)入到豬消化道瘤胃乳桿菌中，轉(zhuǎn)基因的瘤胃乳酸桿菌轉(zhuǎn)入豬胃腸道可在豬的胃腸道中大量繁殖，不僅起到微生態(tài)制劑的益生抑菌作用，而且又可分泌大量的淀粉酶，從而維持豬消化道內(nèi)微生物平衡、抑制有害菌的生長(zhǎng)、減少腹瀉等消化道疾病發(fā)生，所產(chǎn)生的大量淀粉酶彌補(bǔ)了仔豬消化道結(jié)構(gòu)不完善及分泌淀粉酶能力較弱的缺陷，提高了飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，達(dá)到了促進(jìn)豬生長(zhǎng)的目的。文檔編號(hào)A23K1/16GK101100652SQ200610018068公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2006年7月3日優(yōu)先權(quán)日2006年7月3日發(fā)明者姜義寶,尹清強(qiáng),偉程,玲路,鄭秋紅,文陳申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)