專利名稱：源于腸道共生細菌的細胞外小泡及利用其的疾病模型、疫苗、備選藥物篩選方法與診斷方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種包含源于腸道共生細菌(gut microbiota or gut flora)的細胞外小泡的組合物及利用其的疾病動物模型、由源于腸道共生細菌的小泡引起的疾病的預防及/或者治療疫苗等。
背景技術：
腸道共生細菌由棲息于包括人在內的動物消化道(digestive tract)內的微生物構成，大約有100兆個腸道共生細菌棲息在人的消化道內，這一數字大約相當于人體細胞的10倍。
1960年代，研究人員通過電子顯微鏡發(fā)現革蘭氏陰性細菌分泌出細胞外小泡 [夕卜囊泡(extracellular vesicles) (EV)或者夕卜月莫囊泡(outer membrane vesicles) (OMV)], 0細胞外小泡成球狀，由雙層磷脂構成，其大小為20-200nm。源于革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡不僅含有LPS，而且還含有多種外膜蛋白(outer membrane protein) (Ε. Y. Lee 等，Proteomics in gram-negative bacterial outer membrane vesicles. Mass. Spectrom. Rev. 2008; 27 (6) : 535-555)。據報告，在因重癥敗血癥導致死亡的患者的血液中存在源于腦膜炎球菌的小泡(E. Namork禾口 P. Brandtzaeg, Fatal meningococcal septicaemia with 〃blebbing〃 meningococcus. Lancet. 2002；360 (9347):1741), 雖然有報告稱，源于腦膜炎球菌的細胞外小泡在體外分泌炎癥性媒介(Μ. R. Mirlashari 等，Outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis: effects on cytokine production in human whole blood. Cytokine. 2001;13 (2):91-97; A. Bjerre 等，Complement activation induced by purified Neisseria meningitidis lipopolysaccharide (LPS), outer membrane vesicles, whole bacteria, and an LPS-free mutant. J. Infect. Dis. 2002; 185 (2) : 220-2 )，但是，卻沒有發(fā)現有關源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的以胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、大腸癌等粘膜的炎癥為特征的局部疾病或者敗血癥、動脈硬化癥、糖尿病等全身炎癥疾病的研究結果。
最近，由于老年人口和免疫抑制劑、抗癌劑等藥物使用的增加等因素，導致人們對細菌感染的防御能力不斷弱化。同時，從世界范圍看，敗血癥的發(fā)病率正在逐年增加。敗血癥是一種因細菌、霉菌等局部感染導致的并發(fā)癥而引發(fā)全身出現炎癥反應的疾病(M. M. Levi 等.2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit. Care. Med. 2003; 31 : 1250-1256)。當感染時，局部病原菌分泌的物質流入血管或者流入血管的病原菌分泌的物質激活血管內炎癥細胞從而導致發(fā)生全身性炎癥反應綜合癥 (systemic inflammatory response syndrome)。同時，激活血管內皮細胞使形成彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation),血栓 (thrombosis)等，源于病原菌的物質分布在肺等重要臟器上，從而導致發(fā)生炎癥和造成相關組織損傷，最終30%以上的發(fā)病者都會死亡(E. Lolis和R. Bucala, Therapeuticapproaches to innate immunity: severe sepsis and septic shock. Nat. Rev. Drug. Discov.2003；2 (8):635-645)。
雖然將敗血癥定義為由病原菌引發(fā)全身性炎癥反應綜合癥，但是，有一半以上的敗血癥患者卻檢測不出血液內病原菌(R. S. Munford, Severe sepsis and septic shock: the role of gram-negative bacteremia. Annu. Rev. Pathol. 2006;1:467-496)。這就意味著，引發(fā)敗血癥并不需要細菌必須直接流入血液內，源于細菌等的物質流入血液內也可以導致敗血癥的發(fā)生。例如使源于革蘭氏陰性細菌的內毒素(endodotoxin)即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)流入血液內引發(fā)敗血癥，研究人員以此為基礎研發(fā)敗血癥治療劑(S. M. Opal, The host response to endotoxin, antilipopolysaccharide strategies, and the management of severe sepsis. Int. J. Med. Microbiol. 2007; 297 (5) : 365-377)。但是，到目前為止還沒有研發(fā)出，以 LPS M^](J. Hellman, Bacterial peptidoglycan-associated lipoprotein is released into the bloodstream in gram-negative sepsis and causes inflammation and death in mice. J. Biol. Chem. 2002;19;277(16):14274—14280)。
為了研發(fā)針對人體所發(fā)生疾病的診斷、預防及治療技術，重要的就是構建能夠模擬人體疾病的合適動物模型。為了構建敗血癥動物模型，到目前為止都采用以下三種方法 (J. A. Buras 等，Animal models of sepsis setting the stage. Nat. Rev. Drug. Discov. 2005;4(10) :854-865) ο第一，可以將LPS注入實驗動物的腹腔內構建敗血癥模型。第二，可以將細菌注入腹腔內構建敗血癥模型。第三，在將盲腸結扎后可以通過穿孔 (cecal ligation and puncture, CLP)構建敗血癥模型。但是，這種敗血癥動物模型不能準確反映再現性、實驗者間的誤差或者人發(fā)生敗血癥的表現型。因此，為了研發(fā)針對敗血癥的診斷、預防及治療技術，就需要構建實驗者間的誤差小、再現性高、能夠準確反映人發(fā)生敗血癥的表現型的動物模型。
炎癥性媒介(特別是，IL-6)在血液內增加是敗血癥的典型指數。研發(fā)人員提出了通過測定細菌分泌的炎癥性媒介評估針對治療細菌性感染的備選物質效果的實例(國際專利公開 W02009/030093 Functions and uses of human protein phosphatase 1 inhibitor-2)。但是，卻沒有告知從體外將源于腸道共生細菌的細胞外小泡注入細胞內調節(jié)炎癥性媒介分泌的備選藥物篩選方法及在利用源于共生細菌的細胞外小泡的敗血癥動物模型中將備選藥物注入體內調節(jié)炎癥性媒介分泌的備選藥物篩選方法。
從數十年前開始，就已經研發(fā)并廣泛使用了應用細菌分泌的外毒素(exotoxin) 蛋白的疫苗。有關革蘭氏陽性細菌的疫苗雖然研發(fā)出了針對細胞壁成份(莢膜多糖 capsular polysaccharide)的疫苗，但是存在無相關于T細胞形成抗體的缺點。另外，為了改善這一缺點，雖然研發(fā)出了于細胞壁成份上接合(conjugation)蛋白質形式的疫苗， 但是，這種形式的疫苗僅對特定細菌的亞型有特殊作用，具有一定的局限性。針對革蘭氏陰性細菌的疫苗目前為止還沒有在臨床使用的例子。最近，關于針對革蘭氏陰性細菌即腦膜炎球菌的疫苗，研發(fā)人員通過將細菌經洗滌劑(detergent)處理后獲得的人造小泡而石if發(fā)出了疫苗(M. P. Girard 等，A review of vaccine research and development: meningococcal disease. Vaccine. 2006;24(22):4692-4700)。美國專利 US7384645 "Outer membrane vesicles from Gram negative bacteria and use as a vaccine"的特征在于，從腦膜炎球菌中提取小泡作為疫苗使用。美國公開專利US 2007/0166333 "Method of antigen incorporation into neisseria bacterial outer membrane vesicles and resulting vaccine formulations〃涉及一禾中將蛋白抗原插入腦膜炎球菌小泡內的方法，其特征在于依據上述方法，不僅可以保持小泡的免疫刺激特性，而且還能夠提高免疫反應，從而可以將其作為針對腦膜炎球菌感染的預防和治療的疫苗使用。另外，關于腦膜炎球菌疫苗的生產和使用，也申請了一種涉及適合疫苗生產的腦膜炎球菌菌株培養(yǎng)過程的專利(國際專利公開WO 2007/144316及WO 2004/014417)。另外，研發(fā)人員開展了源于沙門氏菌的小泡提高宿主的先天性免疫及獲得性免疫反應，以檢驗其作為疫苗的效果的石if究(R. C. Alaniz 等，Membrane vesicles are immunogenic facsimiles of Salmonella typhimurium that potently activate dendritic cells， prime B and T cell responses, and stimulate protective immunity in vivo. J Immunol. 2007；179(11):7692-701)。但是，到目前為止，還沒有報告披露為預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病及由腸道共生細菌引發(fā)的感染而利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡生產的疫苗。發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的在于，提供一種包含源于腸道共生細菌的細胞外小泡的組合物及利用該組合物的疾病動物模型。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種有效篩選能夠預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病的備選藥物的方法。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種能夠預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病的疫苗。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種能夠預防或者治療由腸道共生細菌引發(fā)感染的疫苗。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種能夠利用上述疫苗預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病及/或者由腸道共生細菌引發(fā)感染的方法。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種診斷由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病原因因素的方法。
本發(fā)明所要解決的技術課題并不僅限于上面所提到的課題，本領域的技術人員可通過以下的表述可以明確理解上面未提到的課題或者其它相關課題。
技術方案本發(fā)明的一方面，提供了一種包含源于腸道共生細菌的細胞外小泡的組合物。
依據本發(fā)明的一個實施例，上述腸道共生細菌可以是共棲于腸道內的革蘭氏陰性細菌，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述腸道共棲革蘭氏陰性細菌可以是大腸桿菌 (Escherichia coli)、月市炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)細菌、類桿菌屬(Bacteroides)細菌，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述細胞外小泡可以是從腸道共生細菌培養(yǎng)液中分離出來的，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述細胞外小泡包括自然分泌和人工分泌兩種。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述細胞外小泡可以從哺乳動物的大便、腸道、胃液、小腸液或者口腔液等分離，但并不僅限于此。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種將源于腸道共生細菌的細胞外小泡注入于動物而構建的疾病模型。
本發(fā)明的腸道共生細菌及細胞外小泡如前面所述。
依據本發(fā)明的一個實施例，上述動物可以是老鼠，但并不僅限于此。
上述本發(fā)明的注入包括腹腔注入、靜脈注入、口腔注入、肛門注入、鼻腔注入、呼吸道呼吸道注入等。
上述本發(fā)明的疾病包括敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病等。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌等。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡預防或者治療疾病的備選藥物的篩選方法。
上述本發(fā)明的腸道共生細菌、細胞外小泡及疾病如前面所述。
依據本發(fā)明的一個實施例，上述篩選方法包括將源于腸道共生細菌的細胞外小泡注入細胞進行處理的步驟。上述細胞包括炎癥細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、干細胞等。另外，上述炎癥細胞包括單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞在組織中分化的細胞等，上述干細胞可以是源于骨髓組織或者脂肪組織的細胞，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述篩選方法包括將源于腸道共生細菌的細胞外小泡與備選物質一起注入后，測定炎癥相關媒介水平的步驟。上述炎癥相關媒介包括白細胞介素(Interleukin, IL)-6。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述篩選方法包括將源于腸道共生細菌的細胞外小泡與備選物質一起注入后，評估炎癥相關信號傳遞過程的步驟。
本發(fā)明的另一方面，為預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病而提供了一種包含源于腸道共生細菌的細胞外小泡的疫苗。上述本發(fā)明的腸道共生細菌、細胞外小泡、疾病等如前面所述。
依據本發(fā)明的一個實施例，上述疫苗可以基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用。上述變形包括使用轉化的細菌、將化合物注入細菌內進行處理等，上述化合物包括藥物。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用，上述變形包括將化合物注入細胞外小泡進行處理等，上述化合物包括藥物。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疫苗可以基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用或者與免疫增強劑并用使用，但并不僅限于此。
本發(fā)明的另一方面，為預防或者治療由腸道共生細菌引發(fā)的感染而提供了一種包含源于腸道共生細菌的細胞外小泡的疫苗。
依據本發(fā)明的一個實施例，由上述腸道共生細菌引發(fā)的感染包括腹膜炎、敗血癥、肺炎、泌尿道感染、骨關節(jié)及中樞神經系統感染等，但并不僅限于此。
上述本發(fā)明的腸道共生細菌如前面所述。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疫苗可以基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用，上述變形包括使用轉化的細菌、將化合物注入細菌進行處理等，上述化合物包括藥物。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用，上述變形包括將化合物注入細胞外小泡進行處理，上述化合物包括藥物。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疫苗可以基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用或者與免疫增強劑并用使用，但并不僅限于此。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種預防或者治療疾病的方法，包括將源于腸道共生細菌的細胞外小泡按低于致死量的標準注入哺乳動物的步驟。
上述本發(fā)明的腸道共生細菌及細胞外小泡如前面所述。
依據本發(fā)明的一個實施例，上述疾病包括由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)或者導致惡化的疾病。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括腹膜炎、敗血癥、肺炎、泌尿道感染、 骨關節(jié)及中樞神經系統感染，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述注入包括皮下注射、靜脈注射、鼻腔注入、舌下注入、呼吸道吸入、口服、肛門注入、皮膚注入、粘膜注入等。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用，上述變形包括使用轉化的細菌、將化合物注入細菌進行處理、將化合物注入細胞外小泡進行處理等，上述化合物包括藥物。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述注入可以基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用或者與免疫增強劑并用使用，但并不僅限于此。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種預防或者治療疾病的藥學組合物，包含通過利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡的篩選方法篩選的物質。
