專利名稱：一種快速有效地用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速有效地用沃爾巴克氏體 (Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法。
背景技術(shù)：
沃爾巴克氏體(Wolbachia)是廣泛分布于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的共生微生物，它可能是昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩(wěn)定地存在于宿主的生殖細(xì)胞內(nèi)，通過卵細(xì)胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細(xì)胞質(zhì)不親和、雌性化和殺雄性等調(diào)控宿主的生殖活動(dòng)。通過這些調(diào)控作用促進(jìn)其在宿主種群內(nèi)廣泛傳播。在沃爾巴克氏體(Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細(xì)胞質(zhì)不親和 (Cytoplasmic ^compatibility，Cl)是最常見的一種類型。它表現(xiàn)為當(dāng)被沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時(shí)，精子和卵子結(jié)合后胚胎無法發(fā)育。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胞質(zhì)不親和的特性可導(dǎo)致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進(jìn)行種群壓制和種群替代。它的應(yīng)用對蚊媒病防治具有巨大的價(jià)值。它的具體應(yīng)用依賴于在病媒蚊群中人工引入沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染。一些醫(yī)學(xué)上重要的傳播疾病蚊種如按蚊(傳播瘧疾)和伊蚊(傳播登革)天然都不感染沃爾巴克氏體(Wolkichia)。所以建立人工用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法顯得十分重要。目前，主要采用胚胎注射的方法轉(zhuǎn)染蚊子。此方法大致過程為獲取沃爾巴克氏體(Wolkichia)，胚胎注射和轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選?，F(xiàn)階段，有二種方法獲取沃爾巴克氏體(Wolbachia):—種是先采用人工強(qiáng)制蚊子或果蠅產(chǎn)卵的方法收集含有沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的胚胎，再從中直接抽取胞漿；另一種是先從含有沃爾巴克氏體(Wolbachia) 組織中提取沃爾巴克氏體(Wolkichia)，把它轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，讓它在細(xì)胞內(nèi)生長一段時(shí)間 (1-2年)后，再提取它用于轉(zhuǎn)染蚊子。對于第一種方法，沃爾巴克氏體(Wolbachia)的獲取依賴于人工強(qiáng)制產(chǎn)卵的方法收集的含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胚胎，而人工強(qiáng)制產(chǎn)卵的方法可控性很差。大多數(shù)情況下，不能有效地在需要的時(shí)間內(nèi)(胚胎注射需在蚊卵不超過排出后1. 5小時(shí)左右完成注射，以便沃爾巴克氏體進(jìn)入生殖細(xì)胞；超過排出后1. 5小時(shí)的卵一般不能用于胚胎注射)獲取用于抽取沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胚胎。所以，大量時(shí)間和精力會(huì)消耗在規(guī)定時(shí)間人工強(qiáng)制產(chǎn)卵的方法獲取含有沃爾巴克氏體(Wolbachia) 的胚胎上。而第二種耗時(shí)太長，不利于快速建立沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染的蚊株。并且目前，轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選一般是在原代(GO)，即胚胎注射后的蚊卵孵化并培育成的母成蟲中進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)染成功的陽性蚊株。