用于富集和分離具有的濃度在若干對數(shù)級上的細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及磁性的流式細(xì)胞術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]在用于流式細(xì)胞術(shù)的目前已知方法中，借助于通道中的額外的液體流來使細(xì)胞集中在主通道的中心中并且因此被分離(鞘流原理)。此分離使得有可能在后續(xù)測量步驟中計(jì)數(shù)細(xì)胞(例如通過光學(xué)或阻抗滴定裝置)。通過磁性標(biāo)記待定量的顆粒，有可能在實(shí)際定量之前從復(fù)雜樣本中分離和富集所述顆粒。
[0003]然而，為了維持此技術(shù)的功能性，需要產(chǎn)生鞘流的大量的額外液體。此方法還與具有例如稀釋步驟和離心步驟的進(jìn)一步制備相關(guān)，這些制備也與污染風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。稀釋步驟對于使計(jì)數(shù)率與細(xì)胞計(jì)數(shù)器的(即計(jì)數(shù)器的)磁傳感器的最小和最大計(jì)數(shù)率匹配而言是必要的。
[0004]待實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)在于提供一種裝置和一種方法，通過所述裝置和所述方法能夠更快速地且以更小的污染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行細(xì)胞術(shù)測量，例如，確定細(xì)胞樣本的濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]此目標(biāo)通過根據(jù)本申請權(quán)利要求1的根據(jù)本發(fā)明用于流式細(xì)胞術(shù)測量的裝置來實(shí)現(xiàn)。此外，所述目標(biāo)通過根據(jù)申請權(quán)利要求10的根據(jù)本發(fā)明的方法來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的有利改進(jìn)由從屬權(quán)利要求詳細(xì)說明。
[0006]本發(fā)明是基于在閉合系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行多個富集步驟的概念。這通過根據(jù)本發(fā)明的裝置的通道的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和通過使用所述通道中的偏轉(zhuǎn)裝置而變得可能的。本發(fā)明使能進(jìn)行具有多于10的數(shù)次冪的濃度(例如10至10000個細(xì)胞/微升)的細(xì)胞的靶向富集和分離。特別地，本發(fā)明使得有可能能夠在單個測量過程中測量可能的多于10的多次冪的細(xì)胞濃度。即使在計(jì)數(shù)器的受限制的動態(tài)響應(yīng)的情況下，這也允許在復(fù)雜樣本內(nèi)的單個微流體通道中覆蓋較大的動態(tài)范圍，而無需先前稀釋、分離或富集步驟。
[0007]為此目的，根據(jù)本發(fā)明的用于流式細(xì)胞術(shù)測量的裝置包括室和通道，其中所述通道包括磁傳感器并且設(shè)置在所述室的下游。所述室和所述通道形成閉合系統(tǒng)，其中所通道的軸線沿著所述通道的流動方向延伸。如果所述室直接匯合至所述通道中，則存在閉合系統(tǒng)。所述裝置特征在于磁體，更具體地在于永磁體和偏轉(zhuǎn)裝置，所述磁體和所述偏轉(zhuǎn)裝置兩者均布置在所述通道的預(yù)定側(cè)處。在此，所述偏轉(zhuǎn)裝置具有至少一個區(qū)段。每個區(qū)段布置在通道的濃度區(qū)域中。每個區(qū)段具有用于引導(dǎo)細(xì)胞朝向軸線的裝置。偏轉(zhuǎn)裝置由此能夠?qū)崿F(xiàn)磁性標(biāo)記細(xì)胞的富集，所述細(xì)胞通過各個濃度區(qū)域中的磁體被拉至通道的一側(cè)，至所述軸線上且這些細(xì)胞沿著所述軸線被引導(dǎo)至磁傳感器。
[0008]以上論述的目標(biāo)同樣由根據(jù)本發(fā)明的用于富集對于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞樣本中待檢測的細(xì)胞類型的細(xì)胞的方法來實(shí)現(xiàn)。在此首先提供待檢測的細(xì)胞類型的磁性標(biāo)記細(xì)胞。標(biāo)記細(xì)胞被富集在根據(jù)本發(fā)明的裝置的實(shí)施例的通道中。為此目的，標(biāo)記細(xì)胞借助于通道中的磁體被拉至所述通道的預(yù)定側(cè)上。在通道中的層流的情況下，那里的細(xì)胞中的至少一些通過偏轉(zhuǎn)裝置被引導(dǎo)至軸線，所述軸線沿所述通道的流動方向延伸，并且由此富集在所述軸線上。這使能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的有效富集。因此，即使復(fù)雜樣本(即含有許多不同細(xì)胞和其它顆粒(例如蛋白質(zhì))的未純化樣本)也能夠用于無中間步驟的流式細(xì)胞術(shù)，特別是以未稀釋的方式。
[0009]提供磁性標(biāo)記細(xì)胞能夠包括標(biāo)記所述細(xì)胞。在此，可使用兩種標(biāo)記變型。
[0010]在第一種變型中，待檢測的細(xì)胞可在培養(yǎng)步驟中通過在裝置的室中混合和/或攪拌標(biāo)記物(具體地，對于待檢測的細(xì)胞類型具有特異性的至少一種抗體，所述抗體連接至至少一種磁性標(biāo)記物)和細(xì)胞樣本來進(jìn)行標(biāo)記。此變型優(yōu)選地在達(dá)14個細(xì)胞/微升的較小總細(xì)胞濃度的情況下使用。在這種情況下，布置在所述室的側(cè)上的磁體能夠有助于混合和/或攪拌過程。
[0011]在所述裝置的一個實(shí)施例中，磁體對應(yīng)地布置在所述室的預(yù)定側(cè)處，所述磁體有助于混合和/或攪拌過程。
[0012]在具有更大總細(xì)胞濃度(例如達(dá)16個細(xì)胞/微升)的細(xì)胞樣本的情況下，可替代地，有可能在通道中提供在制備期間對于待檢測的細(xì)胞類型具有特異性的至少一種抗體，所述抗體與至少一種磁性標(biāo)記物相連接。當(dāng)使用布置在通道的一側(cè)上的磁體在所述通道中產(chǎn)生磁場時，抗體在所述通道的所述側(cè)處富集。緊接著，細(xì)胞樣本被引入至通道中，且由此使至少一種特異性抗體與細(xì)胞樣本的以層流方式流經(jīng)所述通道的所述側(cè)的那一部分相接觸。因此，在此部分中包含細(xì)胞的部分標(biāo)記，而無需稀釋或純化步驟。因此，在層流系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)所需細(xì)胞的逐層標(biāo)記?？商娲兀€能夠借助于設(shè)置在那里的磁體在室中進(jìn)行此類部分標(biāo)記。
[0013]因此，在流體流的情況下，僅一層(即細(xì)胞樣本的限定部分，例如所需細(xì)胞的1%)在閉合系統(tǒng)中被磁性標(biāo)記。
[0014]偏轉(zhuǎn)裝置能夠具有一個或多個導(dǎo)向元件，其作為用于引導(dǎo)區(qū)段中的細(xì)胞的裝置，所述導(dǎo)向元件例如形成凹槽并且將標(biāo)記細(xì)胞引導(dǎo)至軸線。在根據(jù)本發(fā)明的裝置的尤其有利的實(shí)施例中，偏轉(zhuǎn)裝置的至少一個區(qū)段包括布置成與軸線成角度的導(dǎo)向元件，其作為用于引導(dǎo)細(xì)胞的裝置。以一起或獨(dú)立的方式，所述導(dǎo)向元件形成在流動方向上漸縮的至少一個漏斗形狀。這使磁性標(biāo)記細(xì)胞能偏轉(zhuǎn)至通道的軸線，且由此使能實(shí)現(xiàn)富集。
