本發(fā)明涉及電壓-門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，尤其涉及以電壓-門控鈉離子通道nav1.5孔道結(jié)構(gòu)域(nav1.5_pd)開放態(tài)為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)模建方法。
背景技術(shù)：
：電壓門控鈉離子(nav)通道廣泛分布于興奮性細(xì)胞，主要選擇性允許na+跨膜通過，其主要功能是維持細(xì)胞興奮性及其傳導(dǎo)。nav1.5α亞單位是navl.5發(fā)揮作用的核心亞單位，在人類中由scn5a基因編碼。其結(jié)構(gòu)和功能的異常時(shí)，將改變鈉離子通道電生理特性，從而導(dǎo)致“鈉離子通道病”，如先天性和獲得性長qt綜合征(lqts)、brugada綜合征(brs)等。為了治療這類疾病，發(fā)展了諸如抗心率失常(antiarrhythmics)和抗癲癇(antiepileptics)等通道藥物。這些通道類藥物通過控制鈉傳導(dǎo)來抑制與疾病相關(guān)的膜蛋白的過度興奮性。雖然達(dá)到了治療疾病、減輕患者痛苦、延長生存期的目的，但在使用過程中也暴露出很多的問題。例如用于治療心絞痛的藥物雷諾嗪，被臨床證實(shí)對(duì)老年腎損害患者的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生副作用。藥物與通道作用的位點(diǎn)在什么地方，以何種方式相互作用？這些信息對(duì)于更加安全、更具特異性的藥物合理設(shè)計(jì)具有至關(guān)重要的作用。明確鈉離子通道原子水平的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于獲得這些信息具有重要意義。由于目前實(shí)驗(yàn)手段的限制和電壓-門控鈉離子通道的自身特點(diǎn)，目前仍未能獲得原子水平的真核鈉離子通道晶體三級(jí)結(jié)構(gòu)。特別是，nav1.5原子水平三級(jí)結(jié)構(gòu)的缺失，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和機(jī)理研究明顯滯后，通過分子模建的方法預(yù)測結(jié)構(gòu)是目前解決這個(gè)問題的一條理想途徑。使用理論計(jì)算的方法預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而利用該結(jié)構(gòu)揭示其與藥物分子的結(jié)合機(jī)理能夠極大縮小實(shí)驗(yàn)篩選的范圍，避免因海量篩選在人力和物力上造成的浪費(fèi)。在眾多的結(jié)構(gòu)預(yù)測方法中，同源模建方法是比較常用的，如swiss-model，modeller等。此外還有基于片段拼接的i-tasser方法等。這些方法在膜蛋白的結(jié)構(gòu)模建方面都取得了一定的結(jié)果，但是這些方法在模型構(gòu)建之初都沒有充分考慮跨膜區(qū)域的信息。如何將跨膜結(jié)構(gòu)的信息充分考慮在內(nèi)，對(duì)于提高預(yù)測的準(zhǔn)確率是至關(guān)重要的。通過發(fā)展適用于電壓-門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，構(gòu)建nav1.5的孔道域結(jié)構(gòu)，將電壓-門控鈉離子通道nav1.5功能研究尚未有原子水平三級(jí)結(jié)構(gòu)的局限性。同時(shí)，nav1.5原子水平孔道結(jié)構(gòu)域模型的構(gòu)建，將有助于從分子水平上深入理解和揭示人類真核nav通道的空間構(gòu)象以及藥物分子對(duì)通道疾病的治療機(jī)理。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，建立一種快速、可靠、有針對(duì)性的電壓-門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，適用于對(duì)電壓-門控鈉離子通道nav1.5孔道域開放態(tài)結(jié)構(gòu)抗心律失常藥物的虛擬篩選及抑制機(jī)理研究上的應(yīng)用，為新藥研發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本發(fā)明通過rosetta的膜蛋白同源模建方法，以獲得晶體三級(jí)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌鈉離子通道navms(pdbid：4cbc)為模板，初步構(gòu)建組成nav1.5孔道結(jié)構(gòu)域的四個(gè)亞基結(jié)構(gòu)；然后根據(jù)rosettamp對(duì)各個(gè)構(gòu)建模型的打分情況進(jìn)行排序，挑選得分最高的結(jié)構(gòu)作為各個(gè)結(jié)構(gòu)域的初始結(jié)構(gòu)；然后利用tmalign方法將構(gòu)建完成的四個(gè)亞基結(jié)構(gòu)分別比對(duì)到細(xì)菌鈉離子通道(4cbc)的四個(gè)亞基上并對(duì)組裝完成的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化；以已有局部麻醉劑類藥物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，與優(yōu)化完的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定篩選和評(píng)價(jià)策略，確定構(gòu)建模型的可靠性。