但是這種方法是不妥的，這是因?yàn)槔碚撋希谠?GO)中的陽性并不能代表轉(zhuǎn)染成功，同時(shí)，此方法丟棄了原代(GO)中陰性株，這將會(huì)損失大量的珍貴原代(GO)，因?yàn)橛行╆栃灾昃痛嬖谟谶@些被丟棄的陰性原代(GO)的子代(Gl)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速有效用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法，利用該方法轉(zhuǎn)染蚊子，可以快速有效的建立沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染成功的蚊株。本發(fā)明首先快速的從含有沃爾巴克氏體的昆蟲的卵巢中分離獲取純化的沃爾巴克氏體(Wolkichia)，然后再經(jīng)常規(guī)的胚胎注射轉(zhuǎn)染，獲得原代(GO)的蚊株，在子代(第一代，Gl)篩選陽性蚊株，由此篩選獲得的陽性蚊株即為真正轉(zhuǎn)染成功的蚊株，而不會(huì)浪費(fèi)珍貴的原代(GO)蚊株，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的快速有效用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法，包括沃爾巴克氏體(Wolbachia)的獲取，胚胎注射和轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選，其特征在于所述的沃爾巴克氏體的獲取，包括以下步驟(1)昆蟲卵巢的制備解剖含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的昆蟲，獲得其卵巢， 置于SPG緩沖液中；(2)將卵巢勻漿，用SPG緩沖液沖洗收集，然后置于離心機(jī)中離心IOOg lOOOg， Imin lOmin，取上清再離心5000g 15000g，5 20min，去除上清，沉積物再用SPG緩沖液沖懸，再離心IOOg lOOOg，Imin lOmin，取上清，即得到純化的沃爾巴克氏體 (Wolkichia)，該純化的的沃爾巴克氏體(Wolbachia)即可用于蚊子的胚胎注射；所述的轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選是將胚胎注射后的蚊卵培育獲得原代母成蟲(GO)、獲取的原代母成蟲(GO)與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代(Gl)蚊株，從中篩選含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的陽性蚊株，由此篩選獲得的陽性蚊株即為真正轉(zhuǎn)染成功的蚊株。所述的含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的昆蟲包括天然或人工感染沃爾巴克氏體(Wolbachia)的昆蟲，優(yōu)選為天然或人工感染沃爾巴克氏體(Wolbachia)的蚊子和果蠅。所述的沃爾巴克氏體的獲取中步驟(2)優(yōu)選為將卵巢勻菜，用SPG緩沖液沖洗收集，然后置于離心機(jī)中離心，300g, 5min,取上清再離心12000g，lOmin，去除上清，沉積物再用SPG緩沖液沖懸，再離心300g，5min，取上清，即得到純化的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。 利用該步驟離心分離，分離效果好。優(yōu)選，所述的從原代母成蟲與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代蚊株中篩選含有沃爾巴克氏體的陽性蚊株，其具體方法是提取第一代蚊株產(chǎn)卵后的母蚊的卵巢，應(yīng)用沃爾巴克氏體特征性基因引物進(jìn)行PCR找到轉(zhuǎn)染成功的蚊株。所述的沃爾巴克氏體特征性基因引物進(jìn)一步優(yōu)選為沃爾巴克氏體表面蛋白基因的通用引物81F 5' -TGG TCC MT MG TGA TGA AGA AAC 和 69IR 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA0所述的SPG緩沖液屬于現(xiàn)有技術(shù)的緩沖液，其配方為每升含有218mM蔗糖，3. SmM KH2PO4, 7. 2mM K2HPO4,4. 9mM L-谷氨酸，余量為水，pH 7.2。在GO代的陽性只能說明通過胚胎注射沃爾巴克氏體(Wolbachia)進(jìn)入了蚊體，而 Gl代陽性表明在GO代通過胚胎注射的沃爾巴克氏體(Wolbachia)進(jìn)入了 GO代蚊子的生殖細(xì)胞，只有進(jìn)入生殖細(xì)胞的沃爾巴克氏體(Wolbachia)才有能垂直傳播到下一代，所以在 Gl代篩選到的陽性蚊株才是真正轉(zhuǎn)染成功的蚊株。
