本發(fā)明涉及一種環(huán)狀RGD肽及其虛擬篩選方法。
背景技術(shù)：
：血管生成是指在已有血管的基礎(chǔ)上生成新血管，血管生成是身體的正常發(fā)育，繁殖和組織修復(fù)的基礎(chǔ)，也是許多慢性和潛在的致命疾病的發(fā)病機(jī)制。超過70種的疾病都與血管生成有關(guān)，包括腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新生血管和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。然而在臨床上，治療上述疾病尚存在很多缺點(diǎn)：例如，化療是癌癥治療的最常見的方法；然而，在一般情況下，化療藥物具有低的選擇性和顯著的副作用，這限制了癌癥治療的效果。又如玻璃體內(nèi)注射是治療脈絡(luò)膜新生血管形成的最常見的方式，然而這種方式患者的接受程度低，且需要多次重復(fù)的玻璃體內(nèi)注射，還可增加眼損傷的幾率。因此，迫切需要開發(fā)新的和有效的治療方法，加強(qiáng)新生血管性疾病治療和增強(qiáng)患者的依從性。整合素αvβ3，是由α亞基和β亞基經(jīng)非共價(jià)鍵連接而形成的異二聚體跨膜糖蛋白粘附分子，在許多重要的病理生理過程中起到重要的作用，如細(xì)胞增殖、分化、侵襲和遷移、凋亡、組織修復(fù)和腫瘤的侵潤轉(zhuǎn)移等。在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常器官系統(tǒng)不表達(dá)或表達(dá)極少，而在腫瘤、炎癥等組織改建時(shí)表達(dá)明顯增加。整合素αvβ3的異常高表達(dá)，可以通過與多種其它細(xì)胞因子間的協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤血管形成，并且促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。因此，特異性的干擾或破壞整合素αvβ3分子的功能，可以抑制表達(dá)αvβ3分子的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)而死亡，從而達(dá)到抗腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的作用，被視為抗腫瘤治療和血管新生相關(guān)疾病的靶點(diǎn)之一。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽，1984年P(guān)ierschbacher首次報(bào)道了纖維蛋白原中含有的RGD序列為細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)。之后的研究發(fā)現(xiàn)，外源性RGD多肽及其類似物可與體內(nèi)含RGD序列的物質(zhì)競爭結(jié)合，從而阻斷血管上皮細(xì)胞增殖的信使傳遞，終止細(xì)胞增殖，使血管不能生長，導(dǎo)致腫瘤組織供氧系統(tǒng)中斷，最終細(xì)胞萎縮、凋亡?；谏鲜鲈?，大量藥物開發(fā)工作集中于RGD和相關(guān)肽，已有RGD的藥物在臨床試驗(yàn)中。RGD序列肽可選擇性的靶向于整合素αvβ3，起到整合素受體拮抗的作用。多數(shù)線形RGD肽在體內(nèi)循環(huán)的半衰期較短，進(jìn)一步的現(xiàn)有技術(shù)中公開了環(huán)形RGD肽類，其更加穩(wěn)定，且較線形RGD多肽有更高的受體結(jié)合特異性?，F(xiàn)有技術(shù)公開了氨基酸序列RGDfK、RGDfV等環(huán)狀RGD序列肽，但其與整合素αvβ3受體親和力不高。因此，有必要提出有效的技術(shù)方案，解決上述問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種。本發(fā)明提供的環(huán)狀RGD多肽分子可以克服上述血管生成疾病治療中的缺點(diǎn)，可選擇性的靶向于整合素αvβ3，起到整合素受體拮抗的作用，又適合于將藥物、基因治療載體或其他試劑選擇性靶向至合適組織。