專(zhuān)利名稱(chēng):一種纓小蜂體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲(chóng)體內(nèi)共生菌的分子檢測(cè)，具體涉及纓小蜂體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏 (Fo^acAia)細(xì)菌的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
纓小蜂隸屬膜翅目纓小蜂科(Mymanidae)，是水稻主要害蟲(chóng)飛虱卵期一種重要的寄生蜂。纓小蜂群體數(shù)量大、效能高，對(duì)早稻田發(fā)生的灰飛虱、白背飛虱和晚稻田后發(fā)的褐飛虱起顯著的抑制作用。因此，對(duì)纓小蜂的研究在水稻病蟲(chóng)害生物防治中具有重要意義。現(xiàn)有的研究已經(jīng)表明，寄生蜂體內(nèi)存在著大量的共生微生物，其中沃爾巴克氏(Wolbachia )細(xì)菌分布最廣，它能誘導(dǎo)寄生蜂產(chǎn)雌孤雌生殖和細(xì)胞質(zhì)不親和，引起寄主的生殖行為異常，使寄主后代性比失衡。此外，沃爾巴克氏(rWhdia)細(xì)菌還影響寄生蜂行走和擴(kuò)散能力、寄生率和羽化率、壽命、競(jìng)爭(zhēng)力和滯育等。對(duì)寄生蜂體內(nèi)共生菌的研究有助于研究人員深入探索寄生蜂和寄主昆蟲(chóng)之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系、攻克寄主防御系統(tǒng)以及調(diào)控寄主生長(zhǎng)發(fā)育并正確理解寄生蜂成功進(jìn)化的生態(tài)策略。同時(shí)，對(duì)提高寄生蜂的人工繁育效率、控制農(nóng)林重大害蟲(chóng)的發(fā)生與危害的潛能均具有重要的理論和實(shí)踐意義。
昆蟲(chóng)體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的檢測(cè)是最為基礎(chǔ)性的工作，到目前為止， 沃爾巴克氏細(xì)菌(Wolbachia)尚無(wú)法在寄主體外進(jìn)行培養(yǎng)，所以很難用傳統(tǒng)微生學(xué)的方法對(duì)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)和研究，沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的檢測(cè)主要依賴(lài)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子生物學(xué)技術(shù)方法。
當(dāng)前常用于研究沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的分子標(biāo)記主要是位于核糖體RNA 基因編碼區(qū)(16S rDNA、23S rDNA、5S rDNA)、核糖體RNA基因非編碼區(qū)(16S和23SrRNA編碼基因間的間隔區(qū)一ITS-I和位于23S和5SrRNA編碼基因間的間隔區(qū)一ITS-2)的序列，以及編碼蛋白的基因序列，如Wsp基因、ftsZ基因等。洪曉月等人公開(kāi)的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利檢測(cè)葉螨體內(nèi)共生菌的多重PCR檢測(cè)方法(申請(qǐng)?zhí)?009 1 0032015. 5，公開(kāi)號(hào)CN 101603081 Α)中公開(kāi)了基于Wsp基因的昆蟲(chóng)體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的檢測(cè)方法。上述現(xiàn)有技術(shù)的共同特點(diǎn)在于它們均包含兩個(gè)關(guān)鍵步驟提取昆蟲(chóng)的總DNA，然后采用適合的分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后可以根據(jù)電泳檢測(cè)的結(jié)果或者測(cè)序分析的結(jié)果來(lái)判斷昆蟲(chóng)體內(nèi)是否存在共生菌沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌，以及其種類(lèi)。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于影響PCR的因素，如提取的DNA模板質(zhì)量、用于PCR的引物和試劑、PCR反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)條件、所用引物對(duì)樣品DNA中目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率等均可能影響到最終的檢測(cè)結(jié)果，現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法在實(shí)驗(yàn)體系中確保檢測(cè)結(jié)果不受上述因素的影響， 尤其是在得出陰性的檢測(cè)結(jié)果時(shí)。因此，建立一種相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕赑CR的對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)沃爾巴克氏(rWhcAia)細(xì)菌檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)體系，是當(dāng)前研究中需要解決的重要問(wèn)題。此外，快速、 準(zhǔn)確的確定昆蟲(chóng)體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia )細(xì)菌的種類(lèi)也是需要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，建立一種相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕赑CR的檢測(cè)纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(rwhdia)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)體系，同時(shí)，該檢測(cè)方法的結(jié)果同時(shí)可以快速、準(zhǔn)確的確定昆蟲(chóng)體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia )細(xì)菌的種類(lèi)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
