專(zhuān)利名稱(chēng)：快速定量檢測(cè)蚊子組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的引物及其試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的引物及其試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
沃爾巴克氏體(Wolbachia)是廣泛分布于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的共生微生物，它可能是昆蟲(chóng)共生微生物中最為豐富的類(lèi)群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目等昆蟲(chóng)種類(lèi)中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩(wěn)定地存在于宿主的生殖細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)卵細(xì)胞傳遞給宿主子代，并可通過(guò)多種方式如細(xì)胞質(zhì)不親和、雌性化和殺雄性等調(diào)控宿主的生殖活動(dòng)。通過(guò)這些調(diào)控作用促進(jìn)其在宿主種群內(nèi)廣泛傳播。在沃爾巴克氏體(Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細(xì)胞質(zhì)不親和 (Cytoplasmic ^compatibility，Cl)是最常見(jiàn)的一種類(lèi)型。它表現(xiàn)為當(dāng)被沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類(lèi)Wolbachia的雌雄蚊交配時(shí)，精子和卵子結(jié)合后胚胎無(wú)法發(fā)育。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胞質(zhì)不親和的特性可導(dǎo)致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進(jìn)行種群壓制和種群替代。它的應(yīng)用對(duì)蚊媒病防治具有巨大的價(jià)值。近期研究發(fā)現(xiàn)，沃爾巴克氏體(Wolbachia) 不僅具有上述的特性外，同時(shí)它還能在蚊子體內(nèi)與蚊子攜帶的一些重要的病原生物(如登革病毒，瘧原蟲(chóng)等)相互作用，抑制它們?cè)谖米芋w內(nèi)的增值和擴(kuò)散從而在阻斷這些病原生物傳播于人類(lèi)。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的這種抑制作用與它在蚊子體內(nèi)組織的分布相關(guān)，所以，了解沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子體內(nèi)組織分布有助于快速篩選出傳播阻斷效果最好的沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的蚊子，也有助于監(jiān)測(cè)沃爾巴克氏體 (Wolbachia)在蚊群中的垂直傳播，同時(shí)也有利于高效率地監(jiān)測(cè)大規(guī)模大地域范圍的沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子組織中的感染情況。目前，在蚊子體內(nèi)組織中檢測(cè)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的方法以采用針對(duì)沃爾巴克氏體(Wolbachia)表面蛋白的抗體進(jìn)行Wfestern-blotting來(lái)檢測(cè)。此方法需要有沃爾巴克氏體(Wolbachia)表面蛋白的抗體，這種抗體還沒(méi)有商業(yè)化，需要實(shí)驗(yàn)室自己制備。 制備抗體不僅耗費(fèi)也耗時(shí)，一般制備特異性不高的抗體(多克隆抗體)最少需要2-3月，若要制備特異性高的抗體(單克隆抗體)需要時(shí)間更長(zhǎng)。同時(shí)，這種檢測(cè)條件限制很強(qiáng)，不能同時(shí)檢測(cè)多樣品，因而不能進(jìn)行大批量檢測(cè)。另外，此方法最大的缺點(diǎn)在于它不能對(duì)沃爾巴克氏體(Wolbachia)進(jìn)行定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的 Real-time PCR 引物。本發(fā)明首先分離獲取含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的不同組織，提取沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組DNA ；采用沃爾巴克氏體(Wolbachia)特異性的PCR引物對(duì)沃爾巴克氏體(Wolt3aChia)DNA進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明的快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的Real-time PCR引物，其特征在于，包括根據(jù)蚊子的看家基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物和根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物。所述的蚊子的看家基因優(yōu)選為核糖體S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的特異性基因優(yōu)選為表面蛋白(WSP)基因。優(yōu)選，所述的根據(jù)核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，當(dāng)蚊子為埃及伊蚊時(shí)，其引物序列為RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG和RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC ；或當(dāng)蚊子為斯氏按蚊(Anopheles stephensi)時(shí)，其引物序列為 Asr ps6-RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，其引物序列為 Wb-RTF :ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體 (ffolbachi a)的Real-time PCR試劑盒，包括內(nèi)參引物、檢測(cè)引物和Real-time PCR常規(guī)試劑，其特征在于，所述的內(nèi)參引物是根據(jù)蚊子的看家基因設(shè)計(jì)的引物，所述的檢測(cè)引物是根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因設(shè)計(jì)的引物。所述的蚊子的看家基因優(yōu)選為核糖體S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的特異性基因優(yōu)選為沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因。