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種環(huán)狀RGD肽的虛擬篩選方法，步驟如下：(1)虛擬篩選過程：以RGD三肽為先導(dǎo)化合物，通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件Surflex-dock，采用Hammerhead打分函數(shù)打分，從合成的現(xiàn)實(shí)角度出發(fā)，綜合靜電作用、范德華力、疏水作用和氫鍵進(jìn)行打分，根據(jù)打分結(jié)果排序，初步確定環(huán)狀RGD肽化合物；(2)對(duì)接過程：從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB中下載編號(hào)1L5G蛋白，編號(hào)1L5G蛋白包括RGD肽和αvβ3，去除其中的RGD肽，將1L5G蛋白中剩余的αvβ3與步驟(1)中確定的環(huán)狀RGD肽進(jìn)行對(duì)接，篩選出打分高的六元環(huán)肽。本發(fā)明還提供一種上述環(huán)狀RGD肽，所述環(huán)狀RGD肽具有RGDfVK、RGDfKV、RGDKfV或RGDf(N-me)VK氨基酸序列。優(yōu)選的，所述環(huán)狀RGD肽為式I所示的c(RGDf(N-me)VK)，或式II所示的c(RGDf(N-me)VK)-C。優(yōu)選的，所述環(huán)狀RGD肽為式III所示的c(RGDfVK)，式IV所示的c(RGDfVK)-C，或式V所示的c(RGDfVK)-GDK。優(yōu)選的，所述環(huán)狀RGD肽為式VI所示的c(RGDfKV)，式VII所示的c(RGDfKV)-C，或式VIII所示的c(RGDfKV)-GD。優(yōu)選的，所述環(huán)狀RGD肽為式IX所示的c(RGDKfV)，或式X所示的c(RGDKfV)-C。有益效果：本發(fā)明環(huán)狀RGD肽，可以與整合素αvβ3受體的特異性結(jié)合作用，可以作為血管生成拮抗劑，也適用于將藥物、基因治療載體或其他試劑選擇性靶向至合適組織，作為低毒、高效的疾病治療和診斷的方式。通過本發(fā)明虛擬篩選方法得到的環(huán)狀RGD肽，與已知環(huán)肽相比具有較好的活性，與整合素受體親和力強(qiáng)。附圖說明后文將參照附圖以示例性而非限制性的方式詳細(xì)描述本發(fā)明的一些具體實(shí)施例。附圖中相同的附圖標(biāo)記標(biāo)示了相同或類似的部件或部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些附圖未必是按比例繪制的。附圖中：圖1為本發(fā)明c(RGDf(N-me)VK)的模擬核磁圖譜；圖2為本發(fā)明c(RGDf(N-me)VK)-C的模擬核磁圖譜；圖3為本發(fā)明c(RGDf(N-me)VK)-C的液相圖譜；圖4為本發(fā)明c(RGDf(N-me)VK)-C的質(zhì)譜；圖5為本發(fā)明c(RGDfVK)的模擬核磁圖譜；圖6為本發(fā)明c(RGDfVK)-C的模擬核磁圖譜；圖7為本發(fā)明c(RGDfVK)-GDK的模擬核磁圖譜；圖8為本發(fā)明c(RGDfKV)的模擬核磁圖譜；圖9為本發(fā)明c(RGDfKV)-C的模擬核磁圖譜；圖10為本發(fā)明c(RGDfKV)-GD的模擬核磁圖譜；圖11為本發(fā)明c(RGDKfV)的模擬核磁圖譜；圖12為本發(fā)明c(RGDKfV)-C的模擬核磁圖譜；圖13為本發(fā)明應(yīng)用例1中RGD肽與PLGA-PEG-Mal的連接1HNMR圖譜；圖14為本發(fā)明應(yīng)用例1中RGD肽與PLGA-PEG-Mal的連接IR圖譜；圖15為本發(fā)明應(yīng)用例1中姜黃素納米粒透射電鏡圖；圖16為本發(fā)明應(yīng)用例1中細(xì)胞攝取的定量考察圖；圖17為本發(fā)明應(yīng)用例1中細(xì)胞攝取的定性考察圖；圖18為本發(fā)明應(yīng)用例1中熒光顯微鏡觀察細(xì)胞攝取圖；圖19為本發(fā)明應(yīng)用例1中細(xì)胞的生長抑制圖；圖20為本發(fā)明應(yīng)用例1中不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤裸鼠體內(nèi)熒光分布圖；圖21為本發(fā)明應(yīng)用例1中離體組織器官熒光強(qiáng)度成像圖；圖22為本發(fā)明熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取情況圖。具體實(shí)施方式針對(duì)傳統(tǒng)藥物或治療方式的缺點(diǎn)，本發(fā)明開發(fā)了一種環(huán)狀RGD肽，具有與整合素αvβ3受體的特異性結(jié)合作用，可以作為血管生成拮抗劑，也適用于將藥物、基因治療載體或其他試劑選擇性靶向至合適組織，作為低毒、高效的疾病治療和診斷的方式。