特異性調(diào)控下丘腦sf1神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物及其應(yīng)用，通過(guò)光感基因調(diào)控技術(shù)特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性以影響骨代謝。
【背景技術(shù)】
[0002]骨質(zhì)疏松、糖尿病、甲亢等代謝性和內(nèi)分泌疾病是導(dǎo)致病人代謝功能障礙和嚴(yán)重影響人類健康的重要疾病。隨著我國(guó)民眾生活方式的轉(zhuǎn)變和老齡化的加速，這類疾病的發(fā)病率正在快速上升。同機(jī)體的其他代謝相比，骨代謝是非常依賴能量的代謝進(jìn)程。骨生長(zhǎng)期能量的匱乏會(huì)嚴(yán)重影響骨的生長(zhǎng)；而成人期的能量代謝不平衡也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松疾病。
[0003]多項(xiàng)基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研宄進(jìn)一步驗(yàn)證了骨代謝與中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在密切關(guān)系。下丘腦中的神經(jīng)核團(tuán)-腹內(nèi)側(cè)核(VMH)在能量代謝和骨代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中的作用非常重要。SFl神經(jīng)元(留體類神經(jīng)元)是VMH中一類重要神經(jīng)元，表達(dá)若干代謝相關(guān)神經(jīng)肽類激素和生長(zhǎng)因子的受體，在維持機(jī)體代謝平衡重發(fā)揮重要作用。損傷VMH核團(tuán)中的神經(jīng)元(主要為SFl神經(jīng)元)后骨量明顯增多；激活SFl神經(jīng)元中的I印tin通路后可導(dǎo)致小鼠骨量減少，而能量代謝未發(fā)生明顯變化，提示了 SFl神經(jīng)元可能通過(guò)不同于能量代謝的調(diào)控機(jī)制來(lái)影響骨代謝。較早期的研宄已證明VMH核團(tuán)為“飽食中樞”，通過(guò)物理?yè)p毀和遺傳干擾VMH的正常功能均會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物肥胖，而VMH核團(tuán)神經(jīng)元自身代謝和生長(zhǎng)因子水平也可以直接調(diào)控動(dòng)物的攝食行為和能量代謝穩(wěn)態(tài)，在SF-1神經(jīng)元選擇性敲除胰島素受體(IR)則可以降低胰島素激活的磷脂酰肌醇通路，避免由于飲食所導(dǎo)致的肥胖和糖耐受損傷。在SF-1神經(jīng)元特異性敲除雌激素受體(ER-α )可以導(dǎo)致動(dòng)物肥胖和代謝降低，提示SF-1神經(jīng)元可以通過(guò)雌激素受體維持機(jī)體正常能量代謝和脂肪分布。在骨代謝方面選擇性在神經(jīng)元敲除I印tin受體的小鼠卻出現(xiàn)骨量明顯增多，激活I(lǐng)印tin通路后可導(dǎo)致小鼠骨量減少而能量代謝未發(fā)生明顯變化。
[0004]目前對(duì)下丘腦腹內(nèi)側(cè)核SFl神經(jīng)元進(jìn)行的調(diào)控的主要手段是通過(guò)基因操作或化學(xué)藥物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)藥物的方法缺乏空間和組織的特異性，在刺激SFl神經(jīng)元的同時(shí)也會(huì)刺激到其他正常細(xì)胞，如神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，這樣會(huì)導(dǎo)致一些對(duì)正常細(xì)胞不利的副作用或損傷作用；另外通過(guò)基因敲入或敲除后，對(duì)SFl神經(jīng)元的影響在時(shí)間上不具有精確的可操控性。
[0005]為了選擇性地對(duì)骨代謝的活動(dòng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，現(xiàn)在亟需一種可以在體特異性調(diào)控SFl神經(jīng)元活性的方法。
[0006]光感基因調(diào)控技術(shù)是近幾年快速發(fā)展的一種新興技術(shù)，其原理是基于基因治療的方法給哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)入不同的對(duì)光敏感的基因，通過(guò)不同波長(zhǎng)的光對(duì)特定細(xì)胞類型活性進(jìn)行調(diào)控。Channelrhodopsin-2 (ChR2)編碼陽(yáng)離子通道蛋白，493nm波長(zhǎng)的藍(lán)光光照后使陽(yáng)離子進(jìn)入細(xì)胞，而興奮細(xì)胞活性。另外halorhodopsin (NpHR)編碼氯離子泵，592nm的黃光可以使帶有負(fù)電荷的氯離子進(jìn)入細(xì)胞而抑制細(xì)胞的活性；在Volvox carteri (團(tuán)藻)中分離的新光感蛋白VChRl的激發(fā)波長(zhǎng)為589nm，使光調(diào)控的波長(zhǎng)進(jìn)行紅移，可以方便結(jié)合鈣離子成像技術(shù)應(yīng)用；ChETA把ChR2的E123突變?yōu)樘K氨酸或丙氨酸，提高了對(duì)頻率較高的光照的敏感性和穩(wěn)定性；利用光感基因ChETA的電傳導(dǎo)性和快速動(dòng)力學(xué)特性，不僅可以實(shí)現(xiàn)通過(guò)光來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位；還可以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和突觸的傳遞性。
[0007]然而，目前并沒(méi)有利用光感基因調(diào)控技術(shù)對(duì)SFl神經(jīng)元進(jìn)行特異性調(diào)控的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的主要目的在于提供一種能夠特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的技術(shù)。
[0009]為實(shí)現(xiàn)對(duì)下丘腦SFl神經(jīng)元的特異性調(diào)節(jié)，本案發(fā)明人構(gòu)建了能特異性標(biāo)記SFl神經(jīng)元的攜帶光感基因的載體，并將攜帶光感基因的病毒載體轉(zhuǎn)染SFl神經(jīng)元；利用特定波長(zhǎng)的黃光對(duì)SFl神經(jīng)元進(jìn)行特定頻率的刺激，促進(jìn)SFl神經(jīng)元活性的改變，從而改變了外周交感神經(jīng)活性的水平；實(shí)現(xiàn)對(duì)SFl神經(jīng)元的進(jìn)程進(jìn)行精確控制，進(jìn)一步調(diào)控骨代謝。特別是，利用特定波長(zhǎng)的黃光對(duì)SFl神經(jīng)元進(jìn)行特定頻率的刺激，能夠顯著降低SFl神經(jīng)元的動(dòng)作電位，導(dǎo)致骨密度降低，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化降低。