本發(fā)明所提供的一種適用于電壓-門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，包括以下步驟：1)收集nav1.5_pd不同結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，利用hhpred在線服務(wù)，分別完成四個(gè)亞基與相應(yīng)模板navms四個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列比對(duì)，確定組成孔道結(jié)構(gòu)域的四個(gè)亞基的序列組成，并生成多序列比對(duì)文件；2)利用rosetta膜蛋白的同源模建方法，首先將序列比對(duì)完全比對(duì)的部分進(jìn)行拷貝，然后將不能與模板序列比對(duì)的部分利用denovo的片段拼接方法生成片段結(jié)構(gòu)，最終對(duì)于nav1.5孔道結(jié)構(gòu)域四個(gè)亞基的每一個(gè)亞基生成待篩選的構(gòu)建結(jié)構(gòu)；3)利用rosetta的能量計(jì)算，選取10000個(gè)可能結(jié)構(gòu)中能量在前10％的1000個(gè)結(jié)構(gòu)，然后分別計(jì)算1000個(gè)結(jié)構(gòu)兩兩之間的rmsd值，按照rmsd值進(jìn)行聚類；根據(jù)rmsd值，對(duì)每個(gè)亞基所生成的可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類；4)對(duì)步驟3)的聚類結(jié)果，分別選取每一個(gè)亞基結(jié)構(gòu)中包含結(jié)構(gòu)數(shù)量最多的1-2類，然后分別利用ddfine方法進(jìn)行打分，排序，選取分值高的結(jié)構(gòu)作為相應(yīng)亞基的初始結(jié)構(gòu)；5)利用charmm-gui首先對(duì)初始結(jié)構(gòu)加膜，構(gòu)建膜蛋白加膜體系，將整個(gè)體系利用amber16軟件包進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化及分子動(dòng)力學(xué)模擬；確定最終結(jié)構(gòu)。其中步驟1)中確定了組成nav1.5_pd的四個(gè)亞基的序列組成，其中亞基i包含163個(gè)殘基(253-415)，亞基ii包含102個(gè)殘基(841-942)，亞基iii包含141個(gè)殘基(1337-1477)，亞基iv包含117個(gè)殘基(1660-1776)；所述的步驟1)中的相應(yīng)模板為navms的四個(gè)結(jié)構(gòu)域；步驟5)的加膜體系，其一種實(shí)施例的具體記載如下：整個(gè)體系由122949個(gè)原子組成，其中包括：蛋白的8409個(gè)重原子，801個(gè)popc磷脂分子，40993個(gè)水分子，69個(gè)na+離子以及55個(gè)cl-離子。步驟5)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)模擬，具體操作如下：首先固定整個(gè)蛋白分子不動(dòng)，對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行0.5ns的平衡動(dòng)力學(xué)；其次，依次放開輕原子，放開全部原子進(jìn)行整個(gè)體系的優(yōu)化2ns；然后分別采用共軛梯度法和最陡下降法進(jìn)行整個(gè)體系40ns的分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化；最后在310k，1個(gè)大氣壓下進(jìn)行300ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。本發(fā)明所建立的電壓-門控鈉離子通道結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)方法可靠，因?yàn)閷⒖缒^(qū)域的信息加入，采用同源拷貝和片段拼接相結(jié)合的方法進(jìn)行多道跨膜螺旋蛋白的結(jié)構(gòu)，克服了傳統(tǒng)的同源模建方法沒有充分考慮跨膜區(qū)域信息的缺點(diǎn)，可靠性高。(2)適用性廣，該方法不僅僅能夠成功預(yù)測鈉離子通道nav1.5的結(jié)構(gòu)，對(duì)其它類型的鈉離子通道的結(jié)構(gòu)預(yù)測同樣適用。附圖說明圖1nav1.5各個(gè)亞基與模板結(jié)構(gòu)navms(pdbid:4cbc)之間的序列比對(duì)圖，圖2優(yōu)化后的open16結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。(a)nav1.5cα原子的rmsd變化圖，其中，黑色線是全部結(jié)構(gòu)的rmsd變化，紅色線是去掉p-loop區(qū)后，膜內(nèi)部分的rmsd變化；(b)整個(gè)結(jié)構(gòu)的拉氏圖檢驗(yàn)結(jié)果；(c)全結(jié)構(gòu)從側(cè)面和(d)從胞外看的卡通圖展示；圖3局部麻醉劑類藥物與nav1.5開放態(tài)結(jié)構(gòu)的相互作用圖。