優(yōu)選，所述的根據(jù)核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，當(dāng)蚊子為埃及伊蚊時(shí)，其引物序列為RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG和RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,當(dāng)蚊子為斯氏按蚊(Anopheles stephensi)時(shí)，其引物序列為 Asrps6-RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，其引物序列為 Wb-RTF :ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的方法，其特征在于，包括以下步驟獲取蚊子的組織，提取組織中的DNA，以根據(jù)蚊子的看家基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，按照常規(guī)的Real-time PCR方法對(duì)蚊子組織中的沃爾巴克氏體(Wolbachia)進(jìn)行定性定量分析。所述的蚊子的看家基因優(yōu)選為核糖體S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的特異性基因?yàn)槲譅柊涂耸象w(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因。優(yōu)選，所述的根據(jù)核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，當(dāng)蚊子為埃及伊蚊時(shí)，其引物序列為RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG和RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,當(dāng)蚊子為斯氏按蚊(Anopheles stephensi)時(shí)，其引物序列為 Asrps6-RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，其引物序列為 Wb-RTF :ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。本發(fā)明避開(kāi)了對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的沃爾巴克氏體(Wolbachia)特異性抗體的依賴(lài)，在基因水平上進(jìn)行檢測(cè)。本方法能對(duì)不同的組織中的沃爾巴克氏體(Wolbachia)進(jìn)行快速高效率的定量分析，這是現(xiàn)有的方法所不能比擬的。整個(gè)方法操作簡(jiǎn)便，可控性強(qiáng)，非常容易在很短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量的含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的組織樣品，從而節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用，提高的工作效率。本發(fā)明的這一特性對(duì)于高效快速大規(guī)模地監(jiān)測(cè)大地域范圍的沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子組織中的分布具有巨大價(jià)值。因此本發(fā)明利用本發(fā)明的引物和試劑盒，采用Real-time PCR定量檢測(cè)蚊子組織中沃巴克氏體(Wolbachia)的方法是一種快速高效率的方法，本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)有利于大量、 迅速地定量分析含沃巴克氏體(Wolbachia)的組織樣品，從而使我們能方便地大規(guī)模監(jiān)測(cè)大地域范圍的沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子組織中的分布。


圖1為人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的埃及伊蚊的中腸、唾液腺、卵巢組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的定量測(cè)定結(jié)果；圖2為對(duì)人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的中腸、唾液腺、卵巢、脂肪體和睪丸組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的定量測(cè)定結(jié)果，其中S為唾液腺，M為中腸，O為卵巢，F(xiàn)為脂肪體，T為睪丸；圖3為定量監(jiān)測(cè)不同代系中沃爾巴克氏體(Wolbachia)在人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)組織分布，其中S為唾液腺，M為中腸，O為卵巢，F(xiàn)為脂肪體，T為睪丸，G7為第7代，G9為第9代，Gll為第11代。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 對(duì)人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的埃及伊蚊的中腸、唾液腺、卵巢組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的定量測(cè)定1、含沃爾巴克氏體(Wolbachia)的蚊子組織樣本的獲取用CO2麻醉待測(cè)蚊子(人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的埃及伊蚊)，在解剖鏡下用針頭解剖分離待測(cè)的蚊子組織(中腸、唾液腺、卵巢)，用STE緩沖液漂洗分離組織3次后置于50 μ LSTE緩沖液中。 所述的STE緩沖液屬于現(xiàn)有技術(shù)的緩沖液，其配方為IOOmM NaCl, IOmM Tris-Cl,pH 8. O和 ImM EDTA, ρΗ 8. O。2、組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組的提取將含有蚊子組織的50 μ LSTE 緩沖液置于勻漿器中，碾磨大約45秒后加入2μ L蛋白激酶!((Proteinase K) (10mg/mL), 置反應(yīng)液于30分鐘，隨后置反應(yīng)液于95°C 5分鐘終止反應(yīng)，將其作為待測(cè)樣品基因組 DNA。3、Real-time PCR對(duì)沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組DNA的定量測(cè)定分別克隆內(nèi)參照基因和沃爾巴克氏體(Wolbachia)特異性基因的一段序列，制備Real-time PCR 定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用埃及伊蚊(Ae. Aegypti)的核糖體S6蛋白(rpS6)基因作為內(nèi)參照，沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白基因作為檢測(cè)目標(biāo)基因。