依據本發(fā)明的一個實施例，上述物質可以是激酶抑制劑(kinase inhibitor)，上述激酶抑制劑包括虎刺醛(3-羥基-1-甲氧基-9，10-二氧蒽-2-甲醛)、!1-7 (5-(2-甲基-1-哌嗪基)磺酰異喹啉二鹽酸鹽)、LY294002 (2-嗎啉-4-基-8-苯基苯并吡喃-4-酮)、GF109203X (3-[1-[3-( 二甲氨基)丙基]吲哚 _3_ 基]-4-(1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5- 二酮)、ML-7 (1-(5-碘萘-1-基)磺?；?1,4- 二氮雜環(huán)庚烷鹽酸鹽)、ML-9 (1-(5-氯萘-1-基)磺酰基-1，4-二氮雜環(huán)庚烷鹽酸鹽)、ZM449829 (1_(2_萘基)_2_丙烯-1-酮)、DRB ((2S，3S，4R，5R)-2-(5，6-二氯苯并咪唑-1-基)-5-(羥甲基)四氫呋喃-3，4- 二醇)、靛玉紅-3，- 一肟(3-[3-(羥氨酸)-1Η-吲哚-2-基]吲哚_2_酮)、 9-溴-7，12- 二氫-5H-吲哚并[3,2-d] [1]苯并氮雜卓 _6_ 酮(Kenpaullone) )、BML-259 (N-(5-異丙基噻唑-2-基)苯乙酰胺)及芹菜素(5，7-二羥基-2-(4-羥苯基)苯并吡喃-4-酮)等。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述物質可以是磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)，上述磷酸酶抑制劑包括PD-144795 (5-甲氧基_3_(1_甲基乙氧基)苯并[b] 噻吩-2-甲酰胺-1-氧化物)。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述物質可以是前體藥物(前體藥物prodrug)，上述前體藥物包括阿密替林、環(huán)苯扎林、地昔帕明、多塞平、氟奮乃靜二氯化物、氟哌啶醇、丙咪嗪、馬普替林、鄰甲苯海明、特非那定、托滅酸、鹽酸曲唑酮、三氯噻嗪、維拉帕米等。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)或者導致惡化的疾病。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌，但并不僅限于此。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種應用源于腸道共生細菌的細胞外小泡診斷疾病原因因素的方法。
上述本發(fā)明的腸道共生細菌如前面所述。
依據本發(fā)明的一個實施例，上述疾病包括敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述疾病包括口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述應用包括對源于腸道共生細菌的細胞外小泡所含遺傳物質的堿基序列進行分析，上述遺傳物質可以是16S rRNA，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述應用包括對源于腸道共生細菌的細胞外小泡所含蛋白質進行測定或者對源于腸道共生細菌的細胞外小泡的免疫反應進行測定，但并不僅限于此。上述免疫反應測定包括對源于腸道共生細菌的細胞外小泡的抗體進行測定，但并不僅限于此。
依據本發(fā)明的另一個實施例，上述診斷可以利用從血液、大便、小便、腦脊液、關節(jié)液、胸水或者腹水等提取的樣品，但并不僅限于此。
技術效果本發(fā)明通過發(fā)現源于共棲于腸道內大腸桿菌的細胞外小泡不僅誘發(fā)以粘膜出現炎癥為特征的局部疾病，而且被血液吸收后還引發(fā)以全身出現炎癥反應為特征的敗血癥等全身疾病，從而提供一種利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡的疾病模型、預防或者治療疾病的備選藥物的篩選技術，以及利用細胞外小泡的疾病預防或者治療用疫苗技術等。
在本發(fā)明中，當分離源于腸道共生細菌的細胞外小泡并將其注入細胞內時，會分泌出炎癥性媒介；當局部注入時，會引發(fā)粘膜炎癥；當通過腹腔注入時，細胞外小泡流入血管內會引發(fā)以全身出現炎癥反應為特征的敗血癥，同時，還會誘發(fā)血液凝固、肺氣腫、高血壓、骨質疏松癥等疾病。本發(fā)明可以利用以上特征提供一種有效篩選疾病動物模型及備選藥物的篩選方法。另外，可以通過利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡的篩選方法有效發(fā)掘可以預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病的藥物。另外，可以通過將源于腸道共生細菌的細胞外小泡本身或者將其變形后注入以調節(jié)免疫反應，從而將其應用于能夠有效預防或者治療由腸道共生細菌引發(fā)感染或者由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)疾病的疫苗研發(fā)。另外，還可以利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡研發(fā)診斷由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)疾病原因的技術。


圖1是通過分析源于老鼠大便的細胞外小泡蛋白質量而鑒定體內共生細菌種屬的示意圖；圖2是從正常老鼠小腸液中提取的細胞外小泡的透射式電子顯微鏡照片； 圖3是將從正常老鼠小腸中提取的細胞外小泡(siEV)注入RAW 264. 7巨噬細胞株中利用劑量依賴性處理6小時后對細胞培養(yǎng)液中表達的炎癥性媒介IL-6利用ELISA方法進行測定的示意圖；圖4是將從由DSS誘發(fā)炎癥性腸炎老鼠的小腸中提取的細胞外小泡(DSS_siEV)注入 RAff 264.7巨噬細胞株中利用劑量依賴性處理6小時后，對細胞培養(yǎng)液中表達的炎癥性媒介IL-6利用ELISA方法進行測定的示意圖；圖5是將從正常老鼠和由DSS誘發(fā)炎癥性腸炎老鼠的小腸中提取的細胞外小泡(分別為siEV，DSS_siEV)注入RAW 264. 7巨噬細胞株處理時將LPS的拮抗劑即多粘菌素B (PMB)注入細胞外小泡處理6小時后，對細胞培養(yǎng)液中表達的炎癥性媒介IL-6利用ELISA 方法進行測定的示意圖；圖6是顯示提取的老鼠腸道大腸桿菌的16s rRNA堿基序列的示意圖； 圖7及圖8是分別將提取的老鼠腸道大腸桿菌通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)禾口透身寸式電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察到的圖像；圖9是將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡的形狀與大小通過透射式電子顯微鏡分析獲得的圖像；圖10是以10張源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡的透射式電子顯微鏡照片為基礎按細胞外小泡大小分布的示意圖；圖11及圖12是將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)和從腸道大腸桿菌提取的 LPS按多種濃度處理后注入7巨噬細胞內培養(yǎng)，然后將對細胞因子(TNF_a IL-6)的量利用ELISA方法進行測定的示意圖；圖13及圖14將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)分別以1，10,100 ng注入老鼠鼻腔內后，對支氣管肺泡灌洗液內炎癥細胞細胞數量(BAL細胞)和IL-6的量進行測定的示意圖；圖15是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 15，25，50 μ g分別通過一次腹腔注入C57BL/6 (雄性，6周)老鼠后，每隔12小時顯示老鼠存活率的示意圖；圖16是將源于大腸桿菌的細胞外小泡5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再分別間隔6，12，24小時后對提取的老鼠血液的血清中對炎癥性媒介即TNF-α，IL-6, IL-I β， IL-12，IFN- y , IL-10, IL-17，VEGF的濃度利用ELISA方法進行測定的示意圖；圖17將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再每隔M小時測定其呼吸頻率的示意圖；圖18是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再每隔8小時連續(xù)3天測定其體溫的示意圖；圖19是將源于大腸桿菌的細胞外小泡5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再分別間隔6，12，24小時后分析其白血球數量的示意圖；圖20是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再隔12小時后分析其白血球總數及每種白血球數量的示意圖；圖21是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再每隔M小時測定其血壓的示意圖；圖22是將源于大腸桿菌的細胞外小泡5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再分別間隔6，12，24小時測定D-二聚體(dimer)量的示意圖；圖23是將源于大腸桿菌的細胞外小泡5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再分別間隔6，12，24小時測定血小板數量的示意圖；圖對是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)分別按0. 1，1，5，10,20 ng/ml注入血管內皮細胞處理后確認ICAM-I表達的增加量的示意圖；圖25是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 1 ng/ml注入血管內皮細胞處理后測定血液凝固因子即組織因子(tissue factor)的分泌的示意圖；圖26是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 10 μ g利用花青苷-7 (cyanin-7, cy7)染色后注入老鼠的腹腔內間隔6小時后通過柯達影像(Kodak image station)系統獲得的老鼠全身整體熒光照片；圖27是對將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)分別按10，20 μ g利用DiO染色后注入老鼠的腹腔內間隔6小時后提取的血液和肺中利用RBC (紅細胞)裂解液除去紅細胞后，再通過熒光激活細胞分選儀(FACS)對包含細胞外小泡的血液細胞與肺組織細胞的比率進行分析的示意圖；圖觀是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率注射3 次后再分別間隔6，12二4小時后顯示的血液從血管至肺組織的穿透力(濕/干重比值 (wet-to-dry ratio))程度的示意圖；圖四是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再分別間隔6，12，24小時后顯示支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數量的示意圖；圖30是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率注射3次后再分別間隔6，12J4小時后將肺摘除放入4%甲醛(formaldehyde)中將其固定(fixing) 后制作切片，然后再通過蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)染色并通過光學顯微鏡進行觀察到的圖像；圖31是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)分別按0. 1，1 μ g每1周2次注射18 周后測定其血壓的函數圖；圖32是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 1 μ g每1周2次注射18周后通過X 射線技術觀察到的長骨圖像；圖33是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 25 μ g通過腹腔注入到正常老鼠 (C57BL/6，雄性6周)和IL-6缺乏老鼠(C57BL/6，雄性，6周)后每隔12小時顯示老鼠存活率的示意圖；圖；34是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g按間隔12小時的頻率分3次注入到正常老鼠(C57BL/6，雄性6周)和IL-6缺乏老鼠(C57BL/6，雄性，6周)后再分別間隔 6，12，M小時后將肺放入4%甲醛(formaldehyde)中將其固定(fixing)后制作切片，然后再通過蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)染色并通過光學顯微鏡觀察到的圖像；圖35是利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡(EV)發(fā)掘藥物備選物質方法的模式圖； 圖36是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(100 ng/ml)和激酶抑制劑同時注入老鼠巨噬細胞處理后對培養(yǎng)液中存在的IL-6量以僅將細胞外小泡單獨處理的陽性對照群的測定值為基準按百分比顯示的函數圖；圖37是針對將激酶抑制劑單獨處理的情況和將兩種以上組合處理的情況，對由源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)誘發(fā)的老鼠巨噬細胞IL-6分泌量按陽性對照群的百分比顯示的函數圖；圖38是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(100 ng/ml)和磷酸酶抑制劑(10 μ M，1 ；斑蝥酸，2;斑蝥素.3;內氧草索(Endothall)，4;芐基磷酸，5; L-p-對溴四咪唑草酸鹽，6; RK-682，7; RWJ-60475, 8; RWJ-60475 (AM) 3，9;鹽酸左旋咪唑，10;鹽酸四咪唑，11;氯氰菊酯，12;溴氰菊酯，13;氰戊菊酯，14;酪氨酸磷酸化抑制劑8，15; CinnGEL, 16; CinnGEL 2 Me, 17; BN-82002,19; NSC-663284，20;環(huán)孢菌素 A，21;戊烷脈，22; BVT-948,24; BML-268， 26; BML-260,27; PD-144795，28； BML-267,29; BML-267 酯，30; 0BA，31; OBA酯，33；阿侖膦酸鈉)同時注入老鼠巨噬細胞處理后對培養(yǎng)液中存在的IL-6量以僅將細胞外小泡單獨處理的陽性對照群測定值為基準按百分比顯示的函數圖；圖39是含有濃度分別為0. 1,1,5,10 μΜ的PD-144795和源于大腸桿菌的細胞外小泡 (EC_EV)的培養(yǎng)液注入老鼠巨噬細胞處理后顯示IL-6分泌的函數圖。
圖40是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(lOOng/ml)和前體藥物同時注入老鼠巨噬細胞處理后對培養(yǎng)液中存在的IL-6量以僅將細胞外小泡單獨處理的陽性對照群測定值為基準按百分比顯示的函數圖；圖41是含有濃度為10 μ M的前體藥物和源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)的培養(yǎng)液注入源于老鼠腹腔的巨噬細胞處理后顯示IL-6分泌的函數圖；圖42是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 5 μ g注入老鼠腹腔引發(fā)全身性免疫反應，再將前體藥物即氟哌啶醇(haloperitol)和多塞平(dox印in)分別按10 mg/kg注入上述老鼠腹腔內并對血清內IL-6分泌進行測定的示意圖；圖43在將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 1 μ g間隔1周分3次注入腹腔的過程中對老鼠血液內小泡特異抗體的量進行測定的函數圖；圖44是將源于大腸桿菌的細胞外小泡從體外向已注入有源于大腸桿菌的細胞外小泡 (EC_EV)疫苗的老鼠脾臟細胞注入并處理時顯示分泌的IFN-g量的函數圖；圖45是將源于大腸桿菌的細胞外小泡從體外向已注入有源于大腸桿菌的細胞外小泡 (EC_EV)疫苗的老鼠脾臟細胞注入并處理時顯示分泌的IL-17量的函數圖；圖46是將源于大腸桿菌的細胞外小泡從體外向已注入有源于大腸桿菌的細胞外小泡 (EC_EV)疫苗的老鼠脾臟細胞注入并處理時顯示分泌的IL-4量的函數圖；圖47是顯示因通過腹腔注入大腸桿菌(EC)誘發(fā)敗血癥而導致老鼠致死率的示意圖； 圖48是顯示源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗(EC_EV)對通過腹腔注入大腸桿菌(EC) 誘發(fā)敗血癥所起效果的函數圖；圖49是在通過腹腔注入大腸桿菌(EC)誘發(fā)敗血癥的模型中根據是否接種源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)顯示血液及腹腔中大腸桿菌數量(CFU)的函數圖；圖50是在通過腹腔注入大腸桿菌(EC)誘發(fā)敗血癥的模型中根據是否接種源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)在感染大腸桿菌6小時后測定血清中存在的IL-6量的示意圖；圖51是在通過腹腔注入大腸桿菌(EC)誘發(fā)敗血癥的模型中根據是否接種源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)在感染大腸桿菌6小時后摘出老鼠的肺對肺組織進行觀察的圖像；圖52是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(5μ g)通過腹腔分3次注入到接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)的老鼠后間隔6小時對老鼠血清中的IL-6進行測定的示意圖；圖53是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(5 μ g)通過腹腔分3次注入到接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)的老鼠后隔6小時對與敗血癥相關的全身性炎癥反應指標即體溫進行測定的示意圖；圖M是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(5 μ g)通過腹腔分3次注入到接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)的老鼠后隔6小時對彌散性血管內凝血指標即血液內血小板的減少情況進行觀察的圖像；圖55是對通過腹腔接種多種濃度的源于克雷伯菌的細胞外小泡(KP_EV)的老鼠血液中對源于克雷伯菌的細胞外小泡特異抗體的量進行測定的函數圖；圖56是將源于克雷伯菌的細胞外小泡于體外向從通過腹腔接種多種濃度的源于克雷伯菌的細胞外小泡(KP_EV)的老鼠脾臟中提取的T細胞注入處理后顯示⑶3+⑶4+IFN-g+ T 細胞數量的示意圖；圖57將源于克雷伯菌的細胞外小泡于體外向從通過腹腔接種多種濃度的源于克雷伯菌的細胞外小泡(KP_EV)的老鼠脾臟中提取的T細胞注入處理后顯示⑶3+⑶4+IL17+ T細胞的示意圖；圖58是顯示因通過腹腔注入克雷伯菌(KP)誘發(fā)敗血癥而導致老鼠致死率的示意圖； 圖59是觀察源于克雷伯菌的細胞外小泡疫苗對通過腹腔分3次接種源于克雷伯菌的細胞外小泡(KP_EV) 1 μ g的老鼠感染克雷伯菌(KP)誘發(fā)敗血癥所起效果的函數圖；圖60是將源于大腸桿菌和克雷伯菌的細胞外小泡(分別為EC_EV，KP_EV)疫苗通過并合腹腔接種時對血液中源于大腸桿菌的細胞外小泡特異抗體的形成進行測定的函數圖；圖61是將源于大腸桿菌和克雷伯菌的細胞外小泡(分別為EC_EV，KP_EV)疫苗通過并合腹腔接種時對血液中源于克雷伯菌的細胞外小泡特異抗體的形成進行測定的函數圖；圖62是對從C57BL/6老鼠大便中分離的細胞外小泡的遺傳物質堿基序列進行序列分析(sequencing)的示意圖；圖63是對從BALB/c老鼠大便中分離的細胞外小泡的遺傳物質堿基序列進行序列分析的示意圖；圖64是將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)利用細菌-通用引物 (bacteria-universal primer)進行 RT-PCR 處理后顯示 16S rRNA 的基因及源于 16S rRNA 的RNA轉錄體(RNA transcript)的示意圖；圖65是從通過老鼠腹腔注入源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 25 μ g的組和注入PBS的組中提取各種臟器及體液并評估是否存在源于大腸桿菌的細胞外小泡蛋白的示意圖。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種源于腸道共生細菌的細胞外小泡及利用該小泡的疾病模型、疫苗、備選藥物篩選方法及診斷方法等。