第二列為相互作用類型，第三列為相互作用位點(diǎn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍并非限于下列實(shí)施例。實(shí)施例1：本發(fā)明的用于電壓-門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)預(yù)測方法包括以下步驟：1)通過ncbi中對(duì)nav1.5各個(gè)結(jié)構(gòu)域的定義劃分，確定nav1.5_pd的氨基酸序列組成如下：dⅰ：dvmvltvfclsvfaliglqlfmgnlrhkcvrnftalngtngsveadglvwesldlylsdpenyllkngtsdvllcgnssdagtcpegyrclkagenpdhgytsfdsfawaflalfrlmtqdcwerlyqqtlrsagkiymiffmlviflgsfylvnlilavvamadii：algnltlvlaiivfifavvgmqlfgknyselrdsdsgllprwhmmdffhafliifrilcgewietmwdcmevsgqslcllvfllvmvignlvvlnlflallldiii：aipsimnvllvclifwlifsimgvnlfagkfgrcinqtegdlplnytivnnksqceslnltgelywtkvkvnfdnvgagylallqvatfkgwmdimyaavdsrgyeeqpqweynlymyiyfvifiifgsfftlnlfigviidiv：alfniglllflvmfiysifgmanfayvkweagiddmfnfqtfansmlclfqittsagwdgllspilntgppycdptlpnsngsrgdcgspavgilffttyiiisflivvnmyiaiil(2)利用hhpred方法，將nav1.5的每一個(gè)亞基比對(duì)到相應(yīng)的模板結(jié)構(gòu)上去，生成序列比對(duì)文件。具體比對(duì)結(jié)果見圖1。(3)利用rosetta膜蛋白的同源模建方法，分別構(gòu)建nav1.5孔道結(jié)構(gòu)域四個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)。每個(gè)亞基分別生成10000個(gè)可能結(jié)構(gòu)。(4)根據(jù)各個(gè)亞基之間結(jié)構(gòu)的rmsd值進(jìn)行聚類分析，選取最大的幾類的結(jié)構(gòu)，并利用ddefinr對(duì)挑選出來的各個(gè)類中的結(jié)構(gòu)進(jìn)行打分，打分結(jié)果見表1。挑選得分最高的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)作為該亞基的初始結(jié)構(gòu)(表1中底色為黃色的結(jié)構(gòu))。表1、四個(gè)亞基里最大類里各個(gè)模建結(jié)構(gòu)的rosetta能量和ddefinr打分表dⅰ打分表：dⅱ打分表：cluster1rosettaenergyddefinrscoredomain2_4cbcs_00877.pdb-205.908-285.94domain2_4cbcs_02015.pdb-204.811-285.84domain2_4cbcs_04592.pdb-201.019-281.46domain2_4cbcs_04926.pdb-212.699-288.9domain2_4cbcs_05474.pdb-208.136-288.82domain2_4cbcs_06344.pdb-202.395-286.62domain2_4cbcs_08445.pdb-209.867-288.73domain2_4cbcs_08584.pdb-205.627-285.14domain2_4cbcs_08595.pdb-200.317-289.47domain2_4cbcs_09738.pdb-203.831-284.11dⅲ打分表：dⅳ打分表：(5)將挑選出來的亞基結(jié)構(gòu)，通過tmalign比對(duì)到其模板結(jié)構(gòu)上，并按照亞基a-d順時(shí)針排列的順序，進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組裝，并對(duì)組裝后的結(jié)構(gòu)通過rosettamp進(jìn)行膜蛋白結(jié)構(gòu)打分，排序，結(jié)果如表2。energy值的大小能夠反映出蛋白的穩(wěn)定程度，因此選取能量最低的open16作為所構(gòu)建模型的初始結(jié)構(gòu)。表2、組裝后結(jié)構(gòu)的rosettamp能量打分表no.modelenergyno.modelenergyopen166151_8445_8423_8728-665.130open096151_4926_6544_2593-310.043open126151_4926_8423_8728-647.289open012510_4926_6544_2593-266.816open156151_8445_8423_2593-641.348open082510_8445_8423_8728-121.384open116151_4926_8423_2593-622.910open146151_8445_6544_8728-65.134open42510_4926_8423_8728-599.686open072510_8445_8423_2593-41.685open32510_4926_8423_2593-569.575open136151_8445_6544_259311.75open106151_4926_6544_8728-364.539open062510_8445_6544_8728489.328open22510_4926_6544_8728-362.741open052510_8445_6544_2593544.194(6)以open16為初始結(jié)構(gòu)，進(jìn)行300ns的加膜分子動(dòng)力學(xué)模擬，選取穩(wěn)定后的合理結(jié)構(gòu)作為最終構(gòu)建的結(jié)構(gòu)。