本發(fā)明一種環(huán)狀RGD肽的虛擬篩選方法，步驟如下：虛擬篩選過程：以RGD三肽為先導(dǎo)化合物，通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件Surflex-dock，采用Hammerhead打分函數(shù)打分，從合成的現(xiàn)實(shí)角度出發(fā)，綜合靜電作用、范德華力、疏水作用和氫鍵進(jìn)行打分，根據(jù)打分結(jié)果排序，初步確定環(huán)狀RGD肽化合物；對(duì)接過程：從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB中下載編號(hào)1L5G蛋白，編號(hào)1L5G蛋白包括RGD肽和αvβ3，去除其中的RGD肽，將1L5G蛋白中剩余的αvβ3與步驟(1)中確定的環(huán)狀RGD肽進(jìn)行對(duì)接，篩選出打分最高的具有RGDfVK、RGDfKV、RGDKfV或RGDf(N-me)VK氨基酸序列的六元環(huán)肽，具體為本發(fā)明式I至式10所示的c(RGDf(N-me)VK)、c(RGDf(N-me)VK)-C、c(RGDfVK)、c(RGDfVK)-C、c(RGDfVK)-GDK、c(RGDfKV)、c(RGDfKV)-C、c(RGDfKV)-GD、c(RGDKfV)、c(RGDKfV)-C，對(duì)接結(jié)果打分列表如表1所示：表1本發(fā)明環(huán)肽對(duì)接打分表環(huán)肽對(duì)接打分c(RGDf(N-me)VK)7.98c(RGDf(N-me)VK)-C10.81c(RGDfVK)7.46c(RGDfVK)-C8.97c(RGDfVK)-GDK7.54c(RGDfKV)8.72c(RGDfKV)-C9.35c(RGDfKV)-GD7.69c(RGDKfV)7.36c(RGDKfV)-C7.78已知文獻(xiàn)報(bào)道的活性環(huán)肽c(RGDyK)的打分為7.11，如表1所示，本發(fā)明環(huán)肽與已知環(huán)肽相比具有較好的活性。圖1、圖2、圖5至圖12所示，為本發(fā)明六元環(huán)肽的模擬核磁圖譜。本發(fā)明環(huán)狀RGD肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)反應(yīng)合成。例如，一種肽或多肽可以被合成并且不從其合成樹脂上切割下，而一種肽或蛋白的另一片段可以被合成并且隨后從所述樹脂上切割下，從而暴露出在所述另一片段上被功能阻斷的末端基團(tuán)。通過肽縮合反應(yīng)，此兩個(gè)片段可經(jīng)分別在它們的羧基端和氨基端的肽鍵共價(jià)地連接，以形成其片段。將含有本發(fā)明所述序列的氨基酸片段直接收尾相接環(huán)化形成環(huán)狀RGD肽。通過賴氨酸作為銜接，可以在賴氨酸端通過酰胺鍵繼續(xù)引入氨基酸或氨基酸片段。如通過酰胺鍵在環(huán)狀RGD肽的賴氨酸上接入半胱氨酸，由于半胱氨酸上含有活潑巰基，該巰基可進(jìn)一步通過化學(xué)反應(yīng)與載體材料、藥物和熒光染料綴合，形成綴合物或組合物。以下多肽合成方法以環(huán)狀c(RGDf(N-me)VK)-C肽為例，該方法同樣適用于本專利所述的其他環(huán)狀RGD序列肽的合成(改變氨基酸及其連接順序)?？s寫：Arg(R)，精氨酸；Cys(C),半胱氨酸；DCM，二氯甲烷；Dde，1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)乙基；DIEA，二異丙基乙胺；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；Fmoc，芴甲氧羰基；Gly(G)，甘氨酸；HBTU,O-苯并三唑N，N，N，N-四甲基-六氟磷酸；Lys，賴氨酸；Pbf，2，2，4，6，7-五甲基-二氫苯并呋喃-5-磺酰基；RP-HPLC，反相高效液相色譜；RT，室溫；TFA，三氟乙酸；Val(V)，纈氨酸。(1)、溶脹樹脂：將2-氯三苯甲基氯樹脂放入反應(yīng)管中，加二氯甲烷，振蕩30min；(2)、天冬氨酸-樹脂連接：通過沙芯漏斗抽濾掉溶劑，加入3倍摩爾過量的Fmoc-Asp(OAll)-OH，再加入10倍摩爾過量的二異丙基乙胺，最后加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，振蕩30min；甲醇封頭，30min；(3)、脫保護(hù)：去掉溶劑，加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，5min；去掉再加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，15min；抽掉哌啶溶液，取樹脂，加入茚三酮，氰化鉀，苯酚溶液各一滴，檢測反應(yīng)進(jìn)行性；(4)、偶聯(lián)：洗滌后，取保護(hù)氨基酸