器（R0M)、可編程只讀存儲 器（PROM)、可擦除可編程只讀存儲器（EPROM)、電可擦除可編程只讀存儲器（EEPROM)或其 它類型的存儲器設(shè)備。
[0052] 在實施方式中，除了別的以外，還提供了用于獲取樣本的三維體積圖像的方法，其 包括通過暗視場顯微術(shù)從樣本得到多個二維圖像，多個圖像包括沿著焦距的方向在多個相 等間隔開的樣本位置的每個處獲取的至少一個二維圖像，每個二維圖像包含來自樣本的焦 點對準和焦點未對準的光；將多個二維圖像輸入到用于確定存在于樣本中的至少一個結(jié)構(gòu) 的位置的三維計算方法；以及規(guī)劃樣本的三維體積圖像，三維圖像示出存在于樣本中的至 少一個結(jié)構(gòu)的位置。
[0053] 在任一個或多個實施方式中，樣本可包括至少一個細胞和/或其它類似的生物或 非生物結(jié)構(gòu)；以及在至少一個細胞內(nèi)的至少一個未染色受驗顆粒。暗視場顯微術(shù)可使用用 于照亮樣本的寬帶光。至少一個細胞和/或其它類似的生物或非生物結(jié)構(gòu)可以是熒光的； 至少一個未染色受驗顆?？梢允欠菬晒獾?；和/或暗視場顯微術(shù)可包括與用于照亮樣本的 熒光激發(fā)光的特定波長結(jié)合的寬帶光。存在于樣本中的至少一個結(jié)構(gòu)可包括：至少一個細 胞和/或其它類似的生物或非生物結(jié)構(gòu)；在至少一個細胞和/或其它類似的生物或非生物 結(jié)構(gòu)內(nèi)的至少一個標記細胞結(jié)構(gòu)；和/或在至少一個細胞和/或其它類似的生物或非生物 結(jié)構(gòu)內(nèi)的至少一個非熒光受驗顆粒。暗視場顯微術(shù)可包括窄帶光和寬帶光的混合以照亮樣 本，窄帶光激發(fā)至少一個標記細胞結(jié)構(gòu)而寬帶光從至少一個非熒光受驗顆粒散射。
[0054] 在任一個或多個實施方式中，該方法可包括調(diào)節(jié)窄帶光和寬帶光的相對強度，以 使在圖像中的至少一個標記細胞結(jié)構(gòu)和至少一個受驗顆粒的亮度均衡，至少一個標記細胞 結(jié)構(gòu)弱地貢獻于而至少一個受驗顆粒強地貢獻于圖像和/或示出在沒有飽和的三維圖像 中的至少一個標記細胞結(jié)構(gòu)的位置和至少一個受驗顆粒的位置。在任一個或多個實施方式 中，該方法可包括：通過對弧光燈的使用來產(chǎn)生窄帶和寬帶光的混合，弧光燈在其光譜輸出 中包含至少一個峰值，弧光燈的光強度在由至少一個峰值定義的窄波長范圍內(nèi)強而在由至 少一個峰值定義的窄波長范圍之外的寬波長范圍內(nèi)弱；使光從弧光燈穿過具有使至少一個 峰值的波長通過的通帶的激發(fā)濾波器；使用穿過激發(fā)濾波器的窄帶光照亮至少一個標記細 胞結(jié)構(gòu)；同時使用來自弧光燈的寬帶光照亮至少一個受驗顆粒；接收穿過發(fā)射濾波器的第 一通帶的光，第一通帶使從至少一個標記細胞結(jié)構(gòu)發(fā)射的光而不是在激發(fā)濾波器的通帶內(nèi) 的光穿過；和/或接收穿過發(fā)射濾波器的第二通帶的光，發(fā)射濾波器的第二通帶不使在發(fā) 射濾波器的第一通帶內(nèi)的光穿過。
[0055] 在另一個實施方式中，提供了用于確定在樣本內(nèi)的至少一個受驗顆粒的三維（3D) 位置的方法，其包括：通過暗視場顯微術(shù)獲取樣本的至少兩個圖像，這兩個圖像中的每個沿 著焦距的方向在不同的樣本位置處被獲??；經(jīng)由3D去卷積分析至少兩個圖像，其中，分析 包括對至少一個多點擴展函數(shù)（多PSF)的使用；經(jīng)由3D卷積根據(jù)分析至少兩個圖像的結(jié) 果來確定至少一個受驗顆粒的位置；以及獲取一個或多個3D圖像，一個或多個3D圖像示出 至少一個受驗顆粒的3D位置。