[0010]具體而言，一方面，本發(fā)明提供了一種特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物，該組合物包括:
[0011]用于感染SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中包括啟動(dòng)子、光感基因、綠色熒光標(biāo)記基因，其中，所述啟動(dòng)子為留體類神經(jīng)元啟動(dòng)子；
[0012]能產(chǎn)生黃光的光照裝置，用于對(duì)感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物也可以稱為一種“套組”，其中包括了本發(fā)明中特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性中所采用的各試劑、材料及儀器設(shè)備等組件，作為一種產(chǎn)品例如試劑盒的形式，各組件可按照預(yù)定的位置在大包裝中分別放置或是獨(dú)立包裝后成套銷售及使用。
[0014]在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了用于感染SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中的啟動(dòng)子為SFl啟動(dòng)子；光感基因?yàn)镹pHR ;綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)镚FP ;所述病毒為腺相關(guān)病毒(Invitrogen公司產(chǎn)品)；具體的構(gòu)建過(guò)程可以參照所屬領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的能產(chǎn)生黃光的光照裝置主要是用于對(duì)離體的或在體的感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性，這樣的光照裝置可以商購(gòu)獲得，當(dāng)用于對(duì)在體的感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控時(shí)，光照裝置通常還包括作為光傳導(dǎo)介質(zhì)的光纖。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物還可進(jìn)一步包括:使所述攜帶光感基因的病毒載體感染SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的試劑材料。具體地，這些材料可以是包括脂質(zhì)體(Invitrogen公司)等。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物中，所述黃光為波長(zhǎng)550?595nm的黃光，優(yōu)選為波長(zhǎng)595nm的黃光。
[0018]另一方面，本發(fā)明提供了所述的特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物在制備骨代謝調(diào)控系統(tǒng)中的應(yīng)用。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述骨代謝調(diào)控系統(tǒng)是利用所述的組合物中的攜帶光感基因的病毒載體感染下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞，并通過(guò)光照裝置對(duì)感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，以調(diào)控骨代謝。
[0020]具體實(shí)施時(shí)，所述骨代謝調(diào)控系統(tǒng)可以是用于對(duì)離體的感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，也可以是用于對(duì)在體的感染后的下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激。當(dāng)所述骨代謝調(diào)控系統(tǒng)用于對(duì)離體的感染后的SFl神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激時(shí)，黃光光照條件優(yōu)選為:黃光波長(zhǎng)595nm，光強(qiáng)I?5mW ;光刺激的相關(guān)參數(shù)為25?50ms每次，間隔25?50ms，占空比1: 1，光照頻率10?20Hz。當(dāng)所述骨代謝調(diào)控系統(tǒng)是用于對(duì)在體的感染后的下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，該系統(tǒng)還包括用于將黃光傳導(dǎo)至感染后的下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞的光纖，所述光纖直徑200 μπι，黃光光照條件為:黃光波長(zhǎng)595nm，光照的平均強(qiáng)度為10?20mW/mm2，光照頻率10?20Hz，每周照射2?4次，每次10?20min，共持續(xù)2?4周。
[0021]另一方面，本發(fā)明還提供了一種骨代謝調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括本發(fā)明所述的特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的組合物。
[0022]另一方面，本發(fā)明還提供了所述的特異性調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元活性的組合物或所述的骨代謝調(diào)控系統(tǒng)在建立由下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞活性改變而導(dǎo)致骨密度降低和/或間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化降低的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械膽?yīng)用。具體地，所述組合物或骨代謝調(diào)控系統(tǒng)是通過(guò)對(duì)感染后的下丘腦SFl神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行黃光光照刺激，降低SFl神經(jīng)元的動(dòng)作電位，而建立骨密度降低和/或間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化降低的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，建立了小鼠的骨質(zhì)疏松模型，從而可進(jìn)一步探討研宄調(diào)控SFl神經(jīng)元對(duì)骨代謝產(chǎn)生的影響，評(píng)估對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)病進(jìn)程的影響，或是評(píng)估調(diào)控下丘腦SFl神經(jīng)元對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化進(jìn)程的影響