Fmoc-Gly-OH三倍過量，O-苯并三唑N，N，N，N-四甲基-六氟磷酸三倍過量，均用少量DMF溶解，加入反應(yīng)管，加入二異丙基乙胺十倍過量，反應(yīng)30min；(5)、清洗后重復(fù)上述步驟依次連接Fmoc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-phe-OH，F(xiàn)moc-N-Me-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Dde)-OH，脫除最后一個(gè)氨基酸的Fmoc保護(hù)基；(6)、去除Dde保護(hù)基：2％水合肼/DMF(15ml/g)兩次各15min；洗樹脂，縮合氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH，去除Fmoc保護(hù)基；(7)、切割、純化，凍干得環(huán)狀c(RGDf(N-me)VK)-C肽。如圖3和圖4所示，對(duì)產(chǎn)品做MS的分子量鑒定，和HPLC分析的純度鑒定。液相檢測條件：Columan:4.6*150mm,kromasilC18-5；SolventA:0.1％Trifluoroaceticin100％Acetonirile；SolventB:0.1％Trifluoroaceticin100％Water；Gradient:0.01minA5％,B95％；25.0minA70％,B30％；Flowrate:1.0ml/min；Wavelength:214nm；Volume:10ul.質(zhì)譜條件：Flowrate:0.2ml/min；RunTime:1min；BufferA:0.1％HCOOHinwater；BufferB:0.1％HCOOHinAcetonirile.(1)流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)本發(fā)明環(huán)狀RGD肽與整合素受體親和力熒光細(xì)胞率的檢測：取整合素高表達(dá)的對(duì)數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10ug·mL-1姜黃素濃度的納米粒培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；同時(shí)不加藥的空白孔作為對(duì)照。30min后取出6孔板，消化，轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP管中。1000r·min-1離心5min，棄上清，PBS洗3次，再加入600μL的PBS吹打均勻，進(jìn)樣，流式細(xì)胞儀檢測熒光細(xì)胞率。表2本發(fā)明環(huán)肽熒光細(xì)胞率表環(huán)肽熒光細(xì)胞率(％)c(RGDf(N-me)VK)7.98c(RGDf(N-me)VK)-C10.81c(RGDfVK)7.46c(RGDfVK)-C8.97c(RGDfVK)-GDK7.54c(RGDfKV)8.72c(RGDfKV)-C9.35c(RGDfKV)-GD7.69c(RGDKfV)7.36c(RGDKfV)-C7.78表2為流式細(xì)胞儀檢測熒光細(xì)胞率，由流式結(jié)果可知，本發(fā)明環(huán)肽與整合素受體具有較好的親和力。(2)選取得分高的本發(fā)明3個(gè)環(huán)狀RGD肽(c(RGDf(N-me)VK)-C，4c(RGDfVK)-C，c(RGDfKV)-C)開展對(duì)人臍靜脈細(xì)胞攝取的研究。取對(duì)數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞接種于24孔板，每孔中加一片圓形蓋玻片，每孔加入1ml培養(yǎng)基，每孔接種密度為細(xì)胞數(shù)40000個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h至細(xì)胞貼壁。吸棄舊的培養(yǎng)基，每孔加入1ml含20ug·ml-1姜黃素濃度的不同環(huán)肽的納米粒培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h。棄去培養(yǎng)基用PBS洗3次，加入4％的多聚甲醛溶液室溫固定15min，再用PBS清洗3次，取出蓋玻片倒扣于載玻片上，緩沖甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取情況。由圖22的熒光圖片可見，所制備的環(huán)肽納米粒的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照環(huán)肽，與對(duì)照環(huán)肽相比具有更高的親和力。應(yīng)用例1六元環(huán)肽作為靶向受體或熒光探針在腫瘤治療和診斷的應(yīng)用研究將六元環(huán)肽與高分子載體通過靜電吸附或共價(jià)鍵相結(jié)合，可攜帶化療藥物，將藥物選擇性的靶向輸送到腫瘤組織局部，可降低化療藥物的毒副作用。(1)RGD肽高分子載體綴合物的制備本發(fā)明所述RGD肽高分子綴合物包括并不限于所述的載體材料。RGD肽與PLGA-PEG-Mal的連接(選擇實(shí)驗(yàn)例中得到的較高親和力的肽c(RGDf(N-me)VK)-C)：稱取PLGA-PEG-Mal，丙酮溶解，氮?dú)獯蹈墒蛊渚鶆蚍稚ⅲ尤隤BS(pH7.4)過夜；稱取與PLGA-PEG-MAL等摩爾的RGD肽，純化水溶解，滴加到PLGA-PEG-Mal溶液中，充氮，冰浴，攪拌，HPLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程；反應(yīng)完成后，超濾離心清洗除去雜質(zhì)，冷凍干燥即得RGD-PEG-PLGA。RGD-SH與PLGA-PEG-Mal在pH7.4～7.6的PBS條件下發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，生成RGD-PEG-PLGA。HPLC色譜檢測結(jié)果顯示，PLGA-PEG-Mal鏈接RGD肽的效率約為90％。圖13為其1HNMR圖譜，其中B中δ＝6.705(2H)為-Mal-的特征峰，鏈接上RGD肽以后，其-Mal-特征峰消失；A中δ＝1.22，δ＝2.08和δ＝4.16為RGD肽的特征峰，與PLGA-PEG-Mal的特征峰重合。PLGA-PEG-Mal、RGD肽和RGD-PEG-PLGA的IR表征如圖14所示，圖14中的A：在δ＝3516.77cm-1附近為OH吸收峰，δ＝2925.54cm-1、2855.04cm-1為甲基和亞甲基C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，δ＝1759.97cm-1為C＝O的伸縮振動(dòng)吸收峰，δ＝1454.91cm-1為C-C的一系列伸縮振動(dòng)吸收峰，δ＝1170.63cm-1為酯鍵的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，δ＝1095.12cm-1為PEG中醚鍵C-O-C的伸縮振動(dòng)吸收峰。B：δ＝3333.39cm-1為羧基中OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，δ＝1662.59cm-1為酰胺鍵的C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰。C：連接RGD后，RGD中羧基OH的吸收峰由于周圍化學(xué)環(huán)境的改變，使其發(fā)生移動(dòng)至δ＝2961.69cm-1處；其它的峰由于分子量比較小，與PLGA-PEG-Mal的峰重合。(2)姜黃素納米粒的制備及表征稱取合成高分子和姜黃素，丙酮溶解為有機(jī)相，將有機(jī)相滴加到水相，攪拌揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得姜黃素納米粒。激光粒度儀測定納米粒的粒徑及粒度分布；如圖15所示，透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)。(3)細(xì)胞水平的靶向性評(píng)價(jià)如圖16和圖17所示，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞攝取的定量考察(濃度和時(shí)間依賴性)；如圖18所示，熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞攝取的定性考察(時(shí)間依賴性)。由結(jié)果可見，靶向組的納米粒熒光強(qiáng)度強(qiáng)于普通納米粒組。(4)姜黃素納米粒對(duì)細(xì)胞的抑制作用考察待細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長成緊密的單層后，用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，分別以每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100ul。將培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去舊的培養(yǎng)基，每孔加入100ul不同姜黃素濃度(1.25、2.5、5、10、20、30、40ug·ml-1，對(duì)應(yīng)的材料濃度為30、60、120、240、480、720、960ug·ml-1)的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度4個(gè)平行孔，同時(shí)不加藥的空白孔作為對(duì)照，接著放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后每孔加入20ulMTT溶液(5mg·ml-1)，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200ulDMSO，搖床振蕩10min，使甲瓚充分溶解。選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(％)＝實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100％。如圖19所示，細(xì)胞的生長抑制圖。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，靶向納米粒的細(xì)胞存活率最低，其對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用強(qiáng)于普通納米粒和藥物溶液。(5)動(dòng)物水平的靶向性評(píng)價(jià)A549細(xì)胞以每只5×106個(gè)接種于裸鼠右前腿上方，腫瘤長至800mm3左右時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。取雄性荷瘤裸鼠6只，分成3組，每組2只。分別尾靜脈注射0.2mL載有熒光素DiR的RGD-PEG-PLGA/DiR-Np，mPEG-PLGA/DiR-Np和熒光素DiR的甲醇水溶液，分別于1，2，4，8，12和24h水合氯醛麻醉，記錄小鼠的熒光成像照片。并于熒光最強(qiáng)的點(diǎn)取出心、肝、脾、肺、腎及腫瘤，進(jìn)行離體組織器官成像，使用KodakMIinvivoFxPro處理圖像和數(shù)據(jù)分析。如圖20所示，不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤裸鼠體內(nèi)熒光分布圖。如圖21所示，離體組織器官熒光強(qiáng)度成像圖.給藥后不同時(shí)間，荷瘤裸鼠體內(nèi)熒光分布情況如圖20所示，藥物通過尾靜脈注射入體內(nèi)后首先在肝臟聚集，這可能與肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細(xì)胞的吞噬有關(guān)。RGD-PEG-PLGA/DiR-Np組在2h腫瘤處有微弱的熒光，8h熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，隨后逐漸降低；mPEG-PLGA/DiR-Np組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度都弱于靶向組；DiR甲醇水溶液組主要在肝臟聚集。給藥后8h取出心、肝、脾、肺、腎及腫瘤，可見RGD-PEG-PLGA/DiR-Np組在腫瘤組織的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于mPEG-PLGA/DiR-Np組，DiR甲醇水溶液組只有微弱的熒光。靶向納米粒組在肝、腎等器官的熒光強(qiáng)度弱于普通納米粒組。通過這種方法不僅可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療，還可以接上熒光探針作為腫瘤診斷使用。應(yīng)用例2六元環(huán)肽作為靶向受體或熒光探針在眼后段疾病治療中的應(yīng)用通過建立BN大鼠的CNV模型、考察PAMAM-PEG-RGD(TAT)地塞米松納米復(fù)合物與PAMAM-PEG地塞米松納米復(fù)合物在CNV模型BN大鼠和健康BN大鼠的藥代和組織分布。1、CNV動(dòng)物模型的建立動(dòng)物：棕色雄性BN大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重180-220g)。儀器：氬激光機(jī)(LUMENIS公司，型號(hào)VISONONE)，熒光眼底血管造影(FFA)攝像機(jī)(TOPCON公司，日本，型號(hào)TRC-50IX)試劑：熒光素鈉注射液(廣西梧州制藥股份有限公司、3ml:0.6g，血管造影)、復(fù)方托品酰胺滴眼液(長春迪瑞制藥有限公司、5ml/支，散瞳)，1％甲基纖維素滴眼液。麻醉(10％水合氯醛，4ml/kg麻醉狀態(tài)良好)；雙眼滴用復(fù)方托品酰胺滴眼液散瞳，實(shí)驗(yàn)眼滴用1％甲基纖維素(防止進(jìn)一步刺激的保護(hù)劑)；左眼前放置90度的前置鏡，應(yīng)用532nm氬激光儀經(jīng)裂隙燈顯微鏡在全視網(wǎng)膜鏡下圍繞視盤等距光凝幾個(gè)點(diǎn)，光斑直徑75μm，激光功率70mW，曝光時(shí)間0.1s，以光凝后光凝斑中央有氣泡形成或輕度出血為bruch膜破裂的標(biāo)志。FFA檢查：于光凝后3、7、14、21、28及56天分別隨機(jī)抽取挪威大鼠麻醉并散瞳，腹腔注射20％的熒光素鈉注射液，實(shí)驗(yàn)眼和對(duì)照眼分別行FFA檢查(FFA的圓盤狀熒光滲漏可證實(shí)CNV存在，21天有熒光滲漏的光凝斑數(shù)達(dá)高峰)。2、藥品地塞米松磷酸鈉注射液(濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號(hào)14100625-1)；PEG-PAMAM地塞米松納米復(fù)合物；PEG-PAMAM-RGD(TAT)地塞米松納米復(fù)合物。3、藥代和組織分布取已建模的BN大鼠和健康BN大鼠各42只，分別分為A、B、C三組：A:地塞米松磷酸鈉注射液B：PEG-PAMAM地塞米松納米復(fù)合物C:PEG-PAMAM-RGD(TAT)地塞米松納米復(fù)合物分好組的大鼠，每組14只，稱重。分別尾靜脈注射PEG-PAMAM地塞米松納米復(fù)合物、PEG-PAMAM-RGD(TAT)地塞米松納米復(fù)合物和地塞米松磷酸鈉注射液(10.0mg/kg)，給藥后于5min、30min、1、2、4、12、24h的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)眼眶取血后斷頸處死大鼠2只，迅速解剖取眼、心、肝、脾、肺、腎等組織臟器，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組2只小鼠的血和臟器混合，各臟器分別稱重，血液按照小鼠體重8％計(jì)算。取將各臟器勻漿和血漿各0.3ml置于離心管中，加入乙腈200μl，渦旋3min后，12000r/min離心10min，取上清液HPLC分析。計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)地塞米松的血藥濃度和組織分布。色譜條件色譜柱：DiscoveryC-18(4.6×250mm,5μm)流動(dòng)相:甲醇:水＝70：30(v/v)檢測波長:240nm流速:1mL/min柱溫:30℃進(jìn)樣量:20μL地塞米松在生物樣品中的濃度與其被檢測到的峰面積具有較好的線性關(guān)系,符合生物樣品分析的要求。大鼠體內(nèi)藥時(shí)數(shù)據(jù)用藥代動(dòng)力學(xué)程序進(jìn)行處理。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：藥物在大鼠組織和血漿中的藥物濃度見表3-表8。表3：健康BN大鼠地塞米松磷酸鈉注射液在血漿和組織中的藥物濃度(μg/g、μg/ml)表4：CNV模型大鼠地塞米松磷酸鈉注射液在血漿和組織中的藥物濃度(μg/g、μg/ml)時(shí)間(h)眼心肝脾肺腎血0.085.16.140.35.810.314.98.60.58.97.528.96.112.111.217.9110.29.76.64.26.24.526.222.96.919.83.15.911.916.341,53.41.62.24.24.511.9120.79.40.50.51.95.05.224nd1.711.1ndndndnd表5：健康BN大鼠PAMAM-PEG地塞米松納米復(fù)合物在血漿和組織中的藥物濃度(μg/g、μg/ml)時(shí)間(h)眼心肝脾肺腎血0.083.35.975.225.55.43.93.30.53.96.350.116.02.27.16.813.212.428.923.48.13.839.622.09.720.114.13.310.430.340.85.116.36.91.915.127.712nd8.06.05.40.72.76.024nd2.29.92.8ndnd0.5表6：CNV模型大鼠PAMAM-PEG地塞米松納米復(fù)合物在血漿和組織中的藥物濃度(μg/g、μg/ml)時(shí)間(h)眼心肝脾肺腎血0.086.26.757.317.33.85.34.10.511.45.462.520.16.43.83.216.714.441.921.14.92.333.923.08.720.117.52.34.241.142.73.114.42.70.82.130