本發(fā)明避開了人工強(qiáng)制產(chǎn)卵的方法，采用活體解剖的方法直接獲得含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的昆蟲卵巢組織(來源豐富，且容易獲取)，將其勻漿，再利用離心沉淀的方法使卵巢組織和沃爾巴克氏體(Wolbachia)分離，從而得到純化的、可用于胚胎注射轉(zhuǎn)染的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。將該純化的沃爾巴克氏體(Wolbachia)經(jīng)常規(guī)方法注射轉(zhuǎn)染蚊子胚胎，卵培育獲得原代母成蟲(GO)、獲取原代母成蟲與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代(Gl)蚊株，從中篩選含有沃爾巴克氏體的陽性蚊株，由此篩選獲得的陽性蚊株即為真正轉(zhuǎn)染成功的蚊株。由此可見本發(fā)明的方法中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的獲取，其來源(含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的昆蟲卵巢組織)豐富，并且容易獲取，整個(gè)方法操作簡便，可控性極強(qiáng)，非常容易在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)獲取大量的沃爾巴克氏體(Wolbachia)用于胚胎注射轉(zhuǎn)染，從而節(jié)省了大量的時(shí)間和精力，提高的工作效率。而轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選是在第一代 (Gl)進(jìn)行，由此篩選到的陽性蚊株絕對是真正轉(zhuǎn)染成功的蚊株，而不會(huì)出現(xiàn)假陽性的可能， 并且不會(huì)浪費(fèi)珍貴的原代(GO)代蚊株。因此本發(fā)明的用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法是一種快速有效的方法，本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)有利于迅速的建立轉(zhuǎn)染有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的蚊株，從而有利于其大規(guī)模的應(yīng)用。


圖1是實(shí)施例1中的蚊卵排列于載玻片上并進(jìn)行胚胎注射圖；圖2是利用PCR的方法檢測Gl代中的蚊株是否轉(zhuǎn)染成功，其中M為Marker，1-5 為待篩選的Gl蚊株，6為陰性對照，7為陽性對照，PCR產(chǎn)物為610bp ；圖3是利用FISH方法檢測蚊組織中的沃爾巴克氏體(Wolbachia)，圖的左邊為轉(zhuǎn)染沃爾巴克氏體成功的蚊的卵巢的卵母細(xì)胞，在卵母細(xì)胞的兩端和體表可見大量的熒光顆粒，為Wolbachia ；圖的右邊為陰性對照，未見熒光信號。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 1、沃爾巴克氏體的獲取采用解剖方法收集含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的白紋伊蚊(Aedes albopictus)的卵巢，一次解剖多個(gè)蚊體收集其卵巢，一次收集的卵巢重大約50mg，收集后置于Iml的SPG緩沖液中。用杜恩斯組織勻漿器(Dounce Tissue Grinder) 破碎卵巢組織，卵巢組織通過杜恩斯組織勻漿器碾磨10次，每次0. 5min,碾磨后的組織用 0. 5ml的SPG緩沖液沖洗收集。收集液再置于離心機(jī)中離心300g，5分鐘，去除一些組織碎片。轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管后再次離心12000g，10分鐘。去除上清液，離心管中沉積物含有純化的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。再用50微升的SPG緩沖液溶解上述離心管中的沉積物后，再次離心300g，5分鐘，進(jìn)一步去除殘存的組織碎片防止它堵塞胚胎注射的針頭， 得到上清液，上清液即為純化的沃爾巴克氏體(Wolkichia)。此上清夜即可作為胚胎注射液用于轉(zhuǎn)染蚊子胚胎。2、胚胎注射用胚胎注射的方法使提取的沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子胚胎的過程包括胚胎注射針頭的制備、蚊子胚胎的收集和準(zhǔn)備和胚胎注射。胚胎注射針頭的制備采用毛細(xì)管(Quartz with filament, 0. D. 1. 0mm, I. D. :0.7mm)和拉針器(P2000 Micropipette puller, Sutter Instrument Co.)