以提取獲得的纓小蜂總DNA為模板，采用巢式PCR與DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即變性梯度凝膠電泳，技術(shù)結(jié)合的方式進(jìn)行共生菌沃爾巴克氏 (Fo^acAia)細(xì)菌的檢測(cè)，具體技術(shù)路線(xiàn)圖如附圖1所示。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的方法為一種纓小蜂體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測(cè)方法，包括提取纓小蜂總DNA ；擴(kuò)增沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段；對(duì)獲得德沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析；其特征在于所述沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的擴(kuò)增采用巢式PCR，其具體步驟為 (1)、以提取獲得的纓小蜂DNA為模板，用沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA引物99F/994R或者 315F/6^R擴(kuò)增獲得相應(yīng)的基因片段，用細(xì)菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分別擴(kuò)增獲得纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段。
在一個(gè)優(yōu)選的方式中，該方法還包括步驟(2)以(1)中擴(kuò)增獲得的纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌、總細(xì)菌、不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段為模板，采用帶有GC夾子的細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)引物341F/517R擴(kuò)增相應(yīng)的用于變形梯度凝膠電泳分析的16S rDNA基因片段；所述擴(kuò)增獲得沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析在完全相同的條件下進(jìn)行，以總細(xì)菌的DGGE圖譜作為纓小蜂DNA的提取效果、沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增效果的控制性對(duì)照，且以沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段的DGGE圖譜中條帶的測(cè)序分析結(jié)果作為纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果。優(yōu)選的，GC夾子的序列為SQ10。
優(yōu)選的，所述的方法還包括所述擴(kuò)增獲得的沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析結(jié)果中，以纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段的變性梯度凝膠電泳的圖譜是否有條帶的差異來(lái)初步判斷纓小蜂體內(nèi)是否存在沃爾巴克氏細(xì)菌。
在一些具體的方式中，如下方法巢式PCR擴(kuò)增纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏 iVo Ibachia )細(xì)菌具體步驟為1、用沃爾巴克氏(Jolbachia )細(xì)菌的16S rDNA弓丨物 99F/994R或者315F/6^R擴(kuò)增獲得沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌的16S rDNA的基因片段； 用細(xì)菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分別擴(kuò)增獲得纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段，其中27F/REUB引物的擴(kuò)增產(chǎn)物再次作為模板，用引物27F/1492R擴(kuò)增獲得不含沃爾巴克氏(rWhdia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段。所述引物的序列為
名稱(chēng)序列序列編號(hào)99F5’ -TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT-3’SQl994R5’ -GMTAGGTATGATTTTCATGT-3’SQ2315F5’ -GCATGAGTGAAGAAGGCC-3SQ3628R5’ -AGATAGACGCCTTCGCCA-3’SQ427F5’ -GTGCTGCAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SQ5REUB5’ -GCCAAGGCATCCACC-3’SQ61492R5’ -CACGGATCCTACGGGTACCTTGTTACGACTT-3’SQ7
4PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L,包括 2. 5 μ L 10XPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的 Taq DNA Polymerase, 2 μ L dNTPs (2. 5 mmol/L each)，正反向弓|物各 0· 4 μ L (10 μ mol/L), DNA 模板 10-20 ng,用 ddH20 補(bǔ)加到 25 μ L。
PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C 4 min，94°C 1 min，51°C 45 s (其中，用 27F/1492R、27F/ REUB引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為55°C )，72°C 45 s (其中，用27F/1492R、27F/REUB引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為1.5 min)，第2 — 4步進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，在72°C延伸8 min后停止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。