.3121.4nd7.82.2nd0.77.424ndnd10.40.5ndnd1.0表7：健康BN大鼠PAMAM-PEG-RGD(TAT)地塞米松納米復(fù)合物在血漿和組織中的藥物濃度(μg/g、μg/ml)時(shí)間(h)眼心肝脾肺腎血0.083.15.769.036.66.63.14.20.53.75.847.320.93.36.37.212.88.834.530.15.85.233.421.410.227.718.14.87.740.540.95.813.58.02.210.730.312nd8.23.72.30.51.95.124nd1.81.4ndndnd0.9表8：CNV模型大鼠PAMAM-PEG-iRGD(TAT)地塞米松納米復(fù)合物在血漿和組織中的藥物濃度(μg/g、μg/ml)時(shí)間(h)眼心肝脾肺腎血0.087.94.520.113.13.44.92.40.520.25.631.810.94.22.72.9143.95.922.48.34.83.527.4232.23.912.49.83.32.244.6421.31.46.15.12.01.127.91214.3nd2.71.7ndnd13.9245.6nd0.8ndndnd4.2表9：藥代參數(shù)由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見：1)地塞米松磷酸鈉注射液BN大鼠和CNV造模的BN大鼠尾靜脈注射后，藥物迅速在大鼠各器官和血液中分布，在健康大鼠和CNV大鼠中主要分布在心、肝、腎中，眼中分布較少，但相比健康大鼠由于CNV的形成眼部脈絡(luò)膜有泄漏和血管增生導(dǎo)致藥物在眼部的積聚有所增加。2)PAMAM-PEG地塞米松納米復(fù)合物BN大鼠和CNV造模的BN大鼠尾靜脈注射后，藥物迅速在大鼠各器官和血液中分布，在健康大鼠主要分布在肝、脾、腎中，眼中分布較少；在CNV大鼠中主要分布在肝、脾、心中，在眼中分布也較少，但相比健康大鼠由于納米粒具有一定的被動(dòng)靶向作用，在有EPR效應(yīng)的眼部眼部的積聚有所增加，但由于血腦屏障的存在，這種被動(dòng)靶向的作用并不明顯。3)PAMAM-PEG-RGD(TAT)地塞米松納米復(fù)合物BN大鼠和CNV造模的BN大鼠尾靜脈注射后，藥物迅速在大鼠各器官和血液中分布，在健康大鼠主要分布在肝、脾、腎中，眼中分布較少；在CNV大鼠中主要分布在眼、肝、脾中，說明RGD和TAT共同介導(dǎo)的PAMAM聚合物納米復(fù)合物可以透過血腦屏障并靶向到整合素受體高表達(dá)的疾病部位，可用于該疾病的靶向治療。4)制成納米復(fù)合物后，地塞米松在血漿中的半衰期明顯延長，血中生物利用度明顯增加。但靶向納米復(fù)合物與普通納米粒相比生物利用度沒有明顯差別，但在眼組織分布上明顯增加，同時(shí)由于眼部藥物的增多，藥物在其他臟器的積聚降低，這也降低了藥物對(duì)正常器官的毒副作用。本發(fā)明獲得的環(huán)狀RGD肽具有更高的受體結(jié)合性能和靶向選擇性?？芍苯幼⑸涫褂米鳛樾律苻卓箘┲委熌[瘤、脈絡(luò)膜新生血管等疾病。也可作為靶向載體，攜帶藥物、基因、熒光標(biāo)記物等特異性的與患病組織或細(xì)胞結(jié)合，起到疾病治療和診斷的作用。本發(fā)明獲得的環(huán)狀RGD肽可應(yīng)用于抗血管生成劑、癌癥化學(xué)治療劑、細(xì)胞毒劑、抗炎劑、納米顆粒、多肽、核酸分子、小分子、熒光團(tuán)、熒光素、羅丹明、放射性核素或它們的結(jié)合物。其中抗血管生成劑包括但不限于甲磺酸阿帕替尼(ApatinibMesyIate)、重組人血管內(nèi)皮抑制素、貝伐單抗(Bevacizumab)、pegaptanib、雷珠單抗(ranibizumab)、索拉非尼(Sorafenib)。癌癥化學(xué)治療劑包括但不限于：5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和環(huán)胞苷、長春堿、長春新堿、喜樹堿、羥基喜樹堿、紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、依托泊甙、拓?fù)涮婵?、吉西他濱、順鉑、卡鉑。抗炎劑包括但不限于：氫化可的松、可的松、強(qiáng)的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、乙酸阿奈可他、姜黃素、葛根素、穿心蓮內(nèi)酯或漢防己甲素。本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在本發(fā)明的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3