制備胚胎注射針頭。設(shè)定對應(yīng)的拉針儀參數(shù)(Heat-280, Fil_3，Vel-30，Del-240, Pull_150)，將毛細(xì)管拉制成開口小于 5 μ m 的注射針，用磨針器(micro-pipette beveller, Sutter Instrument Co.)磨開針頭。蚊子胚胎收集和準(zhǔn)備用人工強(qiáng)制蚊子產(chǎn)卵的方法收集蚊子(斯氏按蚊，Anopheles stephensi)胚胎。準(zhǔn)備一只50ML離心管，轉(zhuǎn)移8個(gè)已血餐4天的母蚊子到一只50ML離心管(管底鋪上用水濕潤的棉球，棉球表面有濾紙覆蓋)，讓母蚊子產(chǎn)卵45分鐘。收集蚊卵，在解剖鏡下用 5號小鑷子選取并排列大約50個(gè)灰色的蚊卵于濾紙上。蚊卵應(yīng)排列成一直的順序，即蚊卵的前極(鈍部)向左，后極(銳部)向右(見圖1)。轉(zhuǎn)移排列好的蚊卵到載玻片上，讓蚊卵在空氣中干燥約10秒后，用礦物油(Halocarbon 700)覆蓋玻片上的蚊卵，防止它們的進(jìn)一步干燥(見圖1)。胚胎注射用加樣槍頭在胚胎注射針頭中加入步驟1中制備好的含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胚胎注射液，安裝針頭到顯微注射器(Marishige Scientific, JAPAN)，在顯微鏡(10X目鏡)下注射蚊卵。注射的位置是在蚊卵的后極(見圖1)。注射完成后，用小鑷子小心轉(zhuǎn)移注射后的蚊卵到濕潤的濾紙。把濾紙直接放入盛有高壓滅菌過的蒸餾水的小杯中孵化。 3、轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選篩選、鑒定和擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株過程包括孵化胚胎注射后的蚊卵并培育獲得母成蟲(原代，G0)、獲取母成蟲與野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl)和在子代(第一代，Gl)中篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株。孵化胚胎注射后的蚊卵并培育獲得母成蟲(原代G0)注射后蚊卵直接放入盛有高壓滅菌過的蒸餾水的小杯中孵化，注射后2天后檢查幼蟲個(gè)數(shù)并獲得孵化率0%-5%)。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(80%相對濕度和27°C )中培育孵化的幼蟲至蛹，讓每個(gè)蛹在單獨(dú)環(huán)境中發(fā)育成成蟲以保證獲得處女母蚊 (原代G0)。獲取的母成蟲(處女母蚊)與野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl 用處女母蚊與野生型的處女公蚊交配一周后，給予足量的血餐。血餐后按常規(guī)收集蚊卵，孵化蚊卵并培育至成蟲(第一代，Gl))。在子代(第一代，Gl)中篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株待第一代 (Gl)成蟲交配、血餐后，所有母蚊單獨(dú)產(chǎn)卵。提取產(chǎn)卵后的母蚊的卵巢，用PCR方法(采用 Phire Animal Tissue Direct PCR Kit和檢測沃爾巴克氏體(Wolbachia)表面蛋白基因的通用引物81F 5' -TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC禾P691R 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA進(jìn)行PCR)找到轉(zhuǎn)染成功的蚊株。具體方法為解剖獲得待測的蚊的卵巢組織，放入 DNA Release Additive 的 STE 緩沖液(IOOmM NaCI, IOmM Tris HCI, ImM EDTA，PH8.0)中， 550C 5分鐘，95°C 5分鐘后制備成待測樣品液備用。20 μ L體系PCR反應(yīng)液組成2X Phire Animal Tissue PCR Buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNA Polymerase 0.4卩1，胃弓| 物最終濃度各ο. 5 μ M，待測樣品液2 μ L，加滅菌蒸餾水至反應(yīng)體積20 μ L。PCR反應(yīng)條件 980C (5min) ；95°C (5s)，55°C (5s)，72°C (20s)，35 個(gè)循環(huán)后，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 結(jié)果。