2、以步驟1中獲得的纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌的16S rDNA的基因片段、總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏(rWhcAia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段為模板，用帶有GC夾子的細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)引物341F和517R擴(kuò)增相應(yīng)的16S rDNA V3 高變區(qū)基因片段。其中，所述引物的序列為
34IF 5'-CTACGGGAGGCAGCAG-3' SQ8 517R 5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3' SQ9 ； 所述GC夾子的序列為
5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCC-3‘ SQlO0
PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L,包括 2. 5 μ L 10XPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的Taq DNA Polymerase, 2 μ L dNTPs(2. 5 mmol/L each)，正反向弓|物各0. 4 μ L (10 μ mol/L), DNA 模板 10-20 ng,用 ddH20 補(bǔ)加到 25 μ L。
PCR 反應(yīng)的程序?yàn)?94°C 4 min，94°C 1 min，55°C 30 s，72°C 40 s，第 2— 4 步進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，在72°C延伸8 min后停止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。
在以上方法中，DGGE分析的具體步驟為
制備聚丙烯酰胺變性梯度膠，分析所用的PAGE(聚丙烯酰胺)膠濃度為8% (質(zhì)量濃度)， 變性梯度為40 %作為對(duì)檢測(cè)樣品中是否含有沃爾巴克氏(ro^acAia)細(xì)菌的初步判斷，可以通過(guò)比較纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA V3 高變區(qū)基因片段產(chǎn)物的DGGE圖譜中條帶的差異來(lái)判斷，如果樣品中不含有沃爾巴克氏 (rWhcAia)細(xì)菌，它們的DGGE圖譜應(yīng)完全一致，如果它們的DGGE圖譜有條帶的差異，則可初步判斷纓小蜂體內(nèi)存在沃爾巴克氏OVolbachia)細(xì)菌。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于采用巢式PCR-DGGE的實(shí)驗(yàn)體系檢測(cè)纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌過(guò)程中，對(duì)總細(xì)菌的擴(kuò)增和分析結(jié)果是對(duì)影響PCR的因素的控制性對(duì)照，用于表明提取DNA的質(zhì)量、PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系等對(duì)檢測(cè)的結(jié)果沒(méi)有影響。尤其是當(dāng)樣品中未擴(kuò)增出沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的16S rDNA基因片段產(chǎn)物，而擴(kuò)增獲得了總細(xì)菌和除沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌外總細(xì)菌的16S rDNA基因片段產(chǎn)物，則表明其中確實(shí)不存在沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌。該實(shí)驗(yàn)體系相對(duì)于當(dāng)前其它基于PCR的沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌檢測(cè)方法是相對(duì)而言更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測(cè)體系。此外，經(jīng)DGGE檢測(cè)確定沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的存在后，直接對(duì)DGGE條帶切膠回收、克隆和測(cè)序，還可以快速、準(zhǔn)確的提供昆蟲(chóng)體內(nèi)感染的沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌種類(lèi)數(shù)和種屬信息，在沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析中也更有實(shí)用價(jià)值。


圖1 巢式PCR-DGGE檢測(cè)纓小蜂體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的技術(shù)路線(xiàn)。
圖2 不同纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌、總細(xì)菌、除沃爾巴克氏 (Wolbachia)細(xì)菌外總細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)基因片段的DGGE結(jié)果。其中，圖中泳道編號(hào)為不同樣品，Tl和T2為采集自浙江纓小蜂在不同溫度下培養(yǎng)物，P5為采集自菲律賓的纓小蜂；分組標(biāo)記表示用于DGGE分析的16S rDNA V3高變區(qū)產(chǎn)物的模板來(lái)源于該引物擴(kuò)增基因組DNA的PCR產(chǎn)物；途中條帶的編號(hào)表示切膠的條帶。
圖3 以圖2中切膠回收的條帶1 (band 1)和條帶2 (band 2)的測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但應(yīng)該理解本發(fā)明并不受這些內(nèi)容所限制。
實(shí)施實(shí)例
1、本實(shí)施實(shí)例所用的纓小蜂蟲(chóng)源為稻虱纓小蜂，Tl和T2采自浙江，為不同溫度下培養(yǎng)的樣品，P5采自菲律賓國(guó)際水稻研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)稻田，采集的樣品保存于_72°C冰箱備用。
2、基因組DNA提取將低溫保存的稻虱纓小蜂樣品取出，置于潔凈工作臺(tái)解凍。每種稻虱纓小蜂樣品分別取10頭裝入無(wú)菌的2 ml離心管中，加入1 mL 70%的乙醇，輕輕晃動(dòng)5 min,隨后用無(wú)菌水漂洗3次，重復(fù)該步驟3次以去除稻虱纓小蜂表面的細(xì)菌。