在本發(fā)明中，所謂的〃腸道(gut)〃意味著包括哺乳動物消化道(digestive tracts)的內部及上皮細胞層表面，例如可以是以人類為首的哺乳動物消化道即口腔、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門、膽管、膽囊，、胰管等的內部及上皮細胞層表面，但并不僅限于此。
在本發(fā)明中，所謂的〃腸道共生細菌(gut microbiota or gut flora) 〃是指棲息于哺乳動物消化道內部或者表面的細菌，其特征在于在正常狀態(tài)下不會誘發(fā)疾病，但是在防御能力降低的狀態(tài)下或者離開消化道時就會引發(fā)疾病，本領域技術人員所公知的腸道共生細菌包含在其中，但并不僅限于此。
在本發(fā)明中，所謂的“源于腸道共生細菌的細胞外小泡“包括哺乳動物腸道共生細菌在腸道內分泌或者被體內吸收后分泌的小泡，其特征在于大小比原來細胞小，但并不僅限于此。
腸道共生細菌一般作為引發(fā)疾病的病原性細菌，往往不被重視。對于由細菌引發(fā)的腸道感染，人們往往主要關注的是攝入被病原性細菌污染的食物等而引發(fā)的急性感染性疾病。最近，就胃炎、消化性潰瘍、胃癌等的發(fā)病而言，人們都關注共棲于胃內的螺桿菌 (helicobacter)0另外，關于炎癥性腸炎、大腸癌的發(fā)病，人們都關注共棲于大腸內的細菌。 但是，對于作為引發(fā)上述胃腸道疾病的致病物質即源于腸道共生細菌的細胞外小泡的重要性一直沒有足夠的認識。
本發(fā)明人首次闡明，源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)粘膜炎癥，特別是誘發(fā)以對癌癥病因產生重要影響的中性粒細胞性炎癥為特征的Thl7免疫反應，并將源于腸道共生細菌的細胞外小泡通過局部注入而研發(fā)出針對上述局部疾病的疾病模型。
關于以全身性炎癥反應為特征的敗血癥病因，有人說是源于細菌的物質被血管吸收后引發(fā)的，但是卻沒有談到病因物質的實體。本發(fā)明人首次闡述，當源于腸道共生細菌的細胞外小泡流入血管時，就會通過血液中炎癥性媒介的分泌引發(fā)以全身性炎癥反應為特征的敗血癥、血管內凝血、肺氣腫等疾病。這就意味著，不僅對于敗血癥的發(fā)病，而且對于以因血管內凝血而導致血栓形成為特征的急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中等血管疾病、肺氣腫、 急性呼吸窘迫綜合癥等肺疾病的發(fā)病，源于腸道共生細菌的細胞外小泡都是重要的致病因子，并通過將源于腸道共生細菌的細胞外小泡向全身注入而研發(fā)出了針對上述全身疾病的疾病模型。
人們都知道，腸道感染細菌以后就會誘發(fā)關節(jié)炎。最近，肥胖、糖尿病等代謝疾病與腸道細菌之間的關聯性受到了研究人員的關注。本發(fā)明人最早闡述，將源于腸道共生細菌的細胞外小泡按低用量、長時間、全身注入就會誘發(fā)高血壓、骨質疏松癥等疾病，這表明， 作為病因不明的慢性疾病的致病物質，源于腸道共生細菌的細胞外小泡非常重要，并且可以利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡研發(fā)出上述疾病模型。
為了研發(fā)出預防或者治療疾病的藥物，準確掌握致病物質是非常重要的，例如在將致病物質從體外向細胞注入的過程中，可以對備選藥物進行處理并檢驗其效果，同時，可以將備選藥物注入上述動物模型檢驗其效果。為了研發(fā)出預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)疾病的藥物，本發(fā)明人確立了對利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡的備選藥物進行篩選的篩選方法，并通過這一方法研發(fā)出了相應的藥物。也就是說，通過上述篩選方法從80種激酶抑制劑中發(fā)掘了抑制分泌炎癥性媒介的11種備選藥物，從30種磷酸酶抑制劑中發(fā)掘了 1種備選藥物，從100種前體藥物中發(fā)掘了 14種備選藥物，并在上述疾病動物模型中檢驗了其效果。這就意味著，通過本發(fā)明研發(fā)的備選藥物篩選方法能夠非常有效地發(fā)掘用于預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)疾病的藥物。
準確掌握疾病的致病因子對于預防或者治療疾病疫苗的研發(fā)是必不可少的。就病毒性感染疾病而言，先通過將致病病毒以弱毒(attenuation)形態(tài)注入體內誘發(fā)針對病毒的免疫反應并研發(fā)出預防疫苗使用，現在就可以利用預防疫苗有效地預防由病毒引發(fā)的疾病。本發(fā)明人闡明，通過將源于腸道共生細菌的細胞外小泡注入體內誘發(fā)針對小泡的免疫反應，從而就能夠有效地預防由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病。這意味著，對于敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎、腦病等全身疾病及口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、 胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌、胰腺癌等局部疾病的發(fā)生，作為相關于源于腸道共生細菌的細胞外小泡疾病的疫苗，可以使用源于腸道共生細菌的細胞外小泡本身，或者為了增強效果或減少副作用而使用變形的小泡或者與藥物并用，從而就可以有效地預防或者治療上述疾病。
為了預防由細菌分泌的外毒素引發(fā)的疾病，數十年前就已經研發(fā)出了利用外毒素蛋白的預防疫苗并一直使用。但是，至今還沒有研發(fā)出針對細菌本身的有效疫苗。作為針對細菌本身的預防疫苗的實例，就革蘭氏陽性細菌而言，雖然研發(fā)出了利用細胞壁成份的疫苗，但是，生成了 T細胞非依賴性抗體，由于只生成了僅對細菌的亞型有特異作用的抗體， 其效果有限。為了生成T細胞依賴性抗體，就研發(fā)出了細胞壁成份與蛋白質接合形態(tài)的疫苗，但是，價格非常昂貴，且具有僅作用于細菌的亞型的缺點。如果將源于細菌的小泡作為疫苗使用，由于小泡中含有源于細菌的多種蛋白質，因此就可以克服原來的細菌疫苗針對細菌的亞型誘發(fā)特異免疫反應的缺點，不僅形成了針對細菌的抗體，而且還有誘發(fā)T細胞反應的免疫增強劑，因此具有能夠有效地誘發(fā)免疫反應的優(yōu)點。本發(fā)明通過注入源于腸道共生細菌的細胞外小泡，不僅形成了針對細菌蛋白的抗體，而且還有效地誘發(fā)了對細菌的防御有重要作用的T細胞免疫反應即Thl及Thl7免疫反應，從而就能夠有效地預防由腸道共生細菌引發(fā)的感染。這意味著，作為針對由腸道共生細菌引發(fā)的腹膜炎、敗血癥、肺炎、泌尿道感染、骨關節(jié)及中樞神經系統感染等的疫苗，可以使用源于腸道共生細菌的細胞外小泡本身，或者為增強效果或減少副作用而使用變形的小泡或者與藥物并用，從而就能夠有效地預防或者治療上述感染。
源于腸道共生細菌的細胞外小泡是敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎、腦病等全身疾病及胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、腸易激綜合征、大腸癌等局部疾病的致病物質的事實對于準確診斷致病物質不明的上述疾病的病因是非常重要的。本發(fā)明人分析了源于腸道共生細菌的細胞外小泡的遺傳物質的堿基序列，進行了蛋白質鑒定，并闡述了針對源于腸道共生細菌的細胞外小泡的特異抗體的形成，從而研發(fā)出了準確診斷上述疾病致病因子的方法。
在本發(fā)明中，從老鼠大便中分離出細胞外小泡并對其蛋白質組進行了分析。結果表明，鑒定了總共295個蛋白質，其中73個蛋白質源于老鼠宿主細胞，77個源于革蘭氏陰性細菌，145個源于革蘭氏陽性細菌。通過對從大便中分離的細胞外小泡蛋白質進行分析，鑒定了分泌細胞外小泡的細菌，發(fā)現革蘭氏陰性細菌包括多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、大腸桿菌(Esherichia coli)、月市炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)等，革蘭氏陽性細菌包括長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、產氣英月莫梭菌(Clostridium perfringens)、1 腸球菌(Enterococcus faeacalis) ^ MMj ^ff ^ (Eubacterim rectale) > ^^ILff ^ (Lactobacillus reuteri) > 0 Slff^ (Propiobacterium acnes)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)等。
炎癥性腸炎是一種以大腸的慢性炎癥為特征的疾病，最近，由Thl7免疫反應引發(fā)的炎癥正受到研究人員的關注。特別是，炎癥性腸炎作為導致大腸癌的危險因素，通過動物實驗表明Thl7免疫反應會誘發(fā)大腸癌。眾所周知，現在普通采用口服埃羅替尼埃羅替尼葡聚糖硫酸酯鈉(dextran sodium sulfate,DSS)構建炎癥性腸炎動物模型的方法。在本發(fā)明中，口服1% DSS 6日后，第7日從小腸液中分離出細胞外小泡。將分離的細胞外小泡從體外注入老鼠巨噬細胞 (RAW 264. 7)處理時，從正常老鼠小腸液中分離的小泡未誘發(fā)白細胞介素anterleukin，IL)-6的分泌，但是，從疾病狀態(tài)老鼠小腸液中分離的小泡卻誘發(fā) IL-6的分泌。如果考慮到IL-6是誘發(fā)Thl7免疫反應的重要媒介，則從疾病狀態(tài)小腸液中分離的細胞外小泡就能夠誘發(fā)Thl7免疫反應。另外，當將其與拮抗革蘭氏陰性細菌的細胞外膜成份即LPS的多粘菌素b (polymyxin B)—起注入從疾病狀態(tài)的小腸液中分離的細胞外小泡時，不分泌IL-6。這意味著，在腸道共生細菌中源于革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡對誘發(fā)炎癥性腸炎起著重要作用。
將老鼠的盲腸結扎后通過盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)制作敗血癥動物模型的方法比較普遍。在本發(fā)明中，實施CLP后，通過腹腔灌洗從腹腔中分離與敗血癥相關的腸道共生細菌，通過16S rRNA堿基序列鑒定分離出的細菌屬于大腸桿菌。 通過電子顯微鏡照片確認大腸桿菌表面分泌了 20-40 nm大小的球狀細胞外小泡。
在本發(fā)明中，無需通過其它的物理化學刺激就可以從腸道共生細菌培養(yǎng)液中分離出通過生理方式分泌的細胞外小泡。例如將大腸桿菌在培養(yǎng)基中長時間培養(yǎng)后，收集上層液，將比細胞外小泡大的物質通過過濾器過濾后，通過超速離心分離濃縮溶液，從而分離出細胞外小泡。源于大腸桿菌的細胞外小泡包括能夠誘發(fā)炎癥反應的LPS和外膜蛋白(outer membrane protein)。大腸桿菌培養(yǎng)液中自然分泌的細胞外小泡由質量比為75%的LPS與大腸桿菌外膜及外膜蛋白構成。
除了上述分離自然分泌的細胞外小泡的方法之外，也可以通過多種機械、電氣、 化學方法分離源于腸道共生細菌的細胞外小泡，也可以通過利用滲透壓的細胞溶解、電穿孑L (electroporation)、超聲講角軍處理(sonication)、均質化(homogenization)、灌洗劑 (detergent)處理、冷凍-解凍(freeze-thaw)、擠壓(extrusion)、機械降解等方法人工構建細胞外小泡后再進行分離。在本發(fā)明中，以下無其它標記的細胞外小泡是指培養(yǎng)細菌自然分泌的細胞外小泡。
為了評估通過上述方法分離的源于大腸桿菌的細胞外小泡是否能夠誘發(fā)炎癥性媒介的分泌，將細胞外小泡注入老鼠巨噬細胞(RAW沈4. 7)處理。結果表明，巨噬細胞中 TNF-α與IL-6等炎癥性媒介的分泌與細胞外小泡的濃度成比例增加。
大腸內棲息有大量的共生細菌，為了評估由特定細菌引發(fā)的病因，就使用腸內無菌的小鼠(germ free mouse)。相比大腸而言，呼吸道上沒有共生細菌，它具有評估由特定細菌引發(fā)的病因的最佳環(huán)境。在本發(fā)明中，為了評估源于大腸桿菌的細胞外小泡是否局部作用于粘膜而誘發(fā)炎癥，將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入呼吸道。結果表明，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BAL fluid)內的炎癥細胞數量與細胞外小泡的濃度成比例增加。另外，Thl7免疫反應及引發(fā)癌癥相關的IL-6的分泌也與小泡的濃度成比例增加。這意味著，源于腸道共棲革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡能夠局部作用于粘膜而誘發(fā)以Thl7免疫反應為特征的炎癥。
為了評估當源于大腸桿菌的細胞外小泡被全身吸收時是否誘發(fā)全身炎癥反應，將細胞外小泡注入腹腔內。結果表明，老鼠的死亡率與細胞外小泡的濃度成比例增加。
敗血癥的特征在于，發(fā)生局部細菌感染的同時還帶有全身炎癥反應(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), SIRS由呼吸急促、低體溫或者高體溫、心率增加、白血球減少或者增加等指標構成，如果這些指標中滿足2個以上就定義為敗血癥。在本發(fā)明中，當將源于大腸桿菌的細胞外小泡按照低于致死量的用量注入老鼠腹腔內時，血液中的炎癥性媒介即TNF-a IL-6, IL-12，IL-17等就增加，并誘發(fā)呼吸急促、低體溫、白血球減少。這說明，源于大腸桿菌的細胞外小泡被血管吸收后分泌炎癥性媒介，并通過炎癥性媒介誘發(fā)敗血癥。
敗血癥在臨床上得到重視的原因就是其死亡率非常高，如果在患上敗血癥期間發(fā)展成為重癥敗血癥(severe s印sis)，則死亡的可能性就非常高。在本發(fā)明中，當將細胞外小泡注入腹腔內時，就會誘發(fā)出現重癥敗血癥的指標即低血壓。這意味著，即使在患上敗血癥期間發(fā)展成為重癥過程中，源于細菌的細胞外小泡也能夠發(fā)揮重要的作用。
如果血管中的血液凝固(coagulation)就會堵塞血管，成為造成猝死(suddendeath)的主要原因。特別是，如果腦血管與冠狀動脈因血液凝固形成的血栓(thrombosis) 而堵塞，大多就會分別因腦卒中(stroke)和急性冠狀動脈綜合癥(acute coronary syndrome)而死亡。
在本發(fā)明中，為了評估當源于腸道共生細菌的細胞外小泡流入血管時是否誘發(fā)血液凝固，將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入腹腔。結果表明，在注入細胞外小泡的群中，血液內減少了彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)的指標即血小板，同時，增加了 D-二聚體的量。這意味著，源于腸道共生細菌的細胞外小泡流入血管后引起血液凝固，如果腦血管與冠狀動脈內發(fā)生血液凝固，就會分別引發(fā)腦卒中和急性冠狀動脈綜合癥。
為了評估源于腸道共生細菌的細胞外小泡是否作用于血管內皮細胞將其激活并引起血液凝固，將源于腸道共生細菌的細胞外小泡注入血管內皮細胞(HUVEC)進行處理。 結果表明，據說在包括炎癥反應及冠狀動脈疾病在內的各種疾病狀況下會增加的ICAM-I 的量增加了，血液凝固因子即組織因子(tissue factor)的分泌也增加了。這意味著，在源于腸道共生細菌的細胞外小泡的作用下將激活血管內皮細胞，發(fā)生血液凝固，誘發(fā)因血栓 (thrombosis)或者栓塞(embolism)堵塞血管而導致的缺血性血管疾病。
當源于腸道共生細菌的細胞外小泡流入血管時，其它的問題是會分布在多個臟器上。實際上，當將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入腹腔時，細胞外小泡分布在全身，特別是， 可以向肺組織滲透，從而評估向肺組織滲透的細胞外小泡是否誘發(fā)肺炎。結果表明，肺炎的指標即濕/干重比值(wet-dry ratio)在注入細胞外小泡的情況下明顯增加，同時支氣管肺泡灌洗液內炎癥細胞的數量也增加了。另外，還評估了炎癥是否引發(fā)組織損傷，結果表明，在注入細胞外小泡的情況下，發(fā)生了以破壞肺泡為特征的肺氣腫。這意味著，源于腸道共生細菌的細胞外小泡如果被血管吸收，就不僅分布在肺上，而且還分布在腦、骨關節(jié)、腎臟等多種臟器上，引發(fā)炎癥和組織損傷，從而誘發(fā)多種疾病。
腸道共生細菌持續(xù)分泌細胞外小泡，且細胞外小泡會流入血管會引發(fā)多種問題。 在本發(fā)明中，當將源于大腸桿菌的細胞外小泡按低用量、長時間注入時，觀察體內發(fā)生的變化。結果表明，細胞外小泡誘發(fā)高血壓，同時還引發(fā)骨質疏松癥。這意味著，源于腸道共生細菌的細胞外小泡對于目前為止病因不明的慢性炎癥疾病的發(fā)病來說是重要的致病因子。
IL-6通過發(fā)揮多種作用干預炎癥疾病及癌癥的發(fā)生，IL-6通過經由STAT3進行的信號傳遞誘導密切關聯于癌癥發(fā)生相關的細胞增殖(cell proliferation)、血管生成 (angiogenesis)、侵襲(invasion)、免疫逃避(immune evasion)的基因表達,并通過對癌癥發(fā)生有重要影響的Thl7免疫反應，在中性粒細胞性炎癥作用下誘導癌癥發(fā)生。另外，血液中IL-6的濃度與包括動脈硬化癥及肺氣腫在內的慢性阻塞性肺病患者的死亡相關的預后有密切的關聯性。特別是，血液中由炎癥細胞分泌的IL-6作用于血管內皮細胞增加與血液凝固相關的基因表達，并干預血液凝固。在本發(fā)明中，為了通過利用源于大腸桿菌的細胞外小泡構建的敗血癥動物模型評估IL-6對疾病病因產生的作用，將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入正常及IL-6缺乏老鼠的腹腔內。結果表明，有80%以上的正常老鼠因源于大腸桿菌的細胞外小泡導致死亡，但是，IL-6缺乏老鼠卻因注入小泡而全部存活。另外，對于因將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入腹腔而引發(fā)肺氣腫的情況，正常老鼠均因注入小泡而發(fā)病，但是，IL-6缺乏老鼠卻未觀察到發(fā)病。這意味著，源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)體內分泌的IL-6是細胞外小泡誘發(fā)疾病病因的一個非常重要的生物標志物。
基于上述研究成果，本發(fā)明人希望研發(fā)出一種篩選用于預防或者治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)疾病的備選藥物的篩選方法。為此，用源于大腸桿菌的細胞外小泡作為致病因子評估老鼠巨噬細胞(RAW 264. 7)分泌的IL-6的效果。將細胞外小泡與 80 種激酶抑制劑(激酶抑制劑庫，BIOMOL No. 2832: PD-98059, U-0126, SB-203580, H-7, H-9，AG-494，AG-825，灰薰草菌素A，RG-14620，酪氨酸磷酸化抑制劑23，酪氨酸磷酸化抑制劑25，酪氨酸磷酸化抑制劑46，酪氨酸磷酸化抑制劑47，酪氨酸磷酸化抑制劑51，酪氨酸磷酸化抑制劑1，酪氨酸磷酸化抑制劑9，酪氨酸磷酸化抑制劑AG 1288,酪氨酸磷酸化抑制劑AG 1478，酪氨酸磷酸化抑制劑AG 1295, HNMPA，虎刺醛，白皮杉醇，AG-490， AG-126，AG-370，AG-879，LY 294002，渥曼青霉素，GF 109203X，金絲桃素，鞘氨醇，H-89， H-8, HA-1004, HA-1077, HDBA, KN-62，KN-93，ML-7，ML-9，2-氨基嘌呤，N9-異丙基-奧羅莫星，奧羅莫星，異奧羅莫星，核抑制劑(Roscovitine)，LFM-Al3, SB-202190, ZM 336372， SU 4312，AG-1296,粗糠柴毒素，染料木黃酮，大豆素(Daiazein)，癌基因抑活藥類似物 (Erbstatin analog)，槲皮素，SU 1498，ZM 449829, DRB (5，6-二氯-l-b-D-呋喃核糖基苯并咪唑)，HBDDE (2,2' ,3,3'，4，4'-六羥基-1，1'-聯苯-6，6'- 二甲醇二甲醚)，靛玉紅，靛玉紅-3，- 一肟，Y-27632，Kenpaul lone，土曲霉酸，BML-257，BML-259，芹菜素，BML-265 (埃羅替尼類似物)，雷怕霉素)，30種磷酸酯酶抑制劑(磷酸酯酶抑制劑庫，BIOMOL No. 2834: 斑蝥酸，斑蝥素.內氧草索(Endothall)，芐基磷酸，L-p-對溴四咪唑草酸鹽，RK-682， RWJ-60475, RWJ-60475 (AM) 3，鹽酸左旋咪唑，鹽酸四咪唑，氯氰菊酯，溴氰菊酯，氰戊菊酯， 酪氨酸磷酸化抑制劑8，CinnGEL, CinnGEL 2 Me, BN-82002，紫草素，NSC_663^4，環(huán)孢菌素 A，戊烷脒，BVT-948, B4-繞丹寧，BML168，二氧菲(Dioxophenanthrene)，BML-260, PD-144795，BML-267, BML-267酯，0ΒΑ, OBA酯，棉酚，阿侖膦酸鈉)，100種前體藥物(前體藥物；醋氨酚，乙酰半胱氨酸，別嘌呤醇，鹽酸阿普洛爾，鹽酸阿密替林，阿托品，溴芐乙胺，溴苯那敏，布地奈德，鹽酸丁螺環(huán)酮，頭孢呋辛，水合氯醛，鹽酸氯丙嗪，甲氰咪胍，鹽酸氯米帕明，克霉唑，環(huán)苯扎林，鹽酸地昔帕明，雙氯芬酸，二氟尼柳，地爾硫卓，鹽酸苯海拉明，達舒平，戒酒硫，D-甘露醇，多塞平，強力霉素水物，琥珀酸多西拉敏，依酚氯銨，馬來酸依那普利，法莫替丁，芬布芬，非諾貝特，苯氧布洛芬鈣，氟桂嗪二鹽酸鹽，氟奮乃靜二氯化合物，氟比洛芬，速尿靈，吉非羅齊，格列齊特，格列吡嗪，氟哌啶醇，雙氫氯噻嗪，氫氟甲噻嗪，鹽酸羥嗪，布洛芬，鹽酸丙咪嗪，吲達帕胺，吲哚-2-羧酸，消炎痛，異丙托溴銨，酮洛芬，酮咯酸氨丁三醇，鹽酸馬普替林，甲氯滅酸，褪黑素，二甲雙胍，鹽酸美沙吡林，甲巰咪唑，美索巴莫，鹽酸甲氧氯普胺，甲硝唑，萘丁美酮，萘普生，溴化新斯的明，煙酸，鹽酸尼卡地平，硝苯吡唆，呋喃妥英，尼扎替丁，炔諾酮，去甲替林，鹽酸鄰甲苯海明，奧昔布寧，鹽酸苯乙雙胍，苯基丁氮酮，苯妥英，吡羅昔康，強的松，丙磺舒，鹽酸心得安，溴吡斯的明，鹽酸雷尼替丁，安體舒通，磺胺甲氧噠嗪(sulfameth)，止嘔靈，替諾昔康，特非那定，茶堿，鹽酸噻氯匹定，甲磺氮卓脲，妥拉唑林，甲糖寧，托滅酸，鹽酸曲馬多，反苯環(huán)丙胺，鹽酸曲唑酮，氨苯蝶啶，三氯噻嗪，鹽酸芐吡二胺，維拉帕米，殺鼠靈)一起注入巨噬細胞內。激酶抑制劑中有11種備選物質、磷酸酶抑制劑中有1種備選物質、前體藥物中有14種備選物質抑制由細胞外小泡引發(fā)的IL-6分泌。
評估了上述備選藥物對體內IL-6分泌的效果，結果表明，在將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡5 μ g注入老鼠腹腔誘發(fā)全身性免疫反應的老鼠模型中，當與上述備選藥物一起注入腹腔時，由細胞外小泡導致增加的血清內IL-6的量減少了。這說明，利用本發(fā)明的方法可以有效地篩選炎癥性疾病治療劑的備選藥物。
作為針對細菌感染的防御機制，T細胞免疫反應與B細胞中生成的抗體反應是非常生要的。針對細菌的抗體大致可分為針對LPS等非蛋白成份的抗體和針對蛋白成份的抗體，對于前者來說，其生成不受T細胞的影響，與此相反，對于后者來說，其生成卻受T細胞的影響。T細胞免疫反應根據細胞因子的分泌情況可以分為分泌γ干擾素(IFN-g)的 Thl，分泌IL-17的Thl7，分泌IL-4/IL-5/IL-13等的Th2細胞。其中，對細菌的防御重要的是Thl及Thl7免疫反應。源于細菌的細胞外小泡上不僅含有細菌攜帶的多種蛋白質，而且還有促使免疫反應的免疫增強劑，因此，可以將其作為針對細菌的疫苗。在本發(fā)明中，評估了注入源于腸道共生細菌的細胞外小泡時是否能誘發(fā)針對細菌的免疫反應。為此，將源于大腸桿菌(EC)及肺炎克雷伯菌(KP)的細胞外小泡按間隔1周的頻率分3次注入腹腔并對免疫反應進行了評估。結果表明，在注入細胞外小泡的情況下，針對細菌特異蛋白的抗體隨著注入次數的增加而增加，受各細菌中存在的蛋白質的影響，T細胞分泌γ干擾素和 IL-17的能力明顯增強。這意味著，如果注入源于腸道共生細菌的細胞外小泡，不僅能誘導針對分泌小泡的細菌蛋白的抗體的形成，而且還能夠誘導蛋白特異Thl及Thl7免疫反應， 從而就可以有效地預防或者治療由細菌感染及細胞外小泡引發(fā)的疾病。
實際上，通過事先注入小泡疫苗誘導免疫反應，并評估了其是否對細菌感染及細胞外小泡引發(fā)的疾病發(fā)生有預防效果。為此，將腸道共生細菌即大腸桿菌和肺炎克雷伯菌注入腹腔構建敗血癥動物模型，在將上述細菌注入腹腔前分別利用源于大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的細胞外小泡誘導免疫反應。利用小泡疫苗誘導免疫反應后，分別將大腸桿菌和肺炎克雷伯菌注入腹腔，評估疫苗對因敗血癥導致死亡率發(fā)生所產生的效果。結果表明，當分別注入源于大腸桿菌和肺炎克雷伯菌大腸桿菌的小泡疫苗時，有效地抑制了因大腸桿菌和肺炎克雷伯菌感染引發(fā)的敗血癥而導致的死亡率。另外，當注入源于大腸桿菌的小泡疫苗時，源于大腸桿菌的細胞外小泡流入血管，顯著減少了血液中分泌的IL-6量。這意味著，如果將源于腸道共生細菌的細胞外小泡作為疫苗誘導免疫反應，不僅能夠有效預防腸道共生細菌感染，而且還能夠有效預防源于細菌的細胞外小泡引發(fā)的疾病。
如上所述，源于腸道共生細菌的細胞外小泡可以誘發(fā)各種疾病的發(fā)生，這意味著， 源于腸道共生細菌的細胞外小泡對于病因不明的疾病發(fā)生而言是重要的致病因子。為了提供診斷疾病致病因子的方法，進行了確認源于腸道共生細菌的細胞外小泡中是否存在遺傳物質的實驗，結果表明，存在16S rRNA。就源于老鼠大便的細胞外小泡而言，確認了棲息于大便中具有代表性的10種細菌中存在大腸桿菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae)的遺傳物質。同時，將源于腸道共生細菌的細胞外小泡注入老鼠腹腔的結果表明，老鼠的各種臟器及小便、血液中存在細胞外小泡蛋白質。這樣，通過確認容易提取的小便、大便及血液中是否存在遺傳物質及細胞外小泡蛋白質而提供了一種能夠有效診斷疾病致病因子的方法。
下面，為了有助于對本發(fā)明的理解，將提供理想的實施例。但是，以下實施例僅用于使受眾能夠更加容易地理解本發(fā)明，本發(fā)明的內容不能限定于以下實施例。實施例
棚列1.俯MlH綠鼠1#樹胃_胞』夕卜/丨、泡麵_會目為了分離源于老鼠大便的細胞外小泡，將通過5周齡雄性C57BL/6老鼠獲得的大便25g放入生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS) 2 L中，在4°C的條件下懸浮 (resuspension) 16小時。將這種懸浮液在4°C, 10，000Xg的條件下離心分離20分鐘，然后，取上層液通過帶有0.45 mm大小孔的過濾器過濾。然后，將除去細菌的過濾液使用安裝有能夠除去分子量低于100 kDa的蛋白質的薄膜(membrane)的超濾系統(Quidtand Benchtop System)大約濃縮30倍至70 ml。然后，將濃縮液再次在4°C，10,000 X g的條件下離心分離20分鐘取上層液。將這種上層液放入裝有0. 5 ml的2. 5 M蔗糖溶液(2. 5 M sucrose/20 mM HEPES/150 mM NaCl，ρΗ7· 4)和 1 ml 的 0.8 M蔗糖溶液(0. 8 M sucrose/20 mM HEPES/150 mM NaCl, pH7. 4)的超速離心管(ultracentrifuge tube)中，在 4°C，100， OOOXg的條件下超速離心分離4小時，然后，取位于2. 5 M與0. 8 M蔗糖溶液之間的包含細胞外小泡的層。將其利用PBS稀釋10倍后，再將其放入裝有0. 15 ml的2. 5 M蔗糖溶液和0. 35 ml的0.8 M蔗糖溶液的超速離心管中，在4°C，200，000 X g的條件下超速離心分離 2小時。然后，取位于2.5 M與0.8 M蔗糖溶液之間的包含細胞外小泡的層，并利用PBS將其稀釋10倍后，在4°C，150，000Xg的條件下超速離心分離3小時使其沉淀。然后，將沉淀物放入2. 2 ml的50%密度梯度(Optipr印)溶液中懸浮，將其放入超速離心管后，在其上面依次裝入2 ml的40%密度梯度溶液和0.8 ml的10%密度梯度溶液。然后，在4°C，200， OOOXg的條件下超速離心分離2小時，在40%密度梯度溶液與10%密度梯度溶液之間的層中取得細胞外小泡。
為了對源于老鼠大便的細胞外小泡的蛋白質組進行分析，采用溶液狀態(tài) (in-solution)胰蛋白酶蛋白分解方法。將從老鼠大便中通過上述實施例的方法分離的細胞外小泡50 mg溶于分解液(7 M尿素，2 M硫脲，100 mM NH4HCO3)中后，利用10 mM DTT 在60°C的條件下使其還原(reduction) 45分鐘。之后，將樣本在常溫下冷卻后，放入55 mM碘乙酰胺(iodoacetamide)，蔽光并在常溫下使蛋白質烷化(alkylatiOn)30分鐘。然后，利用10 的胰蛋白酶處理，并通過超聲處理(sonication)提高胰蛋白酶的活性，然后，在37°C的條件下使其反應12小時。然后，將降解的肽利用游離膠分餾系統(0FFGEL fractionators system， Agilent) iiiiii^。24 cm 白勺 IPG 月交#r(IPG strip) (pH 3-10)利用IPG再水化(IPG-rehydration)緩沖液使其進行水合反應。再將分解的肽溶于2. 8 ml的游離膠(off-gel)緩沖液中，將其中的150 裝入一個泳道(lane)內，然后， 利用50 mA 8000 V的電壓電泳40小時使肽根據各自的等電點(pi)分離。將分離后獲得的樣本利用P印Clean C18 spin column進行脫鹽(desalting)處理。
通過納米離子質量分析(Nano-LC-ESI-MS/MQ進行質量分析，將通過溶解 (in-solution)降解法準備的源于老鼠大便的細胞外小泡的降解肽裝入用5 mm大小的C18 樹脂(resin)填充的管柱(75 mm χ 12 cm)中，然后，再采用下述方法進行分離3-40% 緩沖液B 70分；血流速度0.3 ml/min (緩沖液A組成0.1%甲酸H2O，緩沖液B組成0.1%甲酸乙腈)。將分離的肽利用LTQ-ion-trap質量分析儀(Thermo Finnigan) 進行分析。離子化電噴射(electrospary)的電壓為1.9 kV，按照35%的歸一化碰撞能量 (normalized collision energy) K牛 ^iMfiiti (MS/MS) 。 Μ*白勺Mi普(spectrum])都通過數據依賴(data-d印endent)掃描(scan)獲得。LTQ參數(parameter)在全質譜聯用掃描(full MS scan)中選取5個最高質譜(most abundant spectrum)進行分裂 (fragmentation),動態(tài)排除(dynamic exclusion)的重復數(repeat count)為 1，重復時 |1] (repeat duration) % 301 (dynamic exclusion duration) % 180排除質量寬度(exclusion mass width)為1. 5 Da，動態(tài)排除的列表大小(list size)設定為50。
為了對棲息在源于老鼠腸細胞的細胞外小泡中的蛋白質進行分析，利用現有構建氨基酸堿基序列的老鼠數據庫(Uniprot)，同時，為了對棲息在源于腸道細菌的細胞外小泡內的蛋白質進行分析，利用代表存在于腸道內的多數種屬(genus)的10種(species)細菌數據庫(Uniprot)。分別利用上述各種數據庫總共進行了 11次數據分析。利用MASCOT蛋白分析搜索引擎version 2. 2 (http //www. matrixscience. com)對通過質量分析獲得的所有質譜(MS質譜和MS/MS質譜)進行了分析。通過對分析的驗證，篩選出了候選肽/ 候選蛋白質(P印tide prophet/protein prophet)95%/99%以上可靠性高的蛋白質，在各自的蛋白質中斷定的肽為一個的質譜是直接進行氨基酸序列分析(manual validation), 從而提高其可靠性。
圖1是利用上述方法對存在于老鼠大便中的細胞外小泡的蛋白質組進行分析的示意圖。從圖中可以看出，總共295個蛋白質中有222個是源于細菌的蛋白質，其中，源于革蘭氏陰性細菌的蛋白質有77個，源于革蘭氏陽性細菌的蛋白質有145個。對于革蘭氏陰性細菌來說，源于多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron),大腸桿菌K-12，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia )的蛋白質構成主要部分，對于革蘭氏陽性細菌來說，源于產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，羅伊氏乳酸桿菌(Lactibacillus reuteri)的蛋白質構成主要部分。
實施例2. IH常及疾病狀態(tài)的老鼠小腸液分泌由細胞外小泡誘發(fā)的炎癥性媒介為了從由正常及DSS誘發(fā)的炎癥性腸炎老鼠小腸液中分離出細胞外小泡，將老鼠解剖摘出小腸。將摘出的小腸除去淋巴結(peyer、patch)和脂質(lipid)后，將小腸按約 5 cm的長度切斷，橫向切開，用生理鹽水灌洗，除去小腸內的雜質。將除去雜質的小腸切成1 cm大小的方塊，放入30 ml的生理鹽水中，用旋渦(vortex)在5秒內進行5次渦流 (vortexing)。將小腸組織及雜質通過離心分離除去，將上層液通過超速離心分離獲得細胞外小泡。
圖2是將利用上述方法分離的細胞外小泡通過透射式電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察看到大致形狀和大小的示意圖，可以看到約為100 nm大小的球狀細胞外小泡。
圖3及圖4是為了對從由正常及DSS引發(fā)的炎癥性腸炎老鼠小腸液中分離的細胞外小泡誘導的炎癥性媒介即IL-6的分泌能力進行評估而將多種濃度的細胞外小泡注入老鼠巨噬細胞(RAW沈4. 7)進行處理的示意圖。結果通過酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法確認，從正常老鼠中分離的細胞外小泡不能誘導IL_6 表達，但是，從由DSS引發(fā)的炎癥性腸炎老鼠小腸中分離的細胞外小泡卻能夠利用劑量依賴性誘導IL-6的表達。
圖5是評估從由DSS引發(fā)的炎癥性腸炎老鼠中分離的細胞外小泡中是否含有源于革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡的示意圖。結果表明，當將抵抗革蘭氏陰性細菌的細胞外膜構成成份即LPS的多粘菌素b (polymyxin B)注入從由DSS引發(fā)的炎癥性腸炎老鼠中分離的細胞外小泡內處理時，由存在于疾病狀態(tài)的小腸液中的細胞外小泡誘發(fā)的IL-6分泌被抑制。
上述結果表明，源于棲息在腸道的革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡對炎癥性腸道疾病的發(fā)生發(fā)揮著重要作用。
^MM 3.源干從CLP PHr血癥云M勿I草型的目復fl豹夜中分離的腸i首共牛細菌即大腸桿菌的細胞外小泡的特件分析用18計量(gauge)注射器針頭對1只C57BL/6 (雄性，6周)老鼠的盲腸末端扎2次實施 CLP (ceacal ligation and puncture)手術。40 小時后，將 PBS 3 ml 利用 5 ml 注射器注入老鼠腹腔，充分混合后，再從腹腔回收1 ml，將其中10 μ 與LB (Luria Bertani) 溶液90 μ 1相混合后，稀釋10，000倍，將其涂抹于LB瓊指平板(Agar plate)上，放入 37° C培養(yǎng)器(inciAator)中培養(yǎng)8小時。從多個菌落(colonoy)中選取一個放入裝有5 ml LB溶液的試管內，再放入37° C培養(yǎng)器中培養(yǎng)8小時。然后，將其中10 μ 1與LB溶液90 μ 1相混合，稀釋10，000倍，涂抹于LB瓊指平板上，再放入37° C培養(yǎng)器中培養(yǎng)8 小時。再按照與上述相同的方法再執(zhí)行一次對上述菌落的選取(Picking)過程，最終獲得一個菌落并提取出腸道大腸桿菌。
圖6是對提取的腸道大腸桿菌的16S rRNA進行分析的示意圖，鑒定出其屬于 E. coli C4，這是能從人類大便中觀察到的共生細菌。
圖7及圖8是分別將提取的老鼠腸道大腸桿菌通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)禾口透身寸式電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察的示意圖，可以看到其表面分泌有30 nm大小的細胞外小泡。
將腸道大腸桿菌放入裝有3 ml LB溶液的試管內，在37° C的條件下培養(yǎng)4小時，然后，將其中的每10 μ 1分別移入8個裝有500 ml LB溶液的2L三角燒瓶中，在 37° C的條件下培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)液分裝入12個350 ml容量高速離心管內，在4° C， 5,000 χ g的條件下超速離心分離15分鐘，連續(xù)執(zhí)行2次。將4 L左右的上層液通過帶有 0. 45 μ m大小孔的薄膜過濾器(membrane filter)進行1次過濾，然后，利用僅能讓分子量小于100 kDa的分子通過的超濾系統(Quixstand system)將其濃縮至300 ml，。將濃縮液通過帶有0.22 μ m大小孔的薄膜過濾器進行1次過濾，然后，再分裝入50 ml容量的高速離心管(ultracentrifuge tube)內，在4° C，150,000 χ g的條件下超速離心分離 (ultracetrifugati0n)3小時。去掉上層液，將利用PBS溶解沉淀在試管下部的沉淀物，從而提取出源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡。
圖9是將對源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡的形狀和大小通過透射式電子顯微鏡 (transmission electron microscope, TEM)進行分析的示意圖，可以看出，細胞外小泡由雙層脂質構成，大小為20-100 nm，大致成球狀。
圖10是以10張細胞外小泡的透射式電子顯微鏡照片為基礎按細胞外小泡大小分布的示意圖，可以看出，20-40 nm大小的細胞外小泡占了整體的一半。
實施例4.由源于大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的體外(in vitro)炎癥性媒介分M將1 χ IO5個老鼠巨噬細胞(RAW 264. 7)分別播種(seeding)在24孔板上，M小時后將利用細胞外小泡(0. 1,1,10,100,1000 ng/ml)或者苯酚(phenol)，使從腸道大腸桿菌提取的LPS (100,200, 500,1000,2000 ng/ml)注入細胞進行處理，然后，再放入37° C 培養(yǎng)器中進行培養(yǎng)。15小時后，取其上層液，在4° C, 500 χ g的條件下離心分離10分鐘， 然后，再在4° C, 3000 χ g的條件下離心分離20分鐘。對分離的上層液中含有的細胞因子量通過ELISA方法進行測定。
圖11及圖12是顯示細胞因子量的示意圖，可以看出，炎癥性媒介即TNF-α (參照圖ll)，IL-6 (參照圖12)與細胞外小泡的量成比例增加。另外，與對LPS單獨進行處理的情況相比，更少量的細胞外小泡也能誘導上述炎癥性媒介的分泌。這意味著，源于腸道共生細菌的細胞外小泡作用于炎癥細胞，即使在很低的濃度下也能夠誘導炎癥性媒介的分泌。
實施例5.局部灃入源于大腸桿菌的細胞外小泡而誘發(fā)的粘膜炎癥及IL-6分泌準備C57BL/6 (雌性，6周)老鼠實驗群和對照群各5只，對屬于實驗群的老鼠將源于大腸桿菌的細胞外小泡1，10，100 ng注入鼻腔。注入后分別間隔6小時、24小時測定其呼吸道粘膜的炎癥。將氯胺酮(ketamine)與甲苯噻嗪(xylazine)混合構成的麻醉液注入老鼠腹腔進行麻醉后，切開胸部，露出氣管，將尿管插入氣管內并進行結扎。將PBS每次按 1 ml注入2次，對氣管進行灌洗，獲得支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage, BAL fluid)。將支氣管肺泡灌洗液在4°C的條件下按3，000 rpm的離心分離10分鐘后，將細胞團(cell pellet)溶于PBS溶液中。將上述細胞團通過光學顯微鏡觀察可以獲得細胞數量。另外，利用ELISA方法對支氣管肺泡灌洗液中誘導Thl7免疫反應的炎癥性媒介即IL-6 進行測定。
圖13是將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入鼻腔后分別間隔6小時和M小時通過支氣管肺泡灌洗液內炎癥細胞的數量顯示呼吸道粘膜的炎癥的示意圖，可以看出，與注入源于大腸桿菌的細胞外小泡之前相比，注入細胞外小泡間隔6小時和M小時后支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數量顯著增加，這與注入的細胞外小泡的濃度有關。
圖14是對支氣管肺泡灌洗液內IL-6的量通過ELISA方法進行測定的示意圖，可以看出，與注入源于大腸桿菌的細胞外小泡之前相比，注入細胞外小泡6小時后支氣管肺泡灌洗液內IL-6的量顯著增加，這與注入的小泡的濃度有關。
從上述結果可以看出，源于腸道共生細菌的細胞外小泡通過局部作用誘導粘膜發(fā)生炎癥，其特征在于，誘導Thl7免疫反應。
實施例6.將源于大腸桿菌的細胞外小泡按大用量注入腹腔誘發(fā)的敗血癥將通過實施例3所述方法分離的細胞外小泡對C57BL/6 (雄性，6周)老鼠20只分別按15，25，50 μ g的量一次注入腹腔，并每隔12小時確認老鼠的死亡數量。
圖15是顯示在細胞外小泡作用下老鼠生存曲線的示意圖，可以看出，將25 yg以上的細胞外小泡注入腹腔內就會導致95%的老鼠死亡。
為了評估細胞外小泡誘發(fā)敗血癥的情況，將通過實施例3所述方法分離的源于老鼠腸道大腸桿菌的細胞外小泡(5 yg)以每隔12小時分3次注入腹腔，然后，分析與敗血癥相關的指標。注射細胞外小泡后分別間隔6，12二4小時從老鼠的心臟提取血液，在4° C， 3,500 χ g的條件下離心分離10分鐘后，取上層液即血清。
圖16是對血清中與敗血癥發(fā)生相關的媒介的量通過ELISA方法進行測定的示意圖，可以看出，TNF-α，IL-6, IL-I β，IL-12，IFN- y , IL-10，IL-17 等均增加了。
另夕卜，敗血癥的特征即全身性炎癥反應(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)可以通過呼吸頻率、溫度、體重、白血球的數量等指標進行評估。
圖17是注射細胞外小泡(5 μ g)后每隔M小時測定呼吸頻率的示意圖，可以看出，呼吸頻率可以通過將老鼠放入試驗裝置(chamber)內使用噴霧器(nebulizer) 3分鐘獲得f (呼吸頻率)值而進行測定。結果觀察到，出現了在細胞外小泡的作用下反映SIRS 的指標之一即呼吸頻率增加的現象(呼吸急促)。
圖18是注射細胞外小泡(5 μ g)后在3日內每間隔8小時測定體溫的示意圖，可以看出，體溫可以通過將直腸體溫計插入老鼠的肛門測定并記錄體溫計數字畫面上顯示的數值。結果觀察到，出現了在細胞外小泡的作用下反映全身性炎癥反應的指標即體溫降低的現象(低溫癥)。
圖19是注射細胞外小泡(5 μ g)后分別間隔6，12，24小時測定白血球數量的示意圖，可以看出，白血球數量可以通過以下方法測定從心臟提取血液后放入裝有乙二胺四乙酸(EDTA)的試管內在4° C的環(huán)境下保管，將其中的10 μ 1血與90 μ 1的1%鹽酸 (HCl)相混合，放于25° C的條件下反應6分鐘，再通過血球計數器(hematoctometer)測定反應液中所含白血球的數量。結果觀察到，出現了在細胞外小泡的作用下反映全身性炎癥反應的指標即血液內白血球數量減少的白血球減少癥(leucopenia)。
圖20是注射細胞外小泡(5 μ g)后間隔12小時測定總白血球數量和各自白血球數量的示意圖，可以看出，注射細胞外小泡后間隔12小時從心臟提取血液放入裝有乙二胺四乙酸的試管內在4° C的環(huán)境下保管，將血液10 μ 1涂抹在載玻片上實施迪芙-奎克 (Diff Quick)染色，在光學顯微鏡1000倍視野內可以觀察到300個以上的炎癥細胞，包括嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞，從而可以對各種炎癥細胞的數量進行測定。結果觀察到，總白血球數量減少，特別是淋巴細胞數量明顯減少，相反，中性粒細胞數量卻反而增加。為了評估細胞外小泡是否誘發(fā)重癥敗血癥而測定了血壓。
圖21是注射細胞外小泡(5 μ g)后每間隔對小時測定血壓的示意圖，可以看出， 將老鼠放在試驗臺(platform)上后，尾巴的血壓可以通過傳感器(sensor)識別并對向計算機界面輸出的血壓數值進行分析。結果觀察到，在細胞外小泡的作用下血壓顯著降低。
從以上結果可以看出，當源于大腸桿菌等腸道共生細菌的細胞外小泡流入血管時，細胞外小泡就是誘發(fā)敗血癥的重要致病因子。
實施例7.將源于大腸桿菌的細胞外小泡按大用量注入腹腔誘發(fā)的血液凝固對在患重癥敗血癥的情況下觀察到的血液凝固現象是否由細胞外小泡誘發(fā)進行了分析。結果表明，如果發(fā)生彌散性血管內凝血，則血小板減少，D- 二聚體的量增加。
圖22是注射細胞外小泡(5 Pg)后分別間隔6，12二4小時測定D-二聚體量的示意圖，可以看出，將細胞外小泡注入腹腔后分別間隔6，12二4小時從心臟采血，將其放入裝有檸檬酸鈉(sodium citrate)的試管內在4°C的環(huán)境下保管。然后，再通過ELISA方法測定血液中D-二聚體的量。結果表明，間隔12小時后D-二聚體的量增加最多。
另外，為了測定血小板的數量，將細胞外小泡注入腹腔后分別間隔6，12,24小時從心臟采血，放入裝有乙二胺四乙酸的試管在4° C的環(huán)境下保管。將血液與1%草酸銨(ammonium oxalate)按1/200稀釋后在濕板上反應10分鐘，再通過血球計數器測定血小板的數量。圖23是注入細胞外小泡間隔6小時后開始顯示彌散性血管內凝血的指標即血小板減少情況的示意圖。
上述結果表明，當源于腸道共生細菌的細胞外小泡被血管吸收時，發(fā)生彌散性血管內凝血，這意味著，源于腸道共生細菌的細胞外小泡是重要的血液凝固的致病因子。
實施例8.由源于大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的血管內皮細胞激活及促凝血物質(procoaRulant molecule)表達為了評估由源于腸道共棲大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的血管內皮細胞激活，將帶有5 χ IO5 細胞數的血管內皮細胞(HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)播種 (seeding)在6孔板上，間隔M小時后，將細胞外小泡(0. 1,1,5,10,20 ng/ml)注入細胞進行處理，放入37° C培養(yǎng)器內培養(yǎng)。8小時后除去培養(yǎng)液，利用PBS灌洗1次后，對細胞裂解(lysis)溶液進行處理，進行10分鐘培養(yǎng)后，在4° C, 13,000 χ rpm的條件下離心分離10分鐘，從而獲得細胞整體蛋白。將其與切荷載染色劑(荷載染料，250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 0. 5%溴酚藍，50%甘油)混合最終變成lx，在100° C的條件下處理10分鐘。準備10%聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)，加載樣本。在100 V的條件下電泳2小時，然后，在300 mA的條件下于2小時內將蛋白質通過PVDF (polyvinylidene fluoride) 薄膜進行轉移(transfer)。將脫脂乳(Skim milk)溶于PBS變成3%，將薄膜在上述溶液中進行2小時模塊化(blocking)處理。將ICAM-I與β -肌動蛋白(β actin)抗體在 4°C的條件下處理12小時。利用0. 05%吐溫20/PBS灌洗3次后，分別將粘有過氧化物酶 (peroxidase)的二次抗體在室溫下處理1小時。利用0. 05%吐溫20/PBS灌洗30分鐘后， 通過 ECL (enhanced chemiluminescence, Amersham Co. No. RPN2106)基質(substrate)進行確認，在對細胞外小泡進行處理的情況下，根據劑量依賴性從細胞整體蛋白標準看，確認 β -肌動蛋白對比ICAM-I增加了。ICAM-I作為免疫細胞附著蛋白，當各種免疫反應的發(fā)生及冠狀動脈疾病等血管內皮細胞激活時，它在血管內皮細胞內就會增加，并滲透到免疫細胞的組織內。
通過圖M可以確認，在細胞外小泡的作用下血管內皮細胞被激活，且ICAM-I會增加。
為了評估源于腸道共棲大腸桿菌的細胞外小泡是否誘導促凝血物質，將有5 χ IO5 細胞數的血管內皮細胞(HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)播種 (seeding)在6孔板上，間隔24小時后，將細胞外小泡(1 ng/ml)注入細胞進行處理，放入 37° C培養(yǎng)器中培養(yǎng)。12小時后，取上層液，在4° C, 500 χ g的條件下離心分離10分鐘后，再在4° C, 3000 χ g的條件下離心分離20分鐘。為了測定分離的上層液含有的促凝血物質即組織因子，在ELISA板上放上層液100 μ ，在4° C的條件下于12小時內進行涂層處理，然后，將組織因子抗體在室溫下處理2小時。利用0.05%吐溫20/PBS灌洗3次后， 將粘有過氧化物酶(peroxidase)的二次抗體在室溫下處理1小時。利用0. 05%吐溫20/ PBS Ml^n 30 ^vItB, fflil ECL (enhanced chemi luminescence, Amersham Co. No. RPN2106) 基質(substrate)進行確認，如圖25所示，在對細胞外小泡進行處理的情況下，促凝血物質即組織因子的分泌顯著增加了。
實施例9.將源于大腸桿菌的細胞外小泡桉大用量灃入誘發(fā)的肺炎及肺氣腫將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡(10 μ g)利用花青苷-7 (cyanin-7, cy7)染色后，注入老鼠的腹腔內，6小時后，利用能夠對老鼠全身進行分析的柯達影像(Kodak image station)系統確認源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡的位置。圖沈是通過老鼠熒光照片顯示細胞外小泡遍布全身并滲透到肺部的示意圖。
將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡(10，20 μ g)利用DiO染色后注入老鼠的腹腔，6小時后提取血液與肺。
圖27是利用RBC (red blood cell)裂解緩沖液除去上述血液和肺中的紅細胞后，通過熒光激活細胞分選儀(FACQ對包含細胞外小泡的血液細胞與肺組織細胞的比率進行分析的示意圖。結果，可以看到，帶有熒光細胞的比率增加了。這意味著，如圖26所示， 細胞外小泡遍布包含肺在內的全身，這意味著細胞外小泡被細胞吸收后就向其周圍擴散。
為了對肺部炎癥反應進行分析，注射細胞外小泡(5 μ g)后分別間隔6，12二4小時后摘出老鼠的肺，稱重后放入65°C培養(yǎng)器中放置48小時，然后，通過對與變化后的肺的濕/干重比值(wet-to-dry ratio)進行分析從而對肺炎情況進行評估。
圖觀是顯示反映肺炎的指標即濕/干重比值的示意圖，將細胞外小泡注入腹腔后間隔6小時后觀察肺炎發(fā)生情況。
另外，注入細胞外小泡(5 μ g)后分別間隔6，12二4小時提取老鼠的支氣管肺泡灌洗液測定炎癥細胞數量。將含有氯胺酮(ketamin)的麻醉液注入老鼠腹腔進行麻醉后， 切開胸部露出氣管，將尿管插入氣管并進行結扎。將PBS按每次注入1 ml注射2次，對氣管進行灌洗，獲得支氣管肺泡灌洗液。將支氣管肺泡灌洗液在4° C, 3000 rpm的條件下離心分離10分鐘，然后，將沉淀的細胞溶于PBS中，測定細胞數量。利用光學顯微鏡測定總炎癥細胞數量后，將沉淀的細胞利用細胞離心涂片機(cytospin)進行離心分離后涂抹于載玻片上實施迪芙-奎克染色，在光學顯微鏡1000倍視野內可以觀察到300個以上的炎癥細胞，包括巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞，且分別對各種炎癥細胞數量進行測定。
圖四是顯示支氣管肺泡灌洗液內炎癥細胞數量的函數圖，可以看出，在細胞外小泡的作用下炎癥細胞數量增加，特別是巨噬細胞數量顯著增加。
注射細胞外小泡(5 μ g)后分別間隔6，12，24小時摘出肺放入4%甲醛(formaldehyde)中并進行固定(fixing)，然后，制作切片，利用蘇木精-伊紅 (hematoxylin-eosin)進行染色，通過光學顯微鏡觀察到的圖像如圖30所示?？梢钥吹剑诩毎庑∨莸淖饔孟路闻荼伙@著破壞。這意味著，在源于腸道共生細菌的細胞外小泡的作用下同時發(fā)生肺炎和肺氣腫。
上述結果顯示，源于腸道共生細菌的細胞外小泡通過血管分布在多個臟器同時誘發(fā)炎癥和組織損傷，這意味著，作為病因不明的炎癥疾病的致病因子，源于腸道共生細菌的細胞外小泡非常重要。
實施例10.將源于大腸桿菌的細胞外小泡長時間桉低用量灃入腹腔誘發(fā)的高血壓及骨質疏松癥為了評估將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡按低用量反復顯現時是否會誘發(fā)慢性疾病，將細胞外小泡(0. 1,1 μ g)按每1周向腹腔注射2次共注射18周。
圖31是將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡反復顯現時顯示血壓變化的示意圖， 可以看出，在細胞外小泡的作用下出現了高血壓。為了評估將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡按低用量反復顯現時是否會誘發(fā)骨質疏松癥，將細胞外小泡(1 Ug)按每1周向腹腔注射2次共注射18周后，從老鼠的腿部提取長骨(long bone)，于固定液中固定一整天，將放入固定液中的長骨用鹽水清洗2次后，將其依次放入30，50，70，90，100%乙醇中脫水1小時。將經脫水處理的長骨放入一種被稱作“環(huán)氧丙烷(propylene oxide) ”的置換液中浸泡1小時共實施2次，準備實施其與聚合物的置換。置換液與聚合物的比例按3:1，1:1，1:3的順序逐漸升高，實施其與聚合物的置換。最后，將剩下的置換液放于防護罩上置于空氣中而散發(fā)，使骨頭浸在僅由聚合物構成的溶液中，在65°C烤箱中進行一天的聚合過程。骨頭樣本的X線斷層(X-RAY tomogrpahy) 圖像全都是通過浦項加速器7B2光束線(7B2 beamline at Pohang Light Source, PLS) 的同步輻射X射線顯微鏡(Synchroton radiation X-ray microscopy)獲得的。將內置聚合物(polymer embedding)的骨頭放于放射光X射線顯微鏡的樣本鏡臺上后，通過180°旋轉就可以獲得全部1200張圖像。樣本鏡臺與閃爍體(scintillator)間的距離為10 cm, 圖像主要是利用放射光X射線顯微鏡的吸收對比效果(absorption contrast effect)獲得的。將獲得的圖像通過Octopus和Amira程序作成3維圖像(3D reconstruction)，對 1200張中有代表性的剖面圖像(tomographic slice image)進行比較。圖32是顯示將細胞外小泡長時間按低用量注入而誘發(fā)的以破壞骨頭的連接構成為特征的骨質疏松癥示意圖。上述結果表明，當源于腸道共生細菌的細胞外小泡長時間反復被血管吸收并向全身分布時，就會誘發(fā)高血壓、骨質疏松癥等慢性疾病。實施例11. IL-6對由源于大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的敗血癥及肺氣腫的發(fā)生所起的作用