見圖2 其中M為Marker，line 1-5為待篩選的Gl蚊株，line 6為陰性對照，line 7為陽性對照，PCR產(chǎn)物為610bp，由圖2可以看出1號孔和4號孔對應(yīng)的Gl蚊株為轉(zhuǎn)染成功的蚊株。發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)染成功的蚊株后，孵化它的卵進(jìn)而擴(kuò)增種群，同時(shí)用上述PCR方法和 FISH方法(具體方法為用4% formaldehyde固定解剖得到血餐后3天的蚊卵巢，15分鐘后，用0.1%的TWEEN 20清洗。固定后的蚊卵巢與尾端含有熒光標(biāo)記的探針雜交M小時(shí)。探針序列來源于wolbachia的16SrRNA基因。隨后經(jīng)過3次洗脫后，標(biāo)本置于熒光顯微鏡觀察。)監(jiān)測沃爾巴克氏體Wolbachia的母代轉(zhuǎn)移率(maternal transfer rate)，見圖3: 圖的左邊為轉(zhuǎn)染沃爾巴克氏體成功的蚊的卵巢的卵母細(xì)胞，在卵母細(xì)胞的兩端和體表可見大量的熒光顆粒，為Wolbachia;圖的右邊為陰性對照，未見熒光信號。實(shí)施例2 1、沃爾巴克氏體的獲取將含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的白紋伊蚊(Aedes albopictus)采用解剖方法收集其卵巢，一次解剖多個(gè)白紋伊蚊收集其卵巢，一次收集的白紋伊蚊卵巢重大約50mg，收集后置于Iml的SPG緩沖液中。用杜恩斯組織勻漿器(Doimce Tissue Grinder)破碎卵巢組織，卵巢組織通過杜恩斯組織勻漿器碾磨10次，每次0. 5min, 碾磨后的組織用0. 5ml的SPG緩沖液沖洗收集。收集液再置于離心機(jī)中離心100g，10分鐘， 去除一些組織碎片。轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管后再次離心15000g，5分鐘。去除上清液，離心管中沉積物含有純化的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。再用50微升的SPG緩沖液溶解上述離心管中的沉積物后，再次離心100g，10分鐘，進(jìn)一步去除殘存的組織碎片防止它堵塞胚胎注射的針頭，得到上清液，上清液即為純化的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。此上清夜即可作為胚胎注射液用于轉(zhuǎn)染蚊子胚胎。2、胚胎注射用胚胎注射的方法使提取的沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子胚胎的過程包括胚胎注射針頭的制備、蚊子胚胎的收集和準(zhǔn)備和胚胎注射。胚胎注射針頭的制備采用毛細(xì)管(Quartz with filament, 0. D. 1. Omm, I. D. :0.7mm)和拉針器(P2000 Micropipette puller, Sutter Instrument Co.)制備胚胎注射針頭。設(shè)定對應(yīng)的拉針儀參數(shù)(Heat-280, Fil_3，Vel-30，Del-240, Pull_150)，將毛細(xì)管拉制成開口小于 5 μ m 的注 MffrfflJgff"^ (micro-pipette beveller, Sutter Instrument Co.) JgJf#i。 if 胎收集和準(zhǔn)備用人工強(qiáng)制蚊子產(chǎn)卵的方法收集埃及伊蚊(Aedes egypti)胚胎。準(zhǔn)備一只50ML離心管，轉(zhuǎn)移8個(gè)已血餐4天的母蚊子到一只50ML離心管(管底鋪上用水濕潤的棉球，棉球表面有濾紙覆蓋)，讓母蚊子產(chǎn)卵45分鐘。收集蚊卵，在解剖鏡下用5號小鑷子選取并排列大約50個(gè)灰色的蚊卵于濾紙上。蚊卵應(yīng)排列成一直的順序，即蚊卵的前極(鈍部)向左，后極(銳部)向右(見圖1)。轉(zhuǎn)移排列好的蚊卵到載玻片上，讓蚊卵在空氣中干燥約30秒后，用礦物油(Halocarbon 700)覆蓋玻片上的蚊卵，防止它們的進(jìn)一步干燥(見圖1)。胚胎注射用加樣槍頭在胚胎注射針頭中加入步驟1中制備好的含有沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的胚胎注射液，安裝針頭到顯微注射器(Marishige Scientific，JAPAN)，在顯微鏡(10X目鏡)下注射蚊卵。注射的位置是在蚊卵的后極(見圖1)。注射完成后，用小鑷子小心轉(zhuǎn)移注射后的蚊卵到濕潤的濾紙。保存注射后的蚊卵在80%相對濕度和27°C環(huán)境中，保存5-7天。