采用DNeasy Blood & Tissue Kit (購(gòu)買(mǎi)自 Qiagen Corp.)提取稻虱纓小蜂樣品的基因組DNA。將去除表面細(xì)菌的稻虱纓小蜂樣品置于新的無(wú)菌的2 mL離心管中，加入 ISOyL的ATL buffer，用無(wú)菌的玻璃棒研磨樣品直至肉眼看不到蟲(chóng)體組織。向離心管中加入20 UL的蛋白酶K，充分混合后放入水浴搖床中，56 °C條件下水浴過(guò)夜。隨后步驟參照試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行。提取獲得的DNA樣品用NanoDrop-2000 (Thermo Corp.)測(cè)定濃度后置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>3、稻虱纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Jolbachia )細(xì)菌、總細(xì)菌、不含沃爾巴克氏 (Wolbachia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA V3高變區(qū)基因片段的擴(kuò)增。參照?qǐng)D1中的路線(xiàn)圖， 以提取獲得的Tl、T2、P5樣品總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為25 μ L，包括 2. 5μ L IOXPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的 TransTaq-T DNA Polymerase (TransGen Corp. ),2 μ L dNTPs (2.5 mmol/L each)，正反向引物各 0. 4 μ L( 10 ymol/L),
6DNA 模板 10-20 ng，用 ddH20 補(bǔ)加到 25 μ L。
PCR 反應(yīng)的程序?yàn)?94°C 4 min，94°C 1 min，51°C 45 s (該溫度為用 99F/994R、 315F/628R引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)的褪火溫度，用27F/1492R、27F/REUB、GC+341/517R 引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為)，72°C 45 s (該時(shí)間度為用99F/994R、315F/6^R、 GC+341/517R引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)的延伸時(shí)間，用27F/1492R、27F/REUB引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為1.5 min)，第2 — 4步進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，在72°C延伸8 min后停止反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳圖經(jīng)Quantity One軟件(Bio-Rad Corp.)數(shù)字化處理，參照電泳時(shí)Marker對(duì)應(yīng)條帶的DNA含量進(jìn)行相對(duì)定量。
4、PCR產(chǎn)物的DGGE分析前述擴(kuò)增獲得的稻虱纓小蜂樣品Tl、T2、P5的沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌、總細(xì)菌、除沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌外總細(xì)菌的16S rDNA V3 高變區(qū)基因片段產(chǎn)物PCR產(chǎn)物用基因突變檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad Dcode, USA)分析，用于DGGE 分析的PAGE (聚丙烯酰胺)膠濃度為8 % (質(zhì)量濃度)，變性梯度為40 %5、DGGE條帶的回收、克隆、測(cè)序、分析DGGE凝膠中的主要條帶切下后用dd H2O沖洗，搗碎后用30 μ L TE buffer在4°C浸泡過(guò)夜，PCR回收的切下的條帶中的DNA?；厥諚l帶的PCR產(chǎn)物再次經(jīng)DGGE檢測(cè)以確保回收條帶PCR產(chǎn)物的正確。PCR產(chǎn)物用Sarfr印柱式DNA 膠回收試劑盒(Sangon Corp.)純化后連入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 采用菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，每個(gè)樣品隨機(jī)挑選3個(gè)載有插入片段的陽(yáng)性克隆送交上海生工公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中比對(duì)分析，之后用MEGA 4. 1軟件以Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支的bootstrap置信度用1000次自導(dǎo)復(fù)制來(lái)評(píng)價(jià)。
6、稻虱纓小蜂樣品T1、T2、P5中沃爾巴克氏(Fo^acAia )細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果稻虱纓小蜂樣品Τ1、Τ2、Ρ5的沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌16S rDNA基因片段的DGGE圖譜顯示， 3個(gè)樣品均有明顯的1個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，如圖2所示。其中，對(duì)圖2中編號(hào)為條帶1 (band 1)和 2 (band 2) DNA進(jìn)行割膠回收、克隆后的測(cè)序結(jié)果條帶1的序列(SQ11) (band 1)為
5’-CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTG AAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGAAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACT CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT-3'
條帶2的序列(band 2)為(SQ12)
5’-CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTG AAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGGAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACT CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT-3'
