參與黃瓜葫蘆素c合成的基因簇及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明首次在黃瓜基因組中發(fā)現(xiàn)參與葫蘆素C合成的基因簇，共由8個(gè)基因組成，其中5個(gè)基因均位于6號(hào)染色體35kb的范圍內(nèi)。利用酵母體系解析了葫蘆素C合成的第1至第4步反應(yīng)，并在煙草體系中共表達(dá)了這8個(gè)基因，可實(shí)現(xiàn)葫蘆素C的合成。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了黃瓜苦味形成的分子機(jī)制，為無(wú)苦味黃瓜育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)；同時(shí)為葫蘆素的體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜的苦味是由一類(lèi)稱(chēng)為葫蘆素C的三萜化合物導(dǎo)致的。黃瓜果實(shí)中積累葫蘆素C會(huì)嚴(yán)重影響黃瓜的口感及品質(zhì)。早期的經(jīng)典遺傳學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃瓜的苦味由Bi和Bt兩個(gè)基因控制。CN103013966中發(fā)現(xiàn)Bi基因編碼氧化角鯊烯環(huán)化酶，它催化生成葫蘆2烯醇，是葫蘆素C合成的第一步，也是合成中最關(guān)鍵的一步。葫蘆素C的合成除了第一步生成葫蘆2烯醇，還需要經(jīng)過(guò)一系列的催化修飾，然而，葫蘆2烯醇在植物體內(nèi)是如何被修飾，最終合成葫蘆素C，目前尚不清楚。
[0003]大部分葫蘆素科植物都具有葫蘆素，例如，葫蘆素C來(lái)源于黃瓜，葫蘆素E來(lái)源于甜瓜，葫蘆素B來(lái)源于西瓜。但是它們的合成路徑尚不清楚，相關(guān)合成基因也沒(méi)有被克隆獲得。因此，葫蘆素主要從植物中提取獲得，不能體外直接合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇及其應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供參與黃瓜葫蘆素C合成的蛋白，包括Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890和Csa6G088700，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.1-8所示。
[0006]本發(fā)明還提供參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇，所述基因簇共由8個(gè)基因組成，Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890和Csa6G088700，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.12-19所示。
[0007]本發(fā)明還提供含有所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇的載體、工程菌、宿主細(xì)胞及轉(zhuǎn)化的植物。
[0008]本發(fā)明還提供所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇在調(diào)控黃瓜苦味合成中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明還提供所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇在調(diào)控葫蘆素體外合成中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇在無(wú)苦味黃瓜分子育種中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇的載體轉(zhuǎn)入植物體(例如煙草等)中，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0012]在之前的研究中， 對(duì)114份黃瓜核心種質(zhì)材料進(jìn)行重測(cè)序分析，同時(shí)對(duì)這114份材料進(jìn)行苦味表型鑒定。采用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的方法和群體作圖，快速找到了控制葉片苦味的Bi候選基因。Bi編碼一個(gè)葫蘆2烯醇環(huán)化酶基因，是葫蘆素C合成的關(guān)鍵酶。葫蘆2烯醇還需要進(jìn)一步被氧化和乙?；拍苌珊J素C。為了解析葫蘆素C合成的其他步驟，對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(RNA-Seq)進(jìn)行分析，尋找與Bi基因共表達(dá)的P450基因和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，在黃瓜基因組中一共找到了 6個(gè)P450基因(Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550 和 CsalG044890)和 I 個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Csa6G088700)。這7個(gè)基因與Bi (Csa6G088690)基因在黃瓜各個(gè)組織中的表達(dá)狀態(tài)非常相似，只在葉片中大量表達(dá)。此外，除了 3個(gè)P450基因(Csa3G903540、Csa3G903550和CsalG044890)，其他基因與Bi基因均位于6號(hào)染色體35kb的范圍內(nèi)，形成一個(gè)類(lèi)似基因簇的結(jié)構(gòu)。目前，以基因簇的形式參與重要次生代謝產(chǎn)物合成在高等植物中被廣泛發(fā)現(xiàn)，因此推測(cè)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的這7個(gè)候選基因很可能與Bi基因一起形成葫蘆素C合成基因簇，在黃瓜葉片中合成苦味物質(zhì)。
[0013]進(jìn)一步利用酵母表達(dá)體系，在酵母中表達(dá)這些候選基因，用GC-MS或UPLC-Q-TOF儀來(lái)檢測(cè)酵母提取物，解析苦味合成中間產(chǎn)物。首先，用GC-MS在表達(dá)B1、輔酶CPR和Csa3G903540的酵母中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特異的產(chǎn)物。該產(chǎn)物的MS檢測(cè)結(jié)果與葫蘆2烯醇相比，檢測(cè)到大的離子碎片少了 2個(gè)氫原子，這意味著葫蘆2烯醇很有可能被Csa3G903540氧化。進(jìn)一步將該產(chǎn)物從酵母中純化分離出來(lái)，利用核磁共振(UMR)解析其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)葫蘆2烯醇的19號(hào)碳原子發(fā)生羥基化，進(jìn)而證明Csa3G903540催化葫蘆2烯醇的氧化，是苦味合成的第二步。繼續(xù)利用酵母表達(dá)體系，表達(dá)更多的候選基因，用UPLC-Q-TOF分析產(chǎn)物的精確分子量，推測(cè)可能發(fā)生的氧化反應(yīng)產(chǎn)物。通過(guò)該方法，僅在表達(dá)B1、CPR、Csa3G903540和Csa6G088160酵母提取物中發(fā)現(xiàn)分子量為459.3833 [M+H]的產(chǎn)物，與Csa3G903540催化生成的產(chǎn)物(C30H5002)的分子量相比，剛好多了一個(gè)氧原子的質(zhì)量，而在表達(dá)其他候選P450基因的酵母中無(wú)任何特異產(chǎn)物出現(xiàn)，由此推測(cè)Csa6G088160參與葫蘆素C合成的第三步。采用同樣的方法，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)B1、CPR、Csa3G903540、Csa6G088160和Csa3G903550的酵母提取物中發(fā)現(xiàn)分子量為497.3601 [M+Na]的產(chǎn)物，與Csa6G088160催化生成的產(chǎn)物(C30H5003)的分子量相比，剛好又多了一個(gè)氧原子，推測(cè)Csa3G903550參與葫蘆素C合成的第四步。
[0014]除了解析葫蘆素C的合成路徑，本發(fā)明還將找到的7個(gè)候選基因加上之前發(fā)現(xiàn)Bi基因以及已報(bào)道的HMGR和FPS基因在煙草中同時(shí)表達(dá)。煙草葉片中本身是不存在葫蘆素C的，但在成功表達(dá)基因簇基因后，煙草葉片中檢測(cè)到了葫蘆素C的合成，證明了該基因簇的功能。此外，利用同樣的實(shí)驗(yàn)體系，還發(fā)現(xiàn)缺少7個(gè)候選基因中任意一個(gè)基因，煙草葉片均不能生成葫蘆素C，因而從另一個(gè)方面驗(yàn)證了在黃瓜基因組中找到的基因簇在黃瓜葉片中協(xié)同表達(dá)，共同參與苦味物質(zhì)的合成。
[0015]本發(fā)明首次在黃瓜基因組中發(fā)現(xiàn)參與葫蘆素C合成的基因簇，共由8個(gè)基因組成，其中5個(gè)基因均位于6號(hào)染色體35kb的范圍內(nèi)。利用酵母體系解析了葫蘆素C合成的第I至第4步反應(yīng)，并在煙草體系中共表達(dá)了這8個(gè)基因，可實(shí)現(xiàn)葫蘆素C的合成。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了苦味形成的分子機(jī)制，為無(wú)苦味黃瓜育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)，可用于大規(guī)模篩選育種材料，大大加快高營(yíng)養(yǎng)黃瓜的育種進(jìn)程；同時(shí)還為葫蘆素的體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)，本發(fā)明可替代傳統(tǒng)的從植物材料中提取苦味素(葫蘆素)的方法，實(shí)現(xiàn)體外合成苦味素。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0016]圖1為本發(fā)明通過(guò)分析RNA-Seq數(shù)據(jù)，從黃瓜基因組中發(fā)現(xiàn)與苦味素(葫蘆素C)合成相關(guān)的基因族。