3、轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選篩選、鑒定和擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株過程包括孵化胚胎注射后的蚊卵并培育獲得母成蟲(原代，GO)、獲取母成蟲與野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl)和在子代(第一代，Gl)中篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株。孵化胚胎注射后的蚊卵并培育獲得母成蟲(原代GO)采用缺氧環(huán)境誘導(dǎo)注射后蚊卵的孵化。注射后蚊卵放入盛有高壓滅菌過的蒸餾水的小杯中，把小杯放入抽氣負(fù)壓容器(-15inHg)中約一小時(shí)，一小時(shí)后檢查幼蟲個(gè)數(shù)并獲得孵化率(5% -8% )。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(80%相對濕度和27°C )中培育孵化的幼蟲至蛹，讓每個(gè)蛹在單獨(dú)環(huán)境中發(fā)育成成蟲以保證獲得處女母蚊(原代GO)。獲
7取的母成蟲(處女母蚊)與野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl 用處女母蚊與野生型的處女公蚊交配一周后，給予足量的血餐。血餐后按常規(guī)收集蚊卵，孵化蚊卵并培育至成蟲 (第一代，Gl))。在子代(第一代，Gl)中篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株待第一代(Gl)成蟲交配、血餐后，所有母蚊單獨(dú)產(chǎn)卵。提取產(chǎn)卵后的母蚊的卵巢，用PCR方法(采用Wiire Animal Tissue Direct PCR Kit和檢測沃爾巴克氏體(Wolbachia)表面蛋白基因的通用引物 81F 5' -TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 禾口 69IR 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA進(jìn)行PCR)找到轉(zhuǎn)染成功的蚊株。具體方法為解剖獲得待測的蚊的卵巢組織，放入 DNARelease Additive 的 STE 緩沖液(IOOmM NaCI, IOmM Tris HCI, ImM EDTA, PH8. 0)中， 550C 5分鐘，95°C 5分鐘后制備成待測樣品液備用。20 μ L體系PCR反應(yīng)液組成2X Phire Animal Tissue PCR Buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNA Polymerase 0.4卩1，胃弓| 物最終濃度各ο. 5 μ M，待測樣品液2 μ L，加滅菌蒸餾水至反應(yīng)體積20 μ L。PCR反應(yīng)條件 98 0C (5min) ；95 °C (5s), 55 °C (5s), 72 °C (20s)，35 個(gè)循環(huán)后，2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 結(jié)果，由此而獲得轉(zhuǎn)染成功的蚊株。實(shí)施例3 1、沃爾巴克氏體(Wolbachia)的獲取為將含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的庫蚊(Cx.pipiens molestus)采用解剖方法收集其卵巢，一次解剖多個(gè)庫蚊收集其卵巢，一次收集的庫蚊卵巢重大約50mg，收集后置于Iml的SPG緩沖液中。用杜恩斯組織勻漿器 (Dounce Tissue Grinder)破碎卵巢組織，卵巢組織通過杜恩斯組織勻漿器碾磨10次，每次 0. 5min，碾磨后的組織用0. 5ml的SPG緩沖液沖洗收集。收集液再置于離心機(jī)中離心lOOOg， 1分鐘，去除一些組織碎片。轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管后再次離心5000g，20分鐘。去除上清液，離心管中沉積物含有純化的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。再用50微升的SPG緩沖液溶解上述離心管中的沉積物后，再次離心，lOOOg，1分鐘，進(jìn)一步去除殘存的組織碎片防止它堵塞胚胎注射的針頭，得到上清液，上清液即為純化的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。此上清夜即可作為胚胎注射液用于轉(zhuǎn)染蚊子胚胎。2、胚胎注射用胚胎注射的方法使提取的沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子胚胎的過程包括胚胎注射針頭的制備、蚊子胚胎的收集和準(zhǔn)備和胚胎注射。