經(jīng)GenBank中比對(duì)分析后用MEGA 4. 1軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)， 如圖3所示，條帶1 (band 1)和2 (band 2)均與已知的沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌16S rDNA序列相似，表明band 1和band 2代表的細(xì)菌是沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌，由此可以確定稻虱纓小蜂樣品Tl、T2、P5中均含有沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌。
稻虱纓小蜂Tl、T2、P5中總細(xì)菌和除沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌外總細(xì)菌的DGGE圖譜(如圖2)顯示，它們大多數(shù)條帶完全相同，但在對(duì)應(yīng)切膠條帶1和2的位置有一定的差異，其中樣品P5的差異較為明顯，這與稻虱纓小蜂樣品中沃爾巴克氏(rWhdia) 細(xì)菌的含量有一定的關(guān)系。從各樣品總細(xì)菌和除沃爾巴克氏(Volbachia )細(xì)菌外總細(xì)菌的 DGGE圖譜的差異，可以初步判斷各樣品中存在沃爾巴克氏(rWhcAia)細(xì)菌，這與最終的測(cè)序分析結(jié)果也是一致的。
權(quán)利要求
1.一種纓小蜂體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測(cè)方法，包括提取纓小蜂總DNA;擴(kuò)增沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段對(duì)獲得沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析；其特征在于所述沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA 基因片段的擴(kuò)增采用巢式PCR，其具體步驟為(1)、以提取獲得的纓小蜂DNA為模板，用沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA引物99F/994R或者315F/628R擴(kuò)增獲得相應(yīng)的基因片段，用細(xì)菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分別擴(kuò)增獲得纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的方法，該方法還包括步驟(2):以(1)中擴(kuò)增獲得的纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌、總細(xì)菌、不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段為模板， 采用帶有GC夾子的細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)引物341F/517R擴(kuò)增相應(yīng)的用于變形梯度凝膠電泳分析的16S rDNA基因片段；所述擴(kuò)增獲得沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析在完全相同的條件下進(jìn)行，以總細(xì)菌的DGGE圖譜作為纓小蜂DNA 的提取效果、沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增效果的控制性對(duì)照，且以沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段的DGGE圖譜中條帶的測(cè)序分析結(jié)果作為纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述擴(kuò)增獲得的沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌 16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析結(jié)果中，以纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段的變性梯度凝膠電泳的圖譜是否有條帶的差異來(lái)初步判斷纓小蜂體內(nèi)是否存在沃爾巴克氏細(xì)菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，GC夾子的序列為SQ10。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，制備聚丙烯酰胺為所述的變性梯度膠，分析所用的聚丙烯酰胺膠濃度為8% (質(zhì)量濃度)，變性梯度為40 %專(zhuān)利摘要
本發(fā)明提供一種纓小蜂體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏細(xì)菌群的檢測(cè)方法，具體包括以下幾個(gè)步驟提取纓小蜂樣品的總DNA，采用巢式PCR擴(kuò)增纓小蜂樣品中沃爾巴克氏細(xì)菌、總細(xì)菌和除沃爾巴克氏細(xì)菌外總細(xì)菌的16SrDNAV3高變區(qū)的基因片段，然后進(jìn)行DGGE(變性梯度凝膠電泳)分析，通過(guò)DGGE圖譜的分析和DGGE條帶的回收、克隆和測(cè)序分析，可以檢測(cè)纓小蜂樣品中的沃爾巴克氏細(xì)菌。該方法提供了一種相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕赑CR的檢測(cè)纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的技術(shù)方法，還可以快速、準(zhǔn)確的確定纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的種類(lèi)，對(duì)當(dāng)前昆蟲(chóng)體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測(cè)和相關(guān)研究具有重要促進(jìn)意義和實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GKCN102443635SQ201110368959
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月18日
發(fā)明者劉淑平, 呂仲賢, 徐紅星, 楊亞軍, 湯江武, 王新, 鄭許松 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan