專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 單胺氧化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單胺氧化酶(MAO)測定可分為化學分光光度法、熒光法、免疫 抑制法及現(xiàn)在申請專利的酶法。 一般多用化學分光光度法，單胺氧化 酶反應底物以芐胺(Benzylamine)和對苯甲胺-^-偶氮萘酚，也可應 用單胺氧化酶催化胺類釋放出的HA氧化發(fā)色劑，如10-N-甲基氨基甲 ?；?3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，單胺氧化酶 反應底物還有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、 6-苯乙 基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine: 3-對羥基苯乙胺 3-parahdroxyphenylethylajnine)、 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine) 等，丁基胺、戊基胺、苯乙基胺約為3-對羥基苯乙胺活性的30%, 通常應用苯甲胺作為底物比其他底物的單胺氧化酶活性要高。目前單 胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲胺-e-偶氮萘酚為底物，但對苯甲胺-偶氮萘酚芐胺法需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不 能應用全自動生化儀分析；芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用 下生成芐醛，然后在強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生 成醛苯腙，在生化儀上測定也較困難。
熒光法檢測單胺氧化酶是以P -苯乙胺作為底物，其在10 100mg
時Km最大，高于芐胺和5-羥色胺的Km值。
免疫學方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應，作用 后進行單胺氧化酶同工酶測定。目前應用較多的單克隆抗體是 MAO-A3C9、 MAO-A4F10、 MAO-A7B10、 MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法 (Enzymatic Recycling Method)、 酶比色7去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量通過酶聯(lián)反應生成 吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)，所導 致在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定單胺氧化酶活性濃 度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的單胺氧化酶診斷 試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分 析儀上進行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法原理如下
胺類化合物+ 2水+氧單胺氧化酶相應醛類產(chǎn)物+
氨離子+過氧化氫+ 2 OH— 氨離子+ a-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸
+輔酶+水
谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨離子+ a-酮戊二酸+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亞胺色原+水
胺類化合物可以是芐胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊 基胺、P-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺等或其衍生物。
這種方法應用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase EC 1.4.3.4、 EC 1.4.3.6)將胺類化合物酶解產(chǎn)生氨。
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或 EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)
使氨不斷地被重復循環(huán)利用，并同時不斷地循環(huán)擴增產(chǎn)出過氧化氫。
過氧化物酶將過氧化氫與還原型色原體組合作用，最終將無色的還 原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器， 在400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染 料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)， 含量高低的光吸收大小，通過測量400—700nm (根據(jù)還原型色原體組 合的不同而定)處吸光度上升的速度，得出單胺氧化酶活性濃度大小
測定結(jié)果o
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脫氫酶 100000 U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/L
a-酮戊二酸 16 mmol/L
過氧化物酶 30000 U/L
還原型色原體組合A 6 mmol/L
抗干擾劑 30 mmol/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任
個組合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2.4- 雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3.5- 雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
]^-乙基^>1- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺 本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、Ot-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸
氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、抗干擾劑。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液
體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、還原型色原體組
合、抗干擾劑。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶、過氧化物酶、谷氨酸氧化酶。
a-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、過氧 化物酶、還原型色原體組合在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、抗干擾劑。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶。
OC-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、過氧
化物酶、還原型色原體組合在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶
谷氨酸氧化f
a-酮戊二酸
過氧化物酶
4-氨基抗砒
石碳酸
0.25 mmol/L 150000U/L 謹0 U/L 16 mmol/L 30000 U/L 2 mmol/L 10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應時間IO分鐘，測
試主波長505nm，測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為 1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 0.25 mmol/L 16 mmol/L 0.2 mmol/L
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于 生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的速度，從而測算出單 胺氧化酶活性的濃度大小。 實施例二
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 ot-酮戊二酸
2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
谷氨酸脫氫酶 120000 U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/L
過氧化物酶 30000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應時間10分鐘，測試 主波長546nm，測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為1/20， 反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約1 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化
分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧 化酶活性的濃度大小。
實施例三單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
a-酮戊二酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
50 mmol/L 0.25 mmol/L 16 mmol/L 0.6 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
過氧化物酶
雙甲基苯胺
50 mmol/L
40000 U/L
2 mmol/L
試劑
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
谷氨酸氧化，
50 mmol/L
100000U/L
8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應時間10分鐘，測試
主波長578nm，測試副波長660nm，被測樣品與試劑的體積比例為1/30, 反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約l 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于 生化分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的速度，從而測算出單 胺氧化酶活性的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好。
權(quán)利要求
1.一種酶循環(huán)擴增法(Enzymatic Recycling Method)的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法原理如下胺類化合物+2水+氧 單胺氧化酶 相應醛類產(chǎn)物+ 氨離子+過氧化氫+2 OH-氨離子+α-酮戊二酸+還原型輔酶 谷氨酸脫氧酶 谷氨酸 +輔酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨離子+α-酮戊二酸+ 過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水胺類化合物可以是芐胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺等或其衍生物。將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度，得出單胺氧化酶活性濃度大小測定結(jié)果。單胺氧化酶(Monoamine Oxidase EC 1.4.3.4、EC 1.4.3.6)作為作用酶，功能為將胺類化合物酶解產(chǎn)生氨。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作為循環(huán)酶，將氨不斷地被重復循環(huán)利用，并同時不斷地擴增產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶作為顯色酶，將過氧化氫與還原型色原體組合作用發(fā)生顯色反應。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒，主要成分包括:緩沖液20—穩(wěn)定劑1—還原型輔酶O.l—谷氨酸脫氫酶2000——:谷氨酸氧化酶2000——:a-酮戊二酸2.過氧化物酶500——還原型色原體組合O.l-抗干擾劑1——500 mmol/L —50 mmol/L 0,35 mmol/L-20 mmol/L500000 U/L -20 mmol/L-50 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物 酶(EC1.11丄7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、ot-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物 酶(EC1.11丄7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、還原型色原 體組合及抗干擾劑組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化 酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化物酶及抗干擾劑組成。oc-酮戊二酸、還 原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、過氧化物酶在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、ot-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶 (glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化 物酶(EC1.11丄7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成多劑試劑； 試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合及抗干擾 劑組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫 酶組成。a-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、 過氧化物酶及抗干擾劑在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不 限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個組合 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一W- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒 N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶循環(huán)擴增法的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、α-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、穩(wěn)定劑及抗干擾劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出單胺氧化酶活性濃度的大小。
文檔編號G01N21/78GK101097196SQ20061008558
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月26日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司