[0056] 在任一個或多個實施方式中，暗視場顯微術(shù)可包括寬帶光。至少一個多PSF可包 括在波長范圍上對多個窄帶PSF的光譜加權(quán)積分。多個窄帶PSF可包括至少一個所計算的 窄帶PSF和/或至少一個所測量的窄帶PSF。
[0057] 在任一個或多個實施方式中，該方法可包括使至少一個3D圖像模糊；在焦距的方 向上對至少一個3D圖像進行插值；和/或?qū)χ辽僖粋€3D圖像內(nèi)的峰值進行定位。至少一 個多PSF可包括受驗顆粒體素 PSF和分開的非受驗顆粒體素 PSF。至少一個受驗顆?？杀?涂覆，該涂覆改變至少一個受驗顆粒的光譜。樣本可以是生物樣本。生物樣本可以是未染 色的或染色的。樣本可包括半透明材料和/或纖維基質(zhì)。
[0058] 在另一個實施方式中，提供了用于確定在至少一個受驗顆粒的位置和細胞和/或 其它類似的生物結(jié)構(gòu)或非生物結(jié)構(gòu)內(nèi)的至少一個細胞結(jié)構(gòu)的位置之間的至少一個空間相 關(guān)性的方法，其包括：確定在三維坐標系內(nèi)的至少一個受驗顆粒的位置；確定在三維坐標 系內(nèi)的至少一個細胞結(jié)構(gòu)的位置；在三維坐標系中規(guī)劃相對于至少一個細胞結(jié)構(gòu)的位置的 至少一個受驗顆粒的位置的矢量描述；以及從矢量描述確定空間相關(guān)性。
[0059] 在任一個或多個實施方式中，該方法可包括：確定相對于細胞和/或其它類似的 生物或非生物結(jié)構(gòu)內(nèi)的細胞內(nèi)空間的位置的至少一個受驗顆粒的位置和/或確定相對于 在細胞和/或其它類似的生物或非生物結(jié)構(gòu)外部的細胞外空間的位置的至少一個受驗顆 粒的位置。在任一個或多個實施方式中，該方法可包括得到由至少一個細胞結(jié)構(gòu)的邊界圍 住的3D密度函數(shù)，3D密度函數(shù)描述多個受驗顆粒。在任一個或多個實施方式中，該方法可 包括：確定相對于細胞器內(nèi)空間的位置的至少一個受驗顆粒的位置和/或確定相對于在細 胞器外空間的位置的至少一個受驗顆粒的位置。
[0060] 在任一個或多個實施方式中，至少一個受驗顆粒包括多個受驗顆粒。至少一個細 胞結(jié)構(gòu)可包括細胞器。至少一個細胞結(jié)構(gòu)可包括整個細胞和/或其它類似的生物或非生物 結(jié)構(gòu)。至少一個細胞結(jié)構(gòu)可以是染色的或未染色的。在任一個或多個實施方式中，該方法 可包括確定在多個受驗顆粒的位置和至少一個細胞結(jié)構(gòu)的位置之間的最小距離。至少一個 細胞結(jié)構(gòu)可以是細胞和/或其它類似的生物或非生物結(jié)構(gòu)的染色邊界。至少一個細胞結(jié)構(gòu) 可以是染色核膜。
[0061] 在另一實施方式中，提供了顯示至少一個受驗顆粒的位置的方法，其包括：通過暗 視場顯微術(shù)獲取樣本的至少兩個圖像，沿著焦距的方向在不同的樣本位置處獲得至少兩個 圖像中的每一個；經(jīng)由3D去卷積分析至少兩個圖像，其中，分析包括對至少一個多點擴展 函數(shù)（多PSF)的使用；經(jīng)由3D卷積根據(jù)分析至少兩個圖像的結(jié)果來確定至少一個受驗顆 粒的位置；以及獲取一個或多個3D圖像，一個或多個3D圖像通過顯示在至少一個受驗顆粒 的3D位置處的球形圖標來示出至少一個受驗顆粒的3D位置，球形圖標代表唯一的3D空間 坐標。在任一個或多個實施方式中，該方法可包括在一個或多個3D圖像內(nèi)顯示細胞結(jié)構(gòu)的 半透明體積圖像，至少一個受驗顆粒的3D位置被顯示在細胞結(jié)構(gòu)的半透明體積圖像之內(nèi)。
[0062] 在另一實施方式中，提供了用于增加從包含弱和強光源的樣本獲取的三維圖像的 動態(tài)范圍的方法，該方法包括：通過暗視場顯微術(shù)從樣本獲取短曝光三維圖像，通過使用短 曝光時間來獲取短曝光圖像；通過暗視場顯微術(shù)從樣本獲取長曝光三維圖像，通過使用長 曝光時間來獲取長曝光圖像；識別在長曝光圖像中的飽和像素；從長曝光圖像刪除所識別 的飽和像素；用來自短曝光圖像的相應像素代替在長曝光圖像中的刪除的像素以形成最終 圖像；以及重新調(diào)節(jié)最終圖像以反映公共曝光時間。在另一個實施方式中，提供了用于在垂 直方向上銳化3D圖像的方法，該方法包括：處理每個橫向像素的垂直剖面以識別局部最小 值并用除了等于那個部分的積分的單個值以外包括零的新剖面部分代替在局部最小值之 間的剖面的部分，其中單個值在垂直方向上位于該部分的質(zhì)心處。
[0063] 應強調(diào)，本公開的上面描述的實施方式僅僅是為了對本公開的原理的清楚理解而 提出的實現(xiàn)的可能的例子?？蓪ι厦婷枋龅膶嵤┓绞阶龀龊芏嘧兓托薷亩鴮嵸|(zhì)上不偏離 本公開的精神和原理。所有這樣的修改和變化被規(guī)定為在本文中被包括在本公開的范圍內(nèi) 并被下面的權(quán)利要求保護。
【主權(quán)項】
1. 一種用于獲取樣本的三維體積圖像的方法，所述方法包括： 通過暗視場顯微術(shù)從所述樣本獲取多個二維圖像，所述多個圖像包括沿著焦距的方向 在多個相等間隔開的樣本位置的每一個處獲得的至少一個二維圖像，每個二維圖像包含來 自所述樣本的焦點對準和焦點未對準的光； 將所述多個二維圖像輸入到用于確定存在于所述樣本中的至少一個結(jié)構(gòu)的位置的三 維計算方法；以及 規(guī)劃所述樣本的三維體積圖像，所述三維圖像示出存在于所述樣本中的所述至少一個 結(jié)構(gòu)的所述位置。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樣本包括： 至少一個細胞和/或其它類似的生物或非生物結(jié)構(gòu)；以及 在所述至少一個細胞內(nèi)的至少一個未染色受驗顆粒。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述暗視場顯微術(shù)使用用于照亮所述樣本的寬 帶光。4. 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中： 所述至少一個細胞和/或其它類似的生物或非生物結(jié)構(gòu)是熒光的； 所述至少一個未染色受驗顆粒是非熒光的；以及 所述暗視場顯微術(shù)包括與用于照亮所述樣本的熒光激發(fā)光的特定波長組合的寬帶光。5. 如權(quán)利要求1-4中的任一項所述的方法，其中： 存在于所述樣本中的所述至少一個結(jié)構(gòu)包括： 至少一個細胞和/或其它類似的生物或非生物結(jié)構(gòu)； 在所述至少一個細胞和/或其