胚胎注射針頭的制備采用毛細(xì)管(Quartz with filament, 0. D. 1. 0mm, I. D. :0.7mm)和拉針器(P2000 Micropipette puller, Sutter Instrument Co.)制備胚胎注射針頭。設(shè)定對應(yīng)的拉針儀參數(shù)(Heat-280, Fil_3，Vel-30，Del-240, Pull_150)，將毛細(xì)管拉制成開口小于 5 μ m 的注射針，用磨針器(micro-pipette beveller, Sutter Instrument Co.)磨開針頭。蚊子胚胎收集和準(zhǔn)備用人工強(qiáng)制蚊子產(chǎn)卵的方法收集白紋伊蚊(Aedes albopictus)胚胎。準(zhǔn)備一只 50ML離心管，轉(zhuǎn)移8個(gè)已血餐4天的母蚊子到一只50ML離心管(管底鋪上用水濕潤的棉球，棉球表面有濾紙覆蓋)，讓母蚊子產(chǎn)卵45分鐘。收集蚊卵，在解剖鏡下用5號小鑷子選取并排列大約50個(gè)灰色的蚊卵于濾紙上。蚊卵應(yīng)排列成一直的順序，即蚊卵的前極(鈍部)向左，后極(銳部)向右(見圖1)。轉(zhuǎn)移排列好的蚊卵到載玻片上，讓蚊卵在空氣中干燥約30秒后，用礦物油(Halocarbon 700)覆蓋玻片上的蚊卵，防止它們的進(jìn)一步干燥(見圖1)。胚胎注射用加樣槍頭在胚胎注射針頭中加入步驟1中制備好的含有沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的胚胎注射液，安裝針頭到顯微注射器(Marishige Scientific，JAPAN)，在顯微鏡(10X目鏡)下注射蚊卵。注射的位置是在蚊卵的后極(見圖1)。注射完成后，用小鑷子小心轉(zhuǎn)移注射后的蚊卵到濕潤的濾紙。保存注射后的蚊卵在80%相對濕度和27°C環(huán)境中，保存5-7天。 3、轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選篩選、鑒定和擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株過程包括孵化胚胎注射后的蚊卵并培育獲得母成蟲(原代，GO)、獲取母成蟲與野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl)和在子代(第一代，Gl)中篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株。孵化胚胎注射后的蚊卵并培育獲得母成蟲(原代GO)采用缺氧環(huán)境誘導(dǎo)注射后蚊卵的孵化。注射后蚊卵放入盛有高壓滅菌過的蒸餾水的小杯中，把小杯放入抽氣負(fù)壓容器(-15inHg)中約一小時(shí)，一小時(shí)后檢查幼蟲個(gè)數(shù)并獲得孵化率(5% -8% )。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(80%相對濕度和27°C )中培育孵化的幼蟲至蛹，讓每個(gè)蛹在單獨(dú)環(huán)境中發(fā)育成成蟲以保證獲得處女母蚊(原代GO)。 獲取的母成蟲(處女母蚊)與野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl 用處女母蚊與野生型的處女公蚊交配一周后，給予足量的血餐。血餐后按常規(guī)收集蚊卵，孵化蚊卵并培育至成蟲(第一代，Gl))。在子代(第一代，Gl)中篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)染成功的蚊株待第一代 (Gl)成蟲交配、血餐后，所有母蚊單獨(dú)產(chǎn)卵。提取產(chǎn)卵后的母蚊的卵巢，用PCR方法(采用Phire Animal Tissue Di rect PCR Kit和檢測沃爾巴克氏體(Wolbachia)的噬菌體 Bacteriophage locus (orf7)基因引物0rf7c_R 5' -TTGCTTGCTCAACACTTACACTT和 0rf7c_ F 5' -CCCACATGAGCCAATGAC GTCTG進(jìn)行PCR)找到轉(zhuǎn)染成功的蚊株。具體方法為解剖獲得待測的岐的卵巢組織，放入DNARelease Additive的STE緩沖液(IOOmM NaCI, IOmM Tris HCI，ImM EDTA, PH8. 0)中，55°C 5分鐘，95°C 5分鐘后制備成待測樣品液備用。20 μ L體系 PCR 反應(yīng)液組成2X Phire Animal Tissue PCR Buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNA Polymerase 0. 4 μ L，兩引物最終濃度各0. 5 μ M，待測樣品液2 μ L，加滅菌蒸餾水至反應(yīng)體 IR 20 μ L0 PCR 反應(yīng)條件98°C (5min) ；95°C (5s)，55°C (5s)，72°C (20s)，35 個(gè)循環(huán)后，2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果，由此而獲得轉(zhuǎn)染成功的蚊株。