分別提取埃及伊蚊(Ae. Aegypti)的基因組和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的基因組。根據(jù)的核糖體S6 蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)克隆引物 HindIII-RPS6S-F :GATAAGCTTTCGTACCGGAGAGCGCAAGCGTAAG(SEQ ID NO. 1 所示)和 BglII-RPS6S_R :GATAGATCTTGGCGCAGCCTTCTTCTCGACCTTC(SE Q ID NO. 2所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的片段純化后用HindIII和BglII酶切后定向克隆入PSL1180質(zhì)粒中。根據(jù)的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)克隆引物 BioI-WbF :ATCTCGAGACATTTGCTCCAACAACTG(SEQ ID NO. 3 所示)和 XbaI-WbR CTTCTAGAAACTGCACTAGCTTCTG (SEQ ID NO. 4所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的片段純化后用 XhoI和^CbaI酶切后定向克隆入pSL1180質(zhì)粒中。測(cè)序鑒定克隆的序列正確。根據(jù)的核糖體 S6 蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì) Real-time PCR 弓丨物，RPS6-RTF :CGTCGTCAGGAACGTATCCG(SEQ ID NO. 5 所示)和 RPS6-RTR :TCTTGGCAGCCTTAGCAGC(SEQ ID NO. 6 所示)；根據(jù)的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，(SEQ ID NO. 4所示) Wb-RTF :ACATTTGCTCCAACAACTG (SEQ ID NO. 7 所示)和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG(SEQ ID NO. 8所示)。計(jì)算上述克隆得到的埃及伊蚊的核糖體S6蛋白(rpS6)基因克隆和沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因克隆的拷貝數(shù)，并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蕴荻认♂尩陌＜耙廖玫暮颂求wS6蛋白(rpS6)基因和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因分別作為模板。在熒光定量PCR管中加入10 μ mol/L forward和reverse引物(RPS6-RTF和 RPS6-RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4 μ L、生物用水 8. 2 μ L 和 STOR Green Realtime PCR Master Mix IOyL0各反應(yīng)管中加入模板基因組DNA (核糖體S6蛋白(rpS6)基因克?。换虮砻娴鞍?WSP)基因克隆)各lyL，總反應(yīng)體系為20 μ L，每個(gè)樣品重復(fù)3次。完成上述步驟后，把加好樣品的熒光定量PCR反應(yīng)管放在real-time quantity PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性15分鐘；95 °C變性15秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。 數(shù)據(jù)讀取由熒光定量PCR儀自動(dòng)完成，由此制作好標(biāo)準(zhǔn)曲線。在熒光定量PCR管中加入10 μ mol/L forward和reverse弓丨物(RPS6-RTF和 RPS6-RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4μ L、生物用水 8. 2μ L 和 STOR Green Realtime PCR Master MixlO μ L。各反應(yīng)管中加入待測(cè)樣品基因組DNA各1 μ L，總反應(yīng)體系為20 μ L， 每個(gè)樣品重復(fù)3次。完成上述步驟后，把加好樣品的熒光定量PCR反應(yīng)管放在real-time quantity PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性15分鐘；95°C變性15秒，55°C退火 30秒，72 °C延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)讀取由熒光定量PCR儀自動(dòng)完成。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出具體的待測(cè)樣品中內(nèi)參照基因和目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，用內(nèi)參照基因的拷貝數(shù)對(duì)目標(biāo)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最終結(jié)果定量測(cè)定結(jié)果以目標(biāo)基因拷貝數(shù)/內(nèi)參照基因拷貝數(shù)表示。結(jié)果如圖1所示卵巢、中腸和唾液腺中都可檢測(cè)到沃爾巴克氏體(Wolbachia)的存在，其中以卵巢中沃爾巴克氏體(Wolbachia)最為豐富，約 85ffolbachia/rps6。實(shí)施例2 對(duì)人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的中腸、唾液腺、卵巢、脂肪體和睪丸組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的定量測(cè)定1、含沃爾巴克氏體(Wolbachia)的蚊子組織樣本的獲取用CO2麻醉待測(cè)蚊子(人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的斯氏按蚊)，在解剖鏡下用針頭解剖分離待測(cè)的蚊子組織(中腸、唾液腺、卵巢、脂肪體和睪丸)，用STE緩沖液漂洗分離組織3次后置于50 μ L STE緩沖液中。所述的STE緩沖液屬于現(xiàn)有技術(shù)的緩沖液，其配方為IOOmM NaCl, IOmM TrisCl,pH 8.0 禾口 ImM EDTA，pH 8.0。2、組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組的提取將含有蚊子組織的50 μ LSTE 緩沖液置于勻漿器中，碾磨大約45秒后加入2 μ L蛋白激酶K (Proteinase K) (10mg/mL)，置反應(yīng)液于55°C 30分鐘，隨后置反應(yīng)液于95°C 5分鐘終止反應(yīng)，作為待測(cè)樣品基因組DNA。