將通過實施例3所述方法分離的源于老鼠腸道大腸桿菌的細胞外小泡05 μ g)分別向正常老鼠(C57BL/6，雄性6周)和IL-6缺乏(knock out)老鼠(C57BL/6，雄性，6周) 的腹腔注射1次，每隔12小時確認死亡老鼠的數量，其存活率如圖33所示?？梢钥闯?，IL-6 缺乏老鼠與正常老鼠不同，在25 μ g細胞外小泡的作用下，不會誘發(fā)死亡。將細胞外小泡(5 μ g)在12小時內注射3次，分別間隔6，12，24小時后將肺摘出，通過實施例9所述方法對肺的病理變化進行分析。圖34是肺切片的照片，可以看出，與正常老鼠不同，在細胞外小泡的作用下IL-6缺乏老鼠的肺組織細胞完全未被破壞。上述結果表明，不僅對于由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)的敗血癥發(fā)生， 而且對于其誘發(fā)的多個臟器上發(fā)生的炎癥疾病而言，IL-6都是非常重要的媒介。實施例12.預防或治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)疾病的備選藥物體外(in vitro)篩選系統的構建
基于以上述實施例，確認由源于老鼠腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)的炎癥性細胞因子在很大程度上對各種疾病產生了影響。這意味著，發(fā)掘炎癥性媒介，特別是能夠抑制IL-6 分泌的物質，對于篩選用于預防或治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)疾病的備選藥物非常重要。圖35是發(fā)掘抑制由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)的IL-6分泌的物質的模式圖，可以看出，將通過實施例3所述方法分離的源于腸道共生細菌即大腸桿菌的細胞外小泡(100 ng/ml)單獨或者與藥物備選物質(10 μ M) 一起注入按實施例4所述準備的老鼠巨噬細胞(RAW 264. 7)進行處理后，放入37° C培養(yǎng)器中培養(yǎng)15小時。15小時后，取上層液，在4° C，500 χ g的條件下離心分離10分鐘，再在4° C，3000 χ g的條件下離心分離20分鐘。通過ELISA方法測定分離的上層液中所含的IL-6量。這樣，就可以構建在體外(in vitro)篩選抑制由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)的IL-6分泌的備選物質的方法，從而就可以提供用于預防或治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)疾病的備選藥物。實施例13.通過體外(In vitro)篩詵系統發(fā)掘的激酶抑制劑的體外(in vitro) 消炎效果
按照實施例12所述方法，分別將僅用培養(yǎng)液對老鼠巨噬細胞(RAW沈4.7)處理的群(陰性對照群)、僅將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡(0. 1 /ml)混入培養(yǎng)液中進行處理的群(陽性對照群)，以及80種激酶抑制劑((激酶抑制劑庫，BIOMOL No. 2832: PD-98059, U-0126, SB-203580, H_7，H_9，AG-494，AG-825，灰薰草菌素 A, RG-14620，酪氨酸磷酸化抑制劑23，酪氨酸磷酸化抑制劑25，酪氨酸磷酸化抑制劑46，酪氨酸磷酸化抑制劑47，酪氨酸磷酸化抑制劑51，酪氨酸磷酸化抑制劑1，酪氨酸磷酸化抑制劑9，酪氨酸磷酸化抑制劑AG 1觀8，酪氨酸磷酸化抑制劑AG 1478，酪氨酸磷酸化抑制劑AG 1295, HNMPA,虎刺醛，白皮杉醇，AG-490, AG-126, AG-370, AG-879，LY 四4002，渥曼青霉素，GF 109203X,金絲桃素，鞘氨醇，H-89，H_8，HA-1004, HA-1077, HDBA, KN-62，KN-93，ML-7， ML-9，2-氨基嘌呤，N9-異丙基-奧羅莫星，奧羅莫星，異奧羅莫星，核抑制劑，LFM-A13， SB-202190, ZM 336372，SU 4312，AG-U96，粗糠柴毒素，染料木黃酮，大豆素，癌基因抑活藥類似物，槲皮素，SU 1498，ZM 449829，DRB (5，6-二氯-l_b_D-呋喃核糖基苯并咪唑)，HBDDE (2,2' ,3,3'，4，4，-六羥基-1，1，-聯苯-6，6，- 二甲醇二甲醚)，靛玉紅，靛玉紅-3，-一B，Y-27632，Kenpaullone，土曲霉酸，BML-257，BML-259，芹菜素，BML-265 (埃羅替尼類似物)，雷怕霉素)各按10 μ M濃度與上述等量的細胞外小泡一起混入培養(yǎng)液中處理以構成實驗所用的群。經過處理15小時后通過夾層(sandwich) ELISA方法對培養(yǎng)液中IL-6的量進行測定。在對各種激酶抑制劑進行處理的情況下，所測定的IL-6量與從陽性對照群中測定的IL-6量相比較獲得的百分比如圖36所示。結果表明，在80余種激酶抑制劑中有11種物質H-7,29; LY294002,31; GF109203X，42; ML-7,43; ML-9,64; ZM449829, 66; DRB (5，6-二氯-l-b-D-呋喃核糖基苯并咪唑)，70;靛玉紅-3，一肟.72; Kenpaullone, 77; BML-259,78;芹菜素)使 IL-6 的量與陽性對照群相比降至50%以下。圖37是在將上述激酶抑制劑中虎刺醛，LY294002, GF109203X單獨或者兩種以上組合(這種情況下，處理的各藥物的濃度保持10 mm)與細胞外小泡(100 ng/ml)同時進行處理的情況下，對細胞培養(yǎng)液內IL-6的量進行測定的示意圖?？梢钥闯觯攲煞N以上同時處理時，IL-6分泌抑制效果顯著增強。實施例14.通過體外(In vitro)篩選系統發(fā)掘的磷酸酶抑制劑的體外(in vitro)消炎效果
36圖38是按實施例13所述方法對30種磷酸酯酶抑制劑(磷酸酯酶抑制劑庫，BIOMOL No. 2834:斑蝥酸，斑蝥素.內氧草索，芐基磷酸，L-P-對溴四咪唑草酸鹽，RK-682， RWJ-60475, RWJ-60475 (AM) 3，鹽酸左旋咪唑，鹽酸四咪唑，氯氰菊酯，溴氰菊酯，氰戊菊酯， 酪氨酸磷酸化抑制劑8，CinnGEL, CinnGEL 2 Me, BN-82002，紫草素，NSC_663^4，環(huán)孢菌素 A，戊烷脒，BVT-948, B4-繞丹寧，BML168，二氧菲(Dioxophenanthrene)，BML-260， PD-144795, BML-267, BML-267酯，OBA，OBA酯，棉酚，阿侖膦酸鈉)進行處理后檢索使 IL-6的量與陽性對照群相比降至50%以下的藥物備選物質并發(fā)掘PD-144795的示意圖。圖39是準備含有濃度分別為0. 1，1，5，10 μ M的PD-144795及含有濃度為100 ng/ml源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡的培養(yǎng)液，按實施例13所述方法注入源于老鼠的巨噬細胞進行處理后根據劑量依賴性確認抑制IL-6分泌的示意圖。實施例15.通過體外(In vitro)篩詵系統發(fā)掘的前體藥物的體內(in vitro)消炎效果
圖40是按實施例13所述方法對100種前體藥物(醋氨酚，乙酰半胱氨酸，別嘌呤醇，鹽酸阿普洛爾，鹽酸阿密替林，阿托品，溴芐乙胺，溴苯那敏，布地奈德，鹽酸丁螺環(huán)酮，頭孢呋辛，水合氯醛，鹽酸氯丙嗪，甲氰咪胍，鹽酸氯米帕明，克霉唑，環(huán)苯扎林，鹽酸地昔帕明，雙氯芬酸，二氟尼柳，地爾硫卓，鹽酸苯海拉明，達舒平，戒酒硫，D-甘露醇，多塞平，強力霉素水物，，琥珀酸多西拉敏依酚氯銨，馬來酸依那普利，法莫替丁，芬布芬，非諾貝特，苯氧布洛芬鈣，氟桂嗪二鹽酸鹽，氟奮乃靜二氯化合物，氟比洛芬，速尿靈，吉非羅齊， 格列齊特，格列吡嗪，氟哌啶醇，雙氫氯噻嗪，氫氟甲噻嗪，鹽酸羥嗪，布洛芬，鹽酸丙咪嗪， 吲達帕胺，吲哚-2-羧酸，消炎痛，異丙托溴銨，酮洛芬，酮咯酸氨丁三醇，鹽酸馬普替林， 甲氯滅酸，褪黑素，二甲雙胍，鹽酸美沙吡林，甲巰咪唑，美索巴莫，鹽酸甲氧氯普胺，甲硝唑，萘丁美酮萘普生，溴化新斯的明，煙酸，鹽酸尼卡地平，硝苯吡啶，呋喃妥英，尼扎替丁， 炔諾酮，去甲替林，鹽酸鄰甲苯海明，奧昔布寧，鹽酸苯乙雙胍，苯基丁氮酮，苯妥英，吡羅昔康，強的松，丙磺舒，鹽酸心得安，溴吡斯的明，鹽酸雷尼替丁，安體舒通，磺胺甲氧噠嗪 (sulfameth)，止嘔靈，，替諾昔康，特非那定，茶堿，鹽酸噻氯匹定，甲磺氮卓脲，妥拉唑林， 甲糖寧，托滅酸，鹽酸曲馬多，反苯環(huán)丙胺，鹽酸曲唑酮，氨苯蝶啶，三氯噻嗪，鹽酸芐吡二胺，維拉帕米，殺鼠靈)進行處理后發(fā)掘出使IL-6的量與陽性對照群相比降至80%以下的備選物質14種(10;阿密替林，39;環(huán)苯扎林，41;地昔帕明，54;多塞平，72;氟奮乃靜二氯化合物，82;氟哌啶醇，89;丙咪嗪，101;馬普替林，132;鄰甲苯海明，165;特非那定，173;托滅酸，179;曲唑酮，187;三氯噻嗪，188;維拉帕米)的示意圖。
圖41是將通過上述體外(in vitro)篩選系統發(fā)掘的14種前體藥物注入源于老鼠腹腔的巨噬細胞內，經體內-體外(ex vivo)處理后確認顯示IL-6減少效果的11種前體藥物(10;阿密替林，39;環(huán)苯扎林，41;地昔帕明，54;多塞平，72;氟奮乃靜二氯化合物，82;氟哌啶醇，89;丙咪嗪，101;馬普替林，132;鄰甲苯海明，165;特非那定，173; 托滅酸，179;鹽酸曲唑酮)的示意圖。實施例16.通過體外(In vitro)篩選系統發(fā)掘的前體藥物的體內(in vivo)消炎效果
對實施例15發(fā)掘的前體藥物是否在體內產生消炎效果進行了評估。為此，先如實施例6所述將源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡5 yg注入C57BL/6老鼠(雄性，6周，每組4只)腹腔構建誘發(fā)敗血癥的老鼠模型，再將上述發(fā)掘的前體藥物中氟哌啶醇和多塞平 (Doxepein)分別按10 mg/kg的用量注入老鼠模型腹腔中，6小時后提取血清。圖42是通過ELISA方法對血清中IL_6的量進行測定的示意圖，可以看出，由源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的炎癥性媒介即IL-6的分泌因向血液內注入通過體外 (in vitro)篩選系統發(fā)掘的氟哌啶醇和多塞平(Dox印ein)而被有效地抑制。
從上述結果可以看出，利用實施例12所述源于腸道共生細菌的細胞外小泡的體外(in vitro)藥物篩選系統是一種非常有效的方法，利用它可以有效地篩選用于預防或治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)的各種疾病的藥物。^MM 17.源干大腸桿菌的細胞,夕M、泡ι瘡苗的免,瘡學特十牛
將按實施例3所述方法分離的源于大腸桿菌的細胞外小泡1 mg每隔1周注射1次注射3周分3次注入C57BL/6 (雄性，6周，每組10只)腹腔內。每次注射間隔6小時、對小時、7日后提取老鼠血液測定血液內存在的細胞外小泡特異性抗體。將利用1% BSA/PBS按 1:500稀釋的老鼠血清放于涂有源于大腸桿菌的小泡200 ng的黑色96孔板上，在常溫下培養(yǎng)2小時后通過過氧化物酶(peroxidase)結合的老鼠抗體進行觀察。圖43是對老鼠血液內源于大腸桿菌的細胞外小泡特異性抗體的量隨時間進行觀察的示意圖。可以看出，細胞外小泡特異抗體在1次注入細胞外小泡7日后開始形成，第二次和第三次注入細胞外小泡后形成了更多的抗體，第三次完成小泡疫苗接種7日后形成的抗體最多。通過上述方法完成三次源于大腸桿菌的細胞外小泡的接種7日后從老鼠中將脾臟細胞分離出來，將源于大腸桿菌的細胞外小泡100 ng放入分離的脾臟細胞O χ IO4)內培養(yǎng)72小時后，通過ELISA方法分別測定出與脾臟細胞分泌的免疫反應相關的細胞因子即 IFN-g, IL-17, IL-4 的量。圖44是顯示將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入老鼠脾臟細胞處理時分泌的 IFN-g量的示意圖?？梢钥闯?，與從未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠組獲得的脾臟細胞相比，從接種了細胞外小泡的老鼠獲得的脾臟細胞的IFN-g分泌增加了。圖45是顯示將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入老鼠脾臟細胞處理時分泌的 IL-17量的示意圖。可以看出，與從未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠組獲得的脾臟細胞相比，從接種了細胞外小泡的老鼠獲得的脾臟細胞的IL-17的分泌增加了。圖46是顯示將源于大腸桿菌的細胞外小泡注入老鼠脾臟細胞處理時分泌的IL-4 量的示意圖?？梢钥闯觯从诖竽c桿菌的細胞外小泡的接種對脾臟細胞的IL-4分泌沒有影響。從上述結果可以看出，接種源于大腸桿菌的細胞外小泡時，會誘發(fā)針對細菌感染的防御機制即B細胞生成的抗體反應和T細胞免疫反應。特別是，通過接種源于大腸桿菌的細胞外小泡可以有效地誘發(fā)T細胞免疫反應，即對于防御細菌感染非常重要的分泌IFN-g 的Thl免疫反應和分泌IL-17的Thl7免疫反應。實施例18.源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對由大腸桿菌感染誘發(fā)的敗血癥發(fā)牛的效果
為了評估源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗的效果，構建了由大腸桿菌感染誘發(fā)的敗血癥動物模型。將大腸桿菌ι X IO6,1 X IO8,1 X 101° CFU注入C57BL/6 (雄性，6周，每組10只)的腹腔，5日內每間隔8小時觀察老鼠的存活率。圖47是顯示由大腸桿菌感染誘發(fā)老鼠致死率的示意圖，即，如果注入大腸桿菌1 χ 101° CFU，老鼠在M小時內死亡，如果注入大腸桿菌1 χ IO6,1 χ IO8 CFU，則對老鼠的生存沒有影響。按實施例17所述方法將源于大腸桿菌的細胞外小泡0. 5，1 μ g每隔1周注射1 次注射3周分3次注入C57BL/6 (雄性，6周，每組10只)腹腔。完成三次源于大腸桿菌的細胞外小泡的接種7日后，將大腸桿菌1 χ 101° CFU注入腹腔，在5日內每隔8小時觀察老鼠的存活率。圖48是觀察源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對圖47所述由大腸桿菌感染誘發(fā)的敗血癥發(fā)生所產生的效果的示意圖?？梢钥闯?，5日后未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的
老鼠存活率為20%，然而接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠組的存活率達到80 -100%。按圖48所述方法將源于大腸桿菌的細胞外小泡1 μ g每隔1周注射1次分3次注入腹腔進行接種后，再將大腸桿菌1 χ 101° CFU注入老鼠腹腔，6小時后測定腹水與血液中受感染的大腸桿菌個數，結果如圖49所示。另外，利用ELISA測定血清內IL-6量，結果如圖50所示，肺組織圖像如圖51所示。圖49是顯示接種源于大腸桿菌的細胞外小泡時的受感染的大腸桿菌CFU變化的示意圖?？梢钥闯觯敻腥敬竽c桿菌時，與從未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠獲得的血液和腹水相比，接種了小泡的老鼠的血液及腹水中大腸桿菌的數量顯著減少。圖50是接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠感染大腸桿菌1 χ IO8 CFU經過6小時后，對血清中存在的IL-6量進行測定的示意圖?？梢钥闯?，感染大腸桿菌的老鼠血清內炎癥性細胞因子即IL-6的量顯著增加，但是，用源于大腸桿菌的細胞外小泡進行預防接種的老鼠血清內IL-6的量卻急劇減少。圖51是接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠感染大腸桿菌6小時后，將老鼠的肺摘出確認肺組織狀態(tài)的示意圖?？梢钥闯?，當感染大腸桿菌時，肺組織細胞被大量破壞，但是，用源于大腸桿菌的細胞外小泡進行預防接種的一組的肺病理組織卻與正常老鼠相似。上述結果表明，如果事先將源于腸道共生細菌即大腸桿菌的細胞外小泡作為疫苗注入，就能夠有效地預防由大腸桿菌引起的感染及病理。實施例19.源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對由源于大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的敗血癥發(fā)牛的效果
按實施例17所述方法將源于大腸桿菌的細胞外小泡1 μ g每隔1周注射1次分3次注入C57BL/6 (雄性，6周，每組5只)腹腔后，觀察源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對如實施例6所述由源于大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的敗血癥發(fā)生的效果。完成源于大腸桿菌的細胞外小泡預防接種7日后，將源于大腸桿菌的細胞外小泡5 yg每隔12小時分3次注入腹腔，對與敗血癥相關的指標進行分析。圖52至圖M是觀察源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對如實施例6所述由源于大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的敗血癥發(fā)生的效果的示意圖。圖52是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(5 μ g，3次)注入接種了源于大腸桿菌的
