。
[0023]本發(fā)明的有益技術(shù)效果:本發(fā)明的技術(shù)可以精確地特異性調(diào)控下丘腦的SFl神經(jīng)元，可以有效的影響骨代謝，從而可進(jìn)一步為骨代謝疾病的發(fā)病機(jī)制及治療的研宄提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要意義。
【附圖說明】
[0024]圖1:下丘腦VMH中的SFl神經(jīng)元。
[0025]圖2:構(gòu)建攜帶光基因的病毒載體成功感染SFl神經(jīng)元。
[0026]圖3:黃光光刺激SFl神經(jīng)元，持續(xù)黃光刺激可以顯著降低SFl神經(jīng)元的動(dòng)作電位。
[0027]圖4:通過光纖對(duì)VMH腦區(qū)進(jìn)行光照。
[0028]圖5:通過顯微CT對(duì)小鼠脛骨上端進(jìn)行骨密度評(píng)估。
[0029]圖6:在體光調(diào)控SFl神經(jīng)元活性后骨密度顯著下降。
[0030]圖7:光調(diào)控下丘腦的神經(jīng)元后間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化發(fā)生改變。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0032]以下實(shí)施例中，所用原始試劑和材料均可商購獲得，或可按照現(xiàn)有技術(shù)的記載制備得到。
[0033]實(shí)施例1
[0034]本實(shí)施例的方案主要包含下述幾個(gè)方面:1)構(gòu)建攜帶光感基因的病毒載體并感染下丘腦的SFl神經(jīng)元；2)利用595nm的黃光刺激SFl神經(jīng)元并記錄光電流，從而驗(yàn)證光基因?qū)Fl神經(jīng)元的動(dòng)作電位的抑制作用；3)通過在體光刺激的方法研宄調(diào)控SFl神經(jīng)元的活性后對(duì)骨代謝的調(diào)控作用；4)利用小鼠模型，通過在體特定頻率的影響神經(jīng)元的活性，來評(píng)估對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)病進(jìn)程的影響；5)利用間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化系統(tǒng)，評(píng)估調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化進(jìn)程的影響。以下分別加以詳細(xì)說明。
[0035]I)構(gòu)建攜帶光基因的病毒載體并感染SFl神經(jīng)元
[0036]將攜帶光感基因的載體(NpHR質(zhì)粒)、綠色熒光基因(GFP)和SFl神經(jīng)元特異性的啟動(dòng)子質(zhì)粒(SFl啟動(dòng)子，Invitrogen公司產(chǎn)品)，和慢病毒包裝的質(zhì)粒pCMV Λ R8.74、pMD2.G.(1.5 μ g) 一起，利用脂質(zhì)體(Invitrogen公司產(chǎn)品)一起轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞(ATCC公司產(chǎn)品，該細(xì)胞傳代至25代后即需要更換新的一批細(xì)胞株)中(每200，000個(gè)細(xì)胞用6mg/L脂質(zhì)體)，24hr后用含有5mM丙酮酸鈉的DMEM替代原293FT細(xì)胞的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，16小時(shí)后，利用超速離心機(jī)在50，OOOg速度下破膜，將懸液通過20%的蔗糖濾柱，收集上清。該病毒滴度能達(dá)3 X 108TU/mL以上，產(chǎn)出的病毒顆粒以滅菌的磷酸鹽緩沖液以1:1000的體積比進(jìn)行重懸。將獲取的病毒按1:400的體積比混入無血清DMEM中，用于感染目標(biāo)細(xì)胞:下丘腦的SFl神經(jīng)元。具體操作為:將病毒載體和下丘腦的SFl神經(jīng)元混合。6小時(shí)后，將含病毒的培養(yǎng)液換成新鮮含有10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)-72小時(shí)；放到顯微鏡下觀察，如果80%左右的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的標(biāo)記蛋白，可初步證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。
[0037]下丘腦VMH中的SFl神經(jīng)元參見圖1。攜帶光基因的病毒載體感染SFl神經(jīng)元的結(jié)果可參見圖2，反映VMH中的SFl神經(jīng)元被光感基因標(biāo)記，轉(zhuǎn)染成功。
[0038]2)以膜片鉗技術(shù)對(duì)SFl神經(jīng)元表達(dá)的光敏通道蛋白的進(jìn)行功能驗(yàn)證。
[0039]采用一套激光刺激系統(tǒng)(上海光源)對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行黃光刺激，黃光波長595nmnm，光強(qiáng)1.1mW左右；光刺激的相關(guān)參數(shù)為50ms每次，間隔50ms，占空比1:1，光照頻率1Hz ο
[0040]以電壓鉗的形式記錄相關(guān)由光所誘發(fā)的內(nèi)向光電流，結(jié)果參見圖3，表明在特定的黃光光刺激SFl神經(jīng)元條件下，可以顯著降低SFl神經(jīng)元的動(dòng)作電位，可以確認(rèn)光敏型SFl神經(jīng)元被光特異性地改變了興奮性。
[0041]3)利用光基因載體對(duì)在體的SFl神經(jīng)元進(jìn)行活性調(diào)節(jié)，在對(duì)應(yīng)位置植入直徑200 μπι的光纖(參見圖4)，然后通過黃光刺激在體下丘腦中的SFl神經(jīng)元，黃光波長595nm，光照的平均強(qiáng)度為10mW/mm2，光照頻率10Hz，每周照射3次，每次約15min，共持續(xù)三周，三周之后通過顯微CT對(duì)骨密度進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估。
[0042]過顯微CT對(duì)小鼠脛骨上端進(jìn)行骨密度評(píng)估的結(jié)果參見圖5，小鼠骨密度變化見圖6，從圖中顯示，光調(diào)控組的骨小梁變的稀疏，骨實(shí)質(zhì)部分減少，反映小鼠骨代謝被調(diào)控。
[0043]4)通過光調(diào)控影響SFl神經(jīng)元的活性，通過MicroCT檢測骨密度，對(duì)骨密度進(jìn)行評(píng)估和三維重建，結(jié)果參見圖6。