3,Real-time PCR對(duì)沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組DNA的定量測(cè)定分別克隆內(nèi)參照基因和沃爾巴克氏體(Wolbachia)特異性基因的一段序列，制備Real-time PCR定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖體S6蛋白(rpS6)基因作為內(nèi)參照，沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白基因作為檢測(cè)目標(biāo)基因。分別提取斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的基因組和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的基因組。根據(jù)的的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)克隆引物As rps6_F ACGACCACAAGCTGCGTCAC (SEQ ID N0. 9 所示)，As rps6_R :GTCAGCACACCCTGCTTCATG (SEQ ID NO. 10所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的片段純化A-T克隆入pGEM -T Easy Vector質(zhì)粒中。根據(jù)的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)克隆引物 XhoI-WbF :ATCTCGAGACATTTGCTCCAACAACTG 和 XbaI-WbR CTTCTAGAAACTGCACTAGCTTCTG 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的片段純化后用BioI和^CbaI酶切后定向克隆入PSL1180質(zhì)粒中。 測(cè)序鑒定克隆的序列正確。根據(jù)的核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，Asrps6-RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC, Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；根據(jù)的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)Real-time PCR弓丨物，Wb-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。計(jì)算上述克隆得到的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖體S6蛋白(rpS6) 基因克隆和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因克隆的拷貝數(shù)，并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蕴荻认♂尩乃故习次?Anopheles stephensi)的核糖體S6蛋白(rpS6)基因和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因分別作為模板。在熒光定量PCR管中加入 10 μ mol/L forward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6_RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4 μ L、生物用水 8· 2μ L和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10yL。各反應(yīng)管中加入模板基因組DNA(核糖體S6蛋白(rpS6)基因克?。换虮砻娴鞍?WSP)基因克隆)各 1 μ L，總反應(yīng)體系為20 μ L，每個(gè)樣品重復(fù)3次。完成上述步驟后，把加好樣品的熒光定量 PCR反應(yīng)管放在real-time quantity PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性15分鐘；95°C變性15秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)讀取由熒光定量PCR 儀自動(dòng)完成，由此制作好標(biāo)準(zhǔn)曲線。在熒光定量PCR 管中加入 10 μ mol/L forward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6-RTR ；或Wb-RTF和Wb-RTR)各0. 4μ L、生物用水8. 2μ L和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix IOyL0各反應(yīng)管中加入待測(cè)樣品基因組DNA各1 μ L，總反應(yīng)體系為20 μ L， 每個(gè)樣品重復(fù)3次。完成上述步驟后，把加好樣品的熒光定量PCR反應(yīng)管放在real-time quantity PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性15分鐘；95°C變性15秒，55°C退火 30秒，72 °C延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)讀取由熒光定量PCR儀自動(dòng)完成。根據(jù)內(nèi)參照和目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品的內(nèi)參照基因和目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，用內(nèi)參照基因的拷貝數(shù)對(duì)目標(biāo)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最終結(jié)果定量測(cè)定結(jié)果以目標(biāo)基因拷貝數(shù)/內(nèi)參照基因拷貝數(shù)表示。結(jié)果見(jiàn)圖2所示在唾液腺、中腸、卵巢、脂肪體和睪丸中都可檢測(cè)到沃爾巴克氏體(Wolbachia)的存在，其中以睪丸中沃爾巴克氏體 (Wolbachia)最為豐富，約 20Wolbachia/rps6。實(shí)施例3 定量監(jiān)測(cè)不同代系中沃爾巴克氏體(Wolbachia)在人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)組織分布1、含沃爾巴克氏體(Wolbachia)的蚊子組織樣本的獲取用(X)2麻醉待測(cè)蚊子 (不同代系的人工轉(zhuǎn)染B型沃爾巴克氏體(Wolbachia)的斯氏按蚊)，在解剖鏡下用針頭解剖分離待測(cè)的蚊子組織(中腸、唾液腺、卵巢、脂肪體和睪丸)，用STE緩沖液漂洗分離組織3次后置于50 μ L STE緩沖液中。所述的STE緩沖液屬于現(xiàn)有技術(shù)的緩沖液，其配方為 IOOmMNaCl，IOmM Tris Cl,pH 8. O 禾口 ImM EDTA, ρΗ 8. O。