[0017]圖2為本發(fā)明利用GC-MS檢測(cè)參與苦味素合成第二步反應(yīng)的結(jié)果；其中，A為GC-MS檢測(cè)到的Csa5G903540的特異產(chǎn)物，B為該特異產(chǎn)物的MS檢測(cè)結(jié)果，虛線(xiàn)小框?yàn)楹J素2烯醇的MS檢測(cè)結(jié)果。
[0018]圖3為本發(fā)明利用UPLC-Q-TOF檢測(cè)參與苦味素合成第三步反應(yīng)的結(jié)果。
[0019]圖4為本發(fā)明用UPLC-Q-TOF檢測(cè)參與苦味素合成第四步反應(yīng)的結(jié)果。
[0020]圖5為本發(fā)明利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)與苦味素合成相關(guān)的基因簇以及HMGR和FPS基因后，用UPLC-Q-TOF檢測(cè)煙草葉片提取物的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0022]實(shí)施例1參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇的挖掘與獲得
[0023]I基因簇的挖掘
[0024]Bi基因在黃瓜葉片中大量表達(dá)，以此為線(xiàn)索，分析黃瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(RNA-Seq)尋找與Bi共表達(dá)的P450基因和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，在黃瓜基因組中一共找到了 6個(gè)P450基因(Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550 和 CsalG044890)和I個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(C`sa6G088700)。這7個(gè)基因與Bi (Csa6G088690)基因在黃瓜各個(gè)組織中的表達(dá)狀態(tài)非常相似，只在葉片中大量表達(dá)(圖1)。此外，除了 3個(gè)P450基因(Csa3G903540、Csa3G903550和CsalG044890)，其他基因與Bi基因均位于6號(hào)染色體35kb的范圍內(nèi)，形成了一個(gè)類(lèi)似基因簇的結(jié)構(gòu)(圖1)。葫蘆素C在黃瓜各個(gè)組織的中分布與該基因簇的表達(dá)模式很相似(圖1)，都是葉片中最高，因此認(rèn)為該基因簇參與苦味物質(zhì)的合成。
[0025]2 黃瓜 Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550 和CsalG044890基因的獲得
[0026]首先制備黃瓜葉片cDNA文庫(kù)，然后利用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見(jiàn)表1)。
[0027]表1引物序列(5' -3')
[0028]
【權(quán)利要求】
1.參與黃瓜葫蘆素C合成的蛋白，包括Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890 和 Csa6G088700，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.1-8所示。
2.參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇，其特征在于，所述基因簇由以下8個(gè)基因組成，Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890和Csa6G088700，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.12-19所示。
3.含有權(quán)利要求2所述基因簇的載體。
4.含有權(quán)利要求2所述基因簇的工程菌。
5.權(quán)利要求2所述基因簇在調(diào)控黃瓜苦味合成中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述基因簇在調(diào)控葫蘆素體外合成中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述基因簇在調(diào)控葫蘆素C體外合成中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2所述基因簇在無(wú)苦味黃瓜分子育種中的應(yīng)用。
9.一種轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求3所述的載體轉(zhuǎn)入植物體中，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求 9所述的方法，其特征在于，所述植物為煙草。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103483435SQ201310376574
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月26日
【發(fā)明者】黃三文, 尚軼, 張忠華, 馬永碩, 張慧敏, 李穎 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所