[0044]結(jié)果顯示，在體光調(diào)控SFl神經(jīng)元活性后，小鼠SFl神經(jīng)元活性被抑制，骨密度顯著降低。
[0045]5)通過光調(diào)控下丘腦的SFl神經(jīng)元，分析小鼠骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化指標(biāo)，結(jié)果參見圖7，顯示光調(diào)控下丘腦的神經(jīng)元后間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化發(fā)生改變，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化降低。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物，該組合物包括: 用于感染SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中包括啟動(dòng)子、光感基因、綠色熒光標(biāo)記基因，其中，所述啟動(dòng)子為留體類神經(jīng)元啟動(dòng)子； 能產(chǎn)生黃光的光照裝置，用于對(duì)感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，該組合物還包括: 使所述攜帶光感基因的病毒載體感染SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的試劑材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述藍(lán)光為波長550?595nm的黃光，優(yōu)選為波長595nm的黃光。
4.權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的組合物在制備骨代謝調(diào)控系統(tǒng)中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述骨代謝調(diào)控系統(tǒng)是利用所述的組合物中的攜帶光感基因的病毒載體感染下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞，并通過光照裝置對(duì)感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，以調(diào)控骨代謝。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述骨代謝調(diào)控系統(tǒng)是用于對(duì)離體的感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，黃光光照條件為:黃光波長595nm，光強(qiáng)I?5mW ;光刺激的相關(guān)參數(shù)為25?50ms每次，間隔25?50ms，占空比1:1，光照頻率10?20Hzo
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述骨代謝調(diào)控系統(tǒng)是用于對(duì)在體的感染后的下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，該系統(tǒng)還包括用于將黃光傳導(dǎo)至感染后的下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞的光纖，所述光纖直徑200 μ m，黃光光照條件為:黃光波長595nm，光照的平均強(qiáng)度為10?20mW/mm2，光照頻率10?20Hz，每周照射2?4次，每次10?20min，共持續(xù)2?4周。
8.一種骨代謝調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的組合物。
9.權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的組合物或權(quán)利要求8所述的骨代謝調(diào)控系統(tǒng)在建立由下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞活性改變而導(dǎo)致骨密度降低和/或間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化降低的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械膽?yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述組合物或骨代謝調(diào)控系統(tǒng)是通過對(duì)感染后的下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，降低SFl神經(jīng)元的動(dòng)作電位，而建立骨密度降低和/或間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化降低的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異性調(diào)控下丘腦SF1神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物及其應(yīng)用，通過光感基因調(diào)控技術(shù)特異性調(diào)控下丘腦SF1神經(jīng)元活性以影響骨代謝。本發(fā)明所述的特異性調(diào)控下丘腦SF1神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物包括：用于感染SF1神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中包括啟動(dòng)子、光感基因、綠色熒光標(biāo)記基因，其中，所述啟動(dòng)子為甾體類神經(jīng)元啟動(dòng)子；能產(chǎn)生黃光的光照裝置，用于對(duì)感染后的SF1神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性。本發(fā)明的技術(shù)可以精確地特異性調(diào)控下丘腦的SF1神經(jīng)元，可以有效的影響骨代謝。
【IPC分類】A01K67-027, C12N15-86, C12N5-10, C12N13-00
【公開號(hào)】CN104561097
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410855329
【發(fā)明人】楊帆, 劉運(yùn)輝, 屠潔, 王立平
【申請(qǐng)人】深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日