權(quán)利要求
1.一種快速有效用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法，包括沃爾巴克氏體的獲取，胚胎注射和轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選，其特征在于所述的沃爾巴克氏體的獲取，包括以下步驟(1)昆蟲卵巢的制備解剖含有沃爾巴克氏體的昆蟲，獲得其卵巢，置于SPG緩沖液中；(2)將卵巢勻漿，用SPG緩沖液沖洗收集，然后置于離心機(jī)中離心IOOg lOOOg， Imin lOmin，取上清再離心5000g 15000g，5 20min，去除上清，沉積物再用SPG緩沖液沖懸，再離心IOOg lOOOg，Imin lOmin，取上清，即得到純化的沃爾巴克氏體，該純化的沃爾巴克氏體即可用于蚊子的胚胎注射；所述的轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選是將胚胎注射后的蚊卵培育獲得原代母成蟲、獲取的原代母成蟲與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代蚊株，從中篩選含有沃爾巴克氏體的陽性蚊株，由此篩選獲得的陽性蚊株即為轉(zhuǎn)染成功的蚊株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的含有沃爾巴克氏體的昆蟲包括天然或人工感染沃爾巴克氏體的昆蟲。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的含有沃爾巴克氏體的昆蟲為天然或人工感染沃爾巴克氏體的蚊子或果蠅。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的沃爾巴克氏體的獲取中步驟O)為將卵巢勻漿，用SPG緩沖液沖洗收集，然后置于離心機(jī)中離心，300g, 5min,取上清再離心12000g，lOmin,去除上清，沉積物再用SPG緩沖液沖懸，再離心300g，5min，取上清，即得到純化的沃爾巴克氏體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的從原代母成蟲與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代蚊株中篩選含有沃爾巴克氏體的陽性蚊株，其具體方法是提取第一代蚊株產(chǎn)卵后的母蚊的卵巢，應(yīng)用沃爾巴克氏體特征性基因引物進(jìn)行PCR找到轉(zhuǎn)染成功的蚊株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于， 所述的沃爾巴克氏體特征性基因引物為沃爾巴克氏體表面蛋白基因的通用引物81F 5' -TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 和 69IR 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA0
全文摘要
本發(fā)明公開一種快速有效地用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法。它是采用活體解剖的方法直接獲得含有沃爾巴克氏體的昆蟲卵巢組織(來源豐富，且容易獲取)，將其勻漿，再利用離心沉淀的方法使卵巢組織和沃爾巴克氏體分離，從而得到純化的、可用于胚胎注射轉(zhuǎn)染的沃爾巴克氏體。將該純化的沃爾巴克氏體經(jīng)常規(guī)方法注射轉(zhuǎn)染蚊子胚胎，卵培育獲得原代母成蟲(G0)、獲取原代母成蟲與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代(G1)蚊株從中篩選含有沃爾巴克氏體的陽性蚊株，由此篩選的陽性蚊株即為真正轉(zhuǎn)染成功的蚊株。因此本發(fā)明的用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法是一種快速有效的方法，本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)有利于迅速的建立轉(zhuǎn)染有沃爾巴克氏體的蚊株，從而有利于其大規(guī)模的應(yīng)用。
文檔編號A01K67/033GK102349473SQ201110230149
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者奚志勇, 朱儉 申請人:廣州沃巴克生物科技有限公司