圖2a的rmsd圖可以看出，全原子的rmsd值(黑色線)迅速增大到然后穩(wěn)定在這個(gè)區(qū)域波動(dòng)，說明最后整個(gè)蛋白能夠形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，膜內(nèi)部分的rmsd值(紅色線)在100ns以后在左右波動(dòng)，說明整個(gè)蛋白能夠引起大的rmsd波動(dòng)的主要原因在膜外的p-loop區(qū)域。將最后穩(wěn)定后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行拉氏圖檢驗(yàn)，從ramachandranplot中可以看出，整個(gè)蛋白幾乎所有的區(qū)域都處于可信賴區(qū)，說明最后形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(圖2c&d)是可信的。實(shí)施例2nav1.5與開放態(tài)局部麻醉劑類藥物的相互作用位點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合(1)nav1.5與開放態(tài)局部麻醉劑類藥物的復(fù)合體(nav1.5_la)的構(gòu)建選取能對(duì)nav1.5開放態(tài)起作用的四個(gè)局部麻醉劑類藥物分子(la)：氟卡胺(flecainide)、吡西卡尼(pilsicainide)、可卡因(cocaine)、雷諾秦(ranolazine)作為抑制劑分子。使用的分子對(duì)接方法為：利用reduce、autodocktools和autodoc4來完成。首先通過reduce程序?yàn)閚av1.5添加氫，然后用autodocktools腳本分別為nav1.5和la分子添加gaussian電荷。選取格子中心，以的范圍內(nèi)的空間區(qū)域?yàn)閷?duì)接的格點(diǎn)區(qū)，利用autogrid來劃定格點(diǎn)。采用la和nav1.5結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域完全柔性的對(duì)接方法，利用autodock4來進(jìn)行對(duì)接。在對(duì)接過程中。打分采用autodock4自帶打分和xscore打分相結(jié)合的方法。利用上述方法，對(duì)每一個(gè)藥物分子分別進(jìn)行三次獨(dú)立對(duì)接，最終對(duì)氟卡胺、吡西卡尼、可卡因和雷諾秦分子分別生成64、112、75和134個(gè)復(fù)合體構(gòu)象。(2)nav1.5-la相互作用位點(diǎn)的確定如果la和nav1.5中原子之間的距離小于那么就認(rèn)為la和nav1.5是有相互作用的?；诖?，計(jì)算nav1.5中各個(gè)殘基與相應(yīng)la之間的接觸密度。表3中列出了高于接觸密度平均值的殘基。得出nav1.5的phe526，tyr533等位點(diǎn)在nav1.5與開放態(tài)局部麻醉劑類藥物的結(jié)合中發(fā)揮著重要作用。這些相互作用的結(jié)果與之前關(guān)于nav1.5與開放態(tài)局部麻醉劑類藥物的相互作用位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。表3、四個(gè)藥物分子與nav1.5的接觸位點(diǎn)及其相應(yīng)的接觸密度表(3)nav1.5-la相互作用類型的確定選取nav1.5-la所有構(gòu)象中能量最低，作為相應(yīng)的nav1.5-la復(fù)合體。利用ligplus計(jì)算原子之間的成鍵情況，結(jié)果如圖3。分析相互作用類型。從相互作用圖中可以看出nav1.5與phe526和y533之間存在著很強(qiáng)的非共價(jià)相互作用。同時(shí)，f526與利多卡因形成cation-pi相互作用，phe526和y533保守的芳香族側(cè)鏈與局部麻醉劑類藥物形成pi-pi和pi-sigma相互作用。與已有文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。通過上面實(shí)施例可以看出，本發(fā)明所建立的結(jié)構(gòu)預(yù)測方法能夠構(gòu)建可靠的電壓-門控鈉離子通道結(jié)構(gòu)，特別是所構(gòu)建的nav1.5_pd結(jié)構(gòu)不僅最后的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且與藥物分子結(jié)合時(shí)在作用位點(diǎn)和作用方式方面都與之前的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。當(dāng)前第1頁12