39細胞外小泡的老鼠6小時后提取老鼠血液并測定血清內細胞因子即IFN-g的示意圖。可以看出，與未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠組相比，接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡的一組的血清內IL-6量顯著減少。圖53是對與敗血癥相關的全身性炎癥反應中的溫度進行測定的示意圖。可以看出，因將源于大腸桿菌的細胞外小泡5 μ g分3次注入而引發(fā)低燒，但是，如果事先將源于大腸桿菌的細胞外小泡ι μ g間隔ι周注射ι次分3次進行接種，則其體溫保持與正常老鼠相似。圖M是在患重癥敗血癥的情況下對血小板減少現象進行觀察的示意圖?？梢钥闯?，因將源于大腸桿菌的細胞外小泡5 μg分3次注入而導致血小板數量減少，但是，如果事先將源于大腸桿菌的細胞外小泡ι μ g間隔ι周注射ι次分3次注入進行接種，則血小板減少情況就會降低。上述結果表明，如果事先將源于腸道共生細菌即大腸桿菌的細胞外小泡作為疫苗注入，就能夠有效地預防由源于大腸桿菌的細胞外小泡誘發(fā)的疾病。^MM 20.源干肺炎克雷伯的細胞,夕M、泡ι瘡苗的免,瘡學特十牛
將按實施例3所述方法分離的源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡100 ng,l mg間隔5 日分3次注入C57BL/6 (雄性，6周，每組5只)腹腔。最后接種3日后提取老鼠血液并確認血液中存在的源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡特異性抗體，結果如圖陽所示，將脾臟摘出后，分離脾臟內T細胞并測定細胞因子即IFN-g，IL-17，結果如圖56所示。圖55是顯示了從接種了源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡的老鼠提取的血液內存在源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡特異性抗體情況的示意圖，可以看出，小泡特異抗體與源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡的濃度成一定的比例。圖56是將源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡注入從脾臟中提取的T細胞處理時顯示CD3+CD4+IFN-g+ T細胞的示意圖。可以看出，與未接種源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡的老鼠組相比，接種了細胞外小泡的一組中⑶3+CD4+IFN-g+ T細胞增加了。圖57是將源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡注入從脾臟中提取的T細胞處理時顯示CD3+CD4+IL17+ T細胞的示意圖?？梢钥闯觯c未接種源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡的老鼠組相比，接種了細胞外小泡的一組中CD3+⑶4+IL17+ T細胞增加了。如圖55至圖57所示，接種源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡時，就會誘發(fā)針對細菌感染的防御機制即B細胞生成的抗體反應和T細胞免疫反應。特別是，通過接種小泡疫苗能夠有效地誘導T細胞免疫反應中對于防御細菌感染非常重要的分泌IFN-g的Thl免疫反應和分泌IL-17的Thl7免疫反應。實施例21.源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對由肺炎克雷伯菌感染誘發(fā)的敗血癥發(fā)牛的效果
為了評估源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡疫苗的效果，構建由肺炎克雷伯菌感染誘發(fā)的敗血癥動物模型。將肺炎克雷伯菌1 χ IO6,1 χ IO7,1 χ IO8 CFU注入C57BL/6 (雄性， 6周，每組5只)腹腔，在5日內間隔8小時觀察老鼠的存活率。圖58是顯示因肺炎克雷伯菌感染導致老鼠致死率的示意圖，即，如果注入肺炎克雷伯菌1 χ IO8 CFU，老鼠會在M小時內死亡，如果注入大腸桿菌1 χ IO6,1 χ IO7 CFU, M 對老鼠的生存沒有影響。
為了評估源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡對肺炎克雷伯菌感染的效果，將細胞外小泡1 yg間隔5日分3次注入C57BL/6 (雄性，6周，每組5只)腹腔。完成三次源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡的接種3日后，將肺炎克雷伯菌1 χ IO8 CFU注入腹腔，在5日內間隔8小時觀察老鼠的存活率。圖59是觀察源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡疫苗對按上述方法構建的由肺炎克雷伯菌感染誘發(fā)的敗血癥發(fā)生的效果的示意圖?？梢钥闯?，感染肺炎克雷伯菌5日后，未接種源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡的老鼠存活率為40%，而接種了源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡的老鼠一組的存活率為100 %。上述結果表明，如果事先將源于腸道共生細菌即肺炎克雷伯菌的細胞外小泡作為疫苗注入，就能夠有效地預防由源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡誘發(fā)的疾病。實施例22.并用灃入源于大腸桿菌及肺炎克雷伯菌的細胞外小泡疫苗時的免疫學特件
分別將按實施例3所述方法分離的源于大腸桿菌的細胞外小泡，源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡1 mg，源于大腸桿菌及肺炎克雷伯菌的細胞外小泡各1 mg按間隔5日分2次注入C57BL/6 (雄性，6周，每組5只)腹腔內。接種細胞外小泡3日后提取血液，將按1:500 稀釋的血清放于涂有細胞外小泡的黑色96孔板上在常溫下培養(yǎng)2小時。圖60是顯示形成源于大腸桿菌的細胞外小泡特異性抗體的示意圖?？梢钥闯觯攲⒉⒂米⑷朐从诖竽c桿菌與肺炎克雷伯菌的細胞外小泡時，源于大腸桿菌的細胞外小泡特異抗體的形成與將單獨注入源于大腸桿菌的細胞外小泡時相比增加了。圖61是顯示形成源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡特異性抗體的示意圖?？梢钥闯觯攲⒉⒂米⑷朐从诖竽c桿菌與肺炎克雷伯菌的細胞外小泡時，源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡特異抗體的形成與將單獨注入源于肺炎克雷伯菌的細胞外小泡時相比增加了。上述結果表明，如果事先將源于腸道共生細菌即大腸桿菌與肺炎克雷伯菌的細胞外小泡混合作為疫苗注入時，不僅能夠有效地預防由源于大腸桿菌及肺炎克雷伯菌的細胞外小泡誘發(fā)的疾病，而且還能夠有效地預防由大腸桿菌及肺炎克雷伯菌誘發(fā)的感染。實施例23.源于腸道共生細菌的細胞外小泡的遺傳物質堿基序列分析
提取C57BL/6 (6周，雄性)與BALB/c (6周，雄性)老鼠的大便，將細胞外小泡分離后，分3次分別向10 μ g細胞外小泡中添加蒸餾水使總體積達到8 μ 。當分別向小泡中添加2 μ 1的隨機十聚體(random decamer) (Ambion，5722 后，在95° C的條件下培養(yǎng)10分鐘，再在75° C的條件下培養(yǎng)10分鐘，然后，在4° C的環(huán)境下保管。分別向添加隨機十聚體后的樣本中添加AMV反轉錄酶(Promega，M510F) 3 μ 1，AMV反轉錄酶緩沖液 (Promega, M515A) 4 μ 1,10 mM dNTP 2 μ 1，RNase 抑制劑(Promega，Ν21 IB) 1 μ 進行處理后，在25° C的條件下使其反應10分鐘，然后，再在37° C的條件下使其反應2小時。利用添加AMV反轉錄酶處理后的各20 μ 1樣本中的1 μ 1通過PCR對16S rRNA基因進行確認。為了執(zhí)行PCR，向樣本1 μ 1中添加Taq酶(NEB，M0273S) 0. 5 μ 1，Taq酶緩沖液(NEB，B9014S) 2 μ 1,10 mM dNTP 1 μ 1,10 ρΜ 細菌通用正向引物(bacterial universal forward primer) 1 μ 1 (5' aaggcgacgatccctagctg-3'), 10 pM 細IifiE用反向弓L(bacterial universal reverse primer) 1 μ 1 (5' ttgagcccggggatttcaca-3') 后，分3次添加蒸餾水13. 5 μ 1進行混合。將混合物在95° C的條件下使其反應2分鐘
41后，在分別在95° C的條件下反應30秒，在55° C的條件下反應30秒，在72° C的條件下反應45秒，共反復執(zhí)行上述操作45次。最后，在72° C的條件下反應5分鐘，然后，委托SdGent (株)(大田廣域市儒城區(qū)花巖洞63-10)對PCR結果物進行排序，最終獲得以 C57BL/6對象的圖62所示結果及以BALB/c為對象的圖63所示結果。如圖62及圖63所示，從第100 120號，第150-190號核酸部分出現的多重峰值來看，可知其中混入有源于多種細菌的16S rRNA。由此，可以確認源于大便的細胞外小泡中含有源于多種細菌的細胞外小泡。通過將從NCBI數據庫(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ Kene)獲得的細菌的16S rRNA堿基序列與考慮多重峰值的排序結果進行比較可以確認棲息于圖1所示大便中具有代表性的10種細菌中大腸桿菌與肺炎克雷伯菌存在是可能的。為了確認源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡中存在16S rRNA遺傳物質，按上述方法對細胞外小泡10 μ g執(zhí)行RT-PCR操作。陰性對照使用3次蒸餾水，而陽性對照將腸道大腸桿菌培養(yǎng)至0. D.值為1. 0后，使用1 μ 1。向RT-PCR結果物20 μ 1中混入5Χ綠色GoTaq 反應緩沖液(5Χ Green GoTaq Flexi Buffer) (Promega,M891A) 5 μ 1 后，將其中的 5 μ 1 加入(loading)到2%瓊脂糖凝膠中。通過100 V將其執(zhí)行30分鐘的電泳(gel running) 操作，將凝膠放入0. 005% EtBr溶液中浸泡10分鐘后，在紫外線照射的狀態(tài)下拍下照片。結果如圖64所示，最終獲得了與陽性對照相同的條帶(band)，由此可知，源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡中存在16S rRNA基因及源于其中的RNA轉錄體。棚列24.磁鮮夕卜/丨、泡制
將源于腸道共生細菌的細胞外小泡25 yg注入C57BL/6 (6周，雄性，每組3只)老鼠腹腔，6小時后提取老鼠臟器及體液，利用細胞外小泡的抗體通過ELISA確認是否存在細胞外小泡蛋白。將老鼠臟器摘出后，在存在液氮的狀態(tài)下放入研缽中研磨后，加入RIPA溶液(50 mM Tris (pH 7. 5)，1% NP-40,0. 25% Na-脫氧膽酸鹽，100 mM NaCl, 1 mM EDTA，蛋白酶抑制劑)并進行裂解操作，在4° C的條件下按13，000 rpm離心分離10分鐘獲得蛋白質，體液可以通過與上述實施例5，6相同的方法獲得。圖65是顯示通過腹腔注入的細胞外小泡存在于各種臟器及腹腔灌洗液 (peritoneal fluid; PF)、小便、血液中的示意圖。這表明由細胞外小泡誘發(fā)的炎癥性疾病可以通過獲得小便及血液等容易提取的體液進行診斷。上述所述的本發(fā)明的說明是只是用于舉例，相關工作人員完全可以在不偏離本項發(fā)明技術思想或必須特征的范圍內，可轉換成其他具體的形式。因此，上述所述的實施例只是在全方面內進行了舉例，但并不限定于此。工業(yè)實用性
利用本發(fā)明源于腸道共生細菌的細胞外小泡可以有效地發(fā)掘能夠預防或治療源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)疾病的藥物。另外，注射源于腸道共生細菌的細胞外小泡本身或者將其變形注入以調節(jié)免疫反應，從而能夠研發(fā)出可以有效地預防或治療由腸道共生細菌引發(fā)的感染或者源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)的疾病的疫苗。另外，利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡還能夠研發(fā)出診斷源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)疾病的致病因子的技術。
權利要求
1.一種組合物，其特征在于包含源于腸道共生細菌的細胞外小泡。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于 上述腸道共生細菌為革蘭氏陰性細菌。
3.如權利要求2所述的組合物，其特征在于上述革蘭氏陰性細菌可以從由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬細菌及類桿菌屬細菌構成的群中選擇。
4.如權利要求1所述的組合物，其特征在于上述細胞外小泡可以從腸道共生細菌培養(yǎng)液中分離。
5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于上述細胞外小泡為分離出的自然分泌的細胞外小泡。
6.如權利要求4所述的組合物，其特征在于上述細胞外小泡為分離出的人工分泌的細胞外小泡。
7.如權利要求1所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的大便中分離得到。
8.如權利要求1所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的腸道中分離得到。
9.如權利要求8所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的胃液中分離得到。
10.如權利要求8所述的組合物，其特征在于上述細胞外小泡從哺乳動物的小腸液中分離得到。
11.如權利要求8所述的組合物，其特征在于上述細胞外小泡從哺乳動物的口腔液中分離得到。
12.—種疾病模型，其特征在于將源于腸道共生細菌的細胞外小泡注入動物構建。
13.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述腸道共生細菌為革蘭氏陰性細菌。
14.如權利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述革蘭氏陰性細菌可以從由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬細菌及類桿菌屬細菌構成的群中選擇。
15.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡從上述腸道共生細菌培養(yǎng)液中分離得到。
16.如權利要求15所述的疾病模型，其特征在于 上述細胞外小泡為分離出的自然分泌的細胞外小泡。
17.如權利要求15所述的疾病模型，其特征在于 上述細胞外小泡為分離出的人工分泌的細胞外小泡。
18.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的大便中分離得到。
19.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡從哺乳動物的腸道中分離得到。
20.如權利要求19所述的疾病模型，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的胃液中分離得到。
21.如權利要求19所述的疾病模型，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的小腸液中分離得到。
22.如權利要求19所述的疾病模型，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的口腔液中分離得到。
23.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述動物為老鼠。
24.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述注入為腹腔注入。
25.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述注入為靜脈注入。
26.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述注入為口腔注入。
27.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述注入為肛門注入。
28.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述注入為鼻腔注入。
29.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于 上述注入為呼吸道注入。
30.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于上述疾病從由敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病構成的群中選擇。
31.如權利要求12所述的疾病模型，其特征在于上述疾病從由口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、 腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌構成的群中選擇。
32.一種備選藥物的篩選方法，其特征在于上述藥物為針對利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡的疾病預防或治療的備選藥物。
33.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于 上述腸道共生細菌從革蘭氏陰性細菌中選擇。
34.如權利要求33所述的篩選方法，其特征在于上述革蘭氏陰性細菌從由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬細菌及類桿菌屬細菌構成的群中選擇。
35.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞外小泡從腸道共生細菌培養(yǎng)液中分離。
36.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞外小泡為分離出的自然分泌的細胞外小泡。
37.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于上述細胞外小泡為分離出的人工分泌的細胞外小泡。
38.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的大便中分離得到。
39.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的腸道中分離得到。
40.如權利要求39所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的胃液中分離得到。
41.如權利要求39所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的小腸液中分離得到。