2、組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組的提取將含有蚊子組織的50 μ L STE緩沖液置于勻漿器中，碾磨大約45秒后加入2μ L蛋白激酶!((Proteinase K) (lOmg/ mL)，置反應(yīng)液于55°C 30分鐘，隨后置反應(yīng)液于95°C 5分鐘終止反應(yīng)，作為待測(cè)樣品基因組 DNA。3,Real-time PCR對(duì)沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組DNA的定量測(cè)定分別克隆內(nèi)參照基因和沃爾巴克氏體(Wolbachia)特異性基因的一段序列，制備Real-time PCR定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖體S6蛋白(rpS6)基因作為內(nèi)參照，沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白基因作為檢測(cè)目標(biāo)基因。分別提取斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的基因組和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的基因組。根據(jù)的的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)克隆引物As rps6_F ACGACCACAAGCTGCGTCAC, As rps6_R GTCAGCACACCCTGCTTCATG 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的片段純化A-T克隆入pGEM -T Easy Vector質(zhì)粒中。根據(jù)的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)克隆引物 XhoI-WbF :ATCTCGAGACATTTGCTCCAACAACTG 和 XbaI-WbR CTTCTAGAAACTGCACTAGCTTCTG 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的片段純化后用BioI和^CbaI酶切后定向克隆入PSL1180質(zhì)粒中。 測(cè)序鑒定克隆的序列正確。根據(jù)的核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，Asrps6-RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC, Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；根據(jù)的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)Real-time PCR弓丨物，Wb-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。計(jì)算上述克隆得到的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖體S6蛋白(rpS6) 基因克隆和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因克隆的拷貝數(shù)，并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蕴荻认♂尩乃故习次?Anopheles stephensi)的核糖體S6蛋白(rpS6)基因和沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因分別作為模板。在熒光定量PCR管中加入 10 μ mo 1/Lforward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6_RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4 μ L、生物用水 8· 2μ L 和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μ L。各反應(yīng)管中加入模板基因組DNA(核糖體S6蛋白(rpS6)基因克??；或表面蛋白(WSP)基因克隆)各 1 μ L，總反應(yīng)體系為20 μ L，每個(gè)樣品重復(fù)3次。完成上述步驟后，把加好樣品的熒光定量 PCR反應(yīng)管放在real-time quantity PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性15分鐘；95°C變性15秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)讀取由熒光定量PCR儀自動(dòng)完成，由此制作好標(biāo)準(zhǔn)曲線。在熒光定量PCR 管中加入 ΙΟμπιοΙ/L forward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6-RTR ；或Wb-RTF和Wb-RTR)各0. 4μ L、生物用水8. 2μ L和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix IOyL0各反應(yīng)管中加入待測(cè)樣品基因組DNA各1 μ L，總反應(yīng)體系為20 μ L， 每個(gè)樣品重復(fù)3次。完成上述步驟后，把加好樣品的熒光定量PCR反應(yīng)管放在real-time quantity PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性15分鐘；95°C變性15秒，55°C退火 30秒，72 °C延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)讀取由熒光定量PCR儀自動(dòng)完成。根據(jù)內(nèi)參照和目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品的內(nèi)參照基因和目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，用內(nèi)參照基因的拷貝數(shù)對(duì)目標(biāo)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最終結(jié)果定量測(cè)定結(jié)果以目標(biāo)基因拷貝數(shù)/內(nèi)參照基因拷貝數(shù)表示。結(jié)果見(jiàn)圖3 沃爾巴克氏體(Wolbachia)的存在于連續(xù)的代系的卵巢、中腸、唾液腺、脂肪體和睪丸中，脂肪體中沃爾巴克氏體(Wolbachia) 隨著代系的增加有增加的趨勢(shì)，而睪丸中沃爾巴克氏體(Wolbachia)隨代系的增加有減少的趨勢(shì)。綜上所述，利用本發(fā)明的引物和試劑盒，采用Real-time PCR定量檢測(cè)，能夠快速有效的檢測(cè)到蚊子組織中沃巴克氏體(Wolbachia)的存在。
權(quán)利要求
1.一種快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的Real-time PCR引物，其特征在于，包括根據(jù)蚊子的看家基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物和根據(jù)沃爾巴克氏體 (Wolbachia)的特異性基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Real-timePCR引物，其特征在于，所述的蚊子的看家基因?yàn)楹颂求wS6蛋白(rpS6)基因，所述的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因?yàn)楸砻娴鞍?(WSP)基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Real-timePCR引物，其特征在于，所述的根據(jù)核糖體 S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，當(dāng)蚊子為埃及伊蚊時(shí)，其引物序列為 RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG 和 RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC ；或當(dāng)蚊子為斯氏按蚊(Anopheles stephensi)時(shí)，其引物序列為 Asrps6_RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC， Asrps6-RTR :GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，其引物序列為恥-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。
4.一種快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的Real-time PCR試劑盒，包括內(nèi)參引物、檢測(cè)引物和Real-time PCR常規(guī)試劑，其特征在于，所述的內(nèi)參引物是根據(jù)蚊子的看家基因設(shè)計(jì)的引物，所述的檢測(cè)引物是根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因設(shè)計(jì)的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Real-timePCR試劑盒，其特征在于，所述的蚊子的看家基因?yàn)楹颂求wS6蛋白(rpS6)基因，所述的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因?yàn)槲譅柊涂耸象w(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Real-timePCR試劑盒，其特征在于，所述的根據(jù)核糖體S6蛋白(rpS6)基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，當(dāng)蚊子為埃及伊蚊時(shí)，其引物序列為 RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG 和 RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,當(dāng)蚊子為斯氏按蚊(Anopheles stephensi)時(shí)，其引物序列為 Asrps6_RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC, Asrps6-RTR :GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，其引物序列為恥-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。
7.一種快速定量檢測(cè)蚊子體內(nèi)組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的方法，其特征在于，包括以下步驟獲取蚊子的組織，提取組織中的DNA，以根據(jù)蚊子的看家基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，按照常規(guī)的Real-time PCR方法對(duì)蚊子組織中的沃爾巴克氏體(Wolbachia)進(jìn)行定性定量分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的蚊子的看家基因?yàn)楹颂求wS6 蛋白(rpS6)基因，所述的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因?yàn)槲譅柊涂耸象w (Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的根據(jù)核糖體S6蛋白(rpS6) 基因設(shè)計(jì)的引物作為內(nèi)參引物，當(dāng)蚊子為埃及伊蚊時(shí)，其引物序列為RPS6-RTF: CGTCGTCAGGAACGTATCCG 和 RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,當(dāng)岐子為斯氏按岐 (Anopheles stephensi)時(shí)，其引物序列為 Asrps6_RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR :GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根據(jù)沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設(shè)計(jì)的引物作為檢測(cè)引物，其引物序列為恥-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速定量檢測(cè)蚊子組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的引物及其試劑盒和方法。本發(fā)明首先分離獲取含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的不同組織，提取沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組DNA；采用沃爾巴克氏體(Wolbachia)特異性的PCR引物對(duì)沃爾巴克氏體(Wolbachia)DNA進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)有利于大量、迅速地定量分析含沃巴克氏體(Wolbachia)的組織樣品，從而使我們能方便地大規(guī)模監(jiān)測(cè)大地域范圍的沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子組織中的分布。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102382898SQ20111040491
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者奚志勇, 朱儉 申請(qǐng)人:廣州沃巴克生物科技有限公司