42.如權利要求39所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的口腔液中分離。
43.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于上述疾病從由敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病構成的群中選擇。
44.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于上述疾病從由口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、 腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌構成的群中選擇。
45.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于上述篩選方法包括利用上述源于腸道共生細菌的細胞外小泡對細胞進行處理的步馬聚ο
46.如權利要求45所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞為炎癥細胞。
47.如權利要求46所述的篩選方法，其特征在于 上述炎癥細胞為單核細胞。
48.如權利要求46所述的篩選方法，其特征在于 上述炎癥細胞為中性粒細胞。
49.如權利要求46所述的篩選方法，其特征在于 上述炎癥細胞為嗜酸性粒細胞。
50.如權利要求46所述的篩選方法，其特征在于 上述炎癥細胞為嗜堿性粒細胞。
51.如權利要求46所述的篩選方法，其特征在于 上述炎癥細胞為單核細胞在組織中分化的細胞。
52.如權利要求45所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞為上皮細胞。
53.如權利要求45所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞為血管內皮細胞。
54.如權利要求45所述的篩選方法，其特征在于 上述細胞為干細胞。
55.如權利要求M所述的篩選方法，其特征在于上述干細胞為源于骨髓組織的細胞。
56.如權利要求M所述的篩選方法，其特征在于 上述干細胞為源于脂肪組織的細胞。
57.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于上述篩選方法包括將源于腸道共生細菌的細胞外小泡與備選物質一起注入后測定炎癥相關媒介水平的步驟。
58.如權利要求57所述的篩選方法，其特征在于 上述炎癥相關媒介為白細胞介素anterleukin，IL)-6。
59.如權利要求32所述的篩選方法，其特征在于上述篩選方法包括將源于腸道共生細菌的細胞外小泡與備選物質一起注入后評估炎癥相關信號傳遞過程的步驟。
60.一種含有源于腸道共生細菌的細胞外小泡的疫苗，其特征在于 可用于預防或治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)的疾病。
61.如權利要求60所述的疫苗，其特征在于上述疾病從由敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病構成的群中選擇。
62.如權利要求60所述的疫苗，其特征在于上述疾病從由口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、 腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌構成的群中選擇。
63.如權利要求60所述的疫苗，其特征在于 上述疫苗源于革蘭氏陰性細菌。
64.如權利要求63所述的疫苗，其特征在于上述革蘭氏陰性細菌為，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬細菌及類桿菌屬細菌。
65.如權利要求60所述的疫苗，其特征在于上述疫苗基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用。
66.如權利要求65所述的疫苗，其特征在于 上述變形為使用轉化的細菌。
67.如權利要求65所述的疫苗，其特征在于 上述變形為利用化合物對細菌進行的處理。
68.如權利要求67所述的疫苗，其特征在于 上述化合物為藥物。
69.如權利要求65所述的疫苗，其特征在于上述變形為利用化合物對細胞外小泡進行的處理。
70.如權利要求69所述的疫苗，其特征在于 上述化合物為藥物。
71.如權利要求60所述的疫苗，其特征在于上述疫苗基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用。
72.如權利要求60所述的疫苗，其特征在于上述疫苗基于增強效果或者減少副作用的目的而與免疫增強劑并用。
73.一種含有源于腸道共生細菌的細胞外小泡的疫苗，其特征在于 用于預防或治療由腸道共生細菌引發(fā)的感染。
74.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于上述感染從由腹膜炎、敗血癥、肺炎、泌尿道感染、骨關節(jié)及中樞神經系統感染構成的群中選擇。
75.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于 上述疫苗源于革蘭氏陰性細菌。
76.如權利要求75所述的疫苗，其特征在于上述革蘭氏陰性細菌為，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬細菌及類桿菌屬細菌。
77.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于上述疫苗基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用。
78.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于 上述變形使用轉化的細菌。
79.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于 上述變形為利用化合物對細菌進行的處理。
80.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于 上述化合物為藥物。
81.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于上述變形為利用化合物對細胞外小泡進行的處理。
82.如權利要求81所述的疫苗，其特征在于 上述化合物為藥物。
83.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于上述疫苗基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用。
84.如權利要求73所述的疫苗，其特征在于上述疫苗基于增強效果或者減少副作用的目的而與免疫增強劑并用。
85.一種預防或治療疾病的方法，其特征在于上述方法包括將源于腸道共生細菌的細胞外小泡按低于致死量的標準注入哺乳動物的步驟。
86.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述腸道共生細菌為革蘭氏陰性細菌。
87.如權利要求86所述的方法，其特征在于上述革蘭氏陰性細菌為，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬細菌及類桿菌屬細菌。
88.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡從腸道共生細菌培養(yǎng)液中分離得到。
89.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述細胞外小泡自然分泌生成。
90.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述細胞外小泡人工分泌生成。
91.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡從哺乳動物的大便中分離得到。
92.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的腸道中分離得到。
93.如權利要求92所述的方法，其特征在于 上述細胞外小泡從哺乳動物的胃液中分離得到。
94.如權利要求92所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡從哺乳動物的小腸液中分離得到。
95.如權利要求92所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡從哺乳動物的口腔液中分離得到。
96.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡基于增強效果或者減少副作用的目的而變形使用。
97.如權利要求96所述的方法，其特征在于 上述變形為使用轉化的細菌。
98.如權利要求96所述的方法，其特征在于 上述變形為利用化合物對細菌進行的處理。
99.如權利要求98所述的方法，其特征在于 上述化合物為藥物。
100.如權利要求96所述的方法，其特征在于上述變形為利用化合物對細胞外小泡進行的處理。
101.如權利要求100所述的方法，其特征在于 上述化合物為藥物。
102.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述注入基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用。
103.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述注入基于增強效果或者減少副作用的目的而與免疫增強劑并用。
104.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述疾病為由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)或者導致惡化的疾病。
105.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述疾病從由敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病構成的群中選擇。
106.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述疾病從由口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、 腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌構成的群中選擇。
107.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述疾病從由腹膜炎、敗血癥、肺炎、泌尿道感染、骨關節(jié)及中樞神經系統感染構成的群中選擇。
108.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述注入為皮下注射。
109.如權利要求85所述的方法，其特征在于上述注入為靜脈注射。
110.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述注入為鼻腔注入。
111.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述注入為舌下注入。
112.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述注入為呼吸道吸入。
113.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述注入為口服。
114.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述注入為肛門注入。
115.如權利要求85所述的方法，其特征在于 上述注入為皮膚注入。
116.一種預防或治療疾病的藥學組合物，其特征在于上述組合物包含通過利用源于腸道共生細菌的細胞外小泡的篩選方法篩選的物質。
117.如權利要求116所述的藥學組合物，其特征在于 上述物質包括激酶抑制劑(kinase inhibitor)。
118.如權利要求117所述的藥學組合物，其特征在于上述激酶抑制劑可以從由虎刺醛(3-羥基-1-甲氧基-9，10-二氧蒽-2-甲醛)，！1-7 (5-(2-甲基-1-哌嗪基)磺酰異喹啉二鹽酸鹽)，LY^4002 (2-嗎啉-4-基-8-苯基苯并吡喃_4_酮)，GF109203X (3-[1-[3-( 二甲氨基)丙基]吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)吡咯-2，5-二酮)，ML_7 (1-(5-碘萘-1-基)磺?；?1，4-二氮雜環(huán)庚烷鹽酸鹽)，ML-9 (1-(5-氯萘-1-基)磺?；?1，4-二氮雜環(huán)庚烷鹽酸鹽)，ZM449829 (1_ (2-萘基)-2-丙烯-1-酮)，DRB ((2S，3S， 4R, 5R) -2- (5,6- 二氯苯并咪唑基)_5_ (羥甲基)四氫呋喃-3,4-二醇)，靛玉紅-3，-一肟(3-[3-(羥氨酸)-IH-吲哚-2-基]吲哚-2-酮)，9_溴-7，12- 二氫-5H-吲哚并[3， 2-d] [1]苯并氮雜卓-6-酮(Kenpaullone)，BML-259 (N-(5-異丙基噻唑-2-基)苯乙酰胺)，及芹菜素(5，7-二羥基-2-(4-羥苯基)苯并吡喃-4-酮)構成的群中選擇。
119.如權利要求116所述的藥學組合物，其特征在于 上述物質包括磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)。
120.如權利要求119所述的藥學組合物，其特征在于上述磷酸酶抑制劑包括PD-144795(5-甲氧基-3-(1-甲基乙氧基)苯并(b)噻吩-2-甲酰胺-1-氧化物)，的藥學組合物。
121.如權利要求116所述的藥學組合物，其特征在于 上述物質為前體藥物(prodrug)。
122.如權利要求121所述的藥學組合物，其特征在于上述前體藥物可以從由阿密替林，環(huán)苯扎林，地昔帕明，多塞平，氟奮乃靜二氯化合物， 氟哌啶醇，丙咪嗪，馬普替林，鄰甲苯海明，特非那定，托滅酸及鹽酸曲唑酮構成的群中選擇。
123.如權利要求116所述的藥學組合物，其特征在于上述疾病為由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)或者導致惡化的疾病。
124.如權利要求116所述的藥學組合物，其特征在于上述疾病從由敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病構成的群中選擇。
125.如權利要求116所述的藥學組合物，其特征在于上述疾病從由口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、 腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌構成的群中選擇。
126.—種疾病致病因子的診斷方法，其特征在于 上述方法應用源于腸道共生細菌的細胞外小泡。
127.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于 上述腸道共生細菌為革蘭氏陰性細菌。
128.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于上述革蘭氏陰性細菌為，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬細菌及類桿菌屬細菌。
129.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于上述疾病從由敗血癥、動脈硬化癥、急性冠狀動脈綜合癥、腦卒中、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、骨質疏松癥、高血壓、肥胖、糖尿病、關節(jié)炎及腦病構成的群中選擇。
130.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于上述疾病從由口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、消化性潰瘍、胃癌、炎癥性腸炎、 腸易激綜合征、大腸癌、膽管炎、膽囊炎、胰腺炎、膽管癌及胰腺癌構成的群中選擇。
131.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于上述應用為對源于腸道共生細菌的細胞外小泡所含遺傳物質進行的堿基序列分析。
132.如權利要求131所述的診斷方法，其特征在于 上述遺傳物質為16S rRNA。
133.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于上述應用為對源于腸道共生細菌的細胞外小泡所含蛋白質進行的測定。
134.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于上述應用為對源于腸道共生細菌的細胞外小泡的免疫反應進行的測定。
135.如權利要求134所述的診斷方法，其特征在于上述免疫反應的測定為，對源于腸道共生細菌的細胞外小泡的抗體進行的測定。
136.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于 上述診斷利用大便進行測定。
137.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于 上述診斷利用血液進行測定。
138.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于 上述診斷利用小便進行測定。
139.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于 上述診斷利用腹水進行測定。
140.如權利要求1 所述的診斷方法，其特征在于 上述診斷利用胸水進行測定。
141.如權利要求126所述的診斷方法，其特征在于 上述診斷利用關節(jié)液進行測定。
142.如權利要求126所述的診斷方法，其特征在于 上述診斷利用腦脊液進行測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含源于腸道共生細菌腸道微生物或腸道菌群(gutmicrobiotaorgutflora)的細胞外小泡的組合物及利用該小泡的疾病動物模型。另外，本發(fā)明還涉及一種利用上述源于腸道共生細菌的細胞外小泡能夠有效地篩選預防或治療由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)疾病的備選藥物的方法，以及能夠有效地預防或治療由源于腸道共生細菌的感染或者由源于腸道共生細菌的細胞外小泡誘發(fā)疾病的疫苗。另外，應用本發(fā)明的源于腸道共生細菌的細胞外小泡還能夠研發(fā)出診斷由源于腸道共生細菌的細胞外小泡引發(fā)疾病的致病因子的技術。
文檔編號A61P31/00GK102480932SQ201080038540
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權日2009年9月1日
發(fā)明者樸瓊緒, 李元熙, 洪福實, 金大謙, 金宥善, 金志賢, 金政旭, 金潤根, 高用松 申請人:阿昂梅迪克斯公司