[0015]以示例的方式，如果它完全或部分地包括鐵磁性材料，則在裝置的另一實(shí)施例中至少一個導(dǎo)向元件能夠形成在流動方向上漸縮的V形，從而促進(jìn)磁性標(biāo)記細(xì)胞的磁泳導(dǎo)向。
[0016]額外地或者可替代地，所述導(dǎo)向元件中的至少兩個能夠配置成對于多個細(xì)胞的壁并且能夠布置成在流動方向上沿軸線偏置，且由此形成朝向所述軸線的機(jī)械引導(dǎo)，這是憑借形成對于細(xì)胞的運(yùn)動路徑的邊界來實(shí)現(xiàn)的。
[0017]額外地，磁性腹板能夠沿通道的軸線布置，特別地設(shè)置在相同軸線水平處的兩個導(dǎo)向元件之間。因此，促進(jìn)在通道的軸線上的磁性標(biāo)記細(xì)胞的引導(dǎo)。
[0018]優(yōu)選地，通道的至少兩個濃度區(qū)域具有不同的構(gòu)型。細(xì)胞樣本能夠由此在多個對數(shù)級中富集。這樣能夠?qū)崿F(xiàn)的是能夠通過具有受限制的動態(tài)響應(yīng)的計(jì)數(shù)器來測量存在的富集。
[0019]以示例的方式，所述至少兩個濃度區(qū)域能夠在預(yù)定側(cè)與同所述預(yù)定側(cè)相對的一側(cè)之間的通道的預(yù)定高度方面有所不同。因此，在每個濃度區(qū)域中確定限定體積。不同濃度區(qū)域中的不同體積引起在偏轉(zhuǎn)元件中在富集之前通過通道的磁體進(jìn)行細(xì)胞的第一富集，使得統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的和限定的細(xì)胞數(shù)量在給定濃度下的每個富集步驟中是可調(diào)整的。
[0020]相比之下，通道寬度優(yōu)選地對于所有濃度區(qū)域是恒定的。在恒定通道寬度的情況下，額外地或可替代地，所述至少兩個濃度區(qū)域能夠在偏轉(zhuǎn)裝置的預(yù)定寬度(如垂直于軸線所測量的)和/或所述偏轉(zhuǎn)裝置沿通道的軸線的各個區(qū)段的長度方面有所不同。這些尺寸確定偏轉(zhuǎn)裝置的匯流面積，即影響富集的程度。
[0021]在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實(shí)施例中，借助于磁傳感器在偏轉(zhuǎn)裝置下游的軸線上進(jìn)行細(xì)胞術(shù)，具體地細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用這樣，有可能例如確定細(xì)胞樣本的濃度。
[0022]在這種情況下，借助于偏轉(zhuǎn)裝置下游的細(xì)胞術(shù)確定細(xì)胞樣本的濃度優(yōu)選地包括借助于磁傳感器對來自至少一個濃度區(qū)域且流經(jīng)軸線上的富集的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。針對至少一個濃度區(qū)域，從在計(jì)數(shù)富集的細(xì)胞時確立的濃度區(qū)域的計(jì)數(shù)值、濃度區(qū)域的體積以及濃度區(qū)域中的偏轉(zhuǎn)裝置的區(qū)段的寬度來確立細(xì)胞樣本的濃度。這是有效和節(jié)省時間的測量，其的評估是快速可用的。自然地，在此選擇至少濃度區(qū)域，針對所述濃度區(qū)域出現(xiàn)對于統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)陳述而言足夠大并且小于由計(jì)數(shù)器能夠可靠記錄的最大計(jì)數(shù)率的計(jì)數(shù)器值。
[0023]可能需要確立在給定時間當(dāng)前計(jì)數(shù)的細(xì)胞所屬的濃度區(qū)域。在所述方法的另一實(shí)施例中，針對其確立計(jì)數(shù)器值的各個濃度區(qū)域是基于磁傳感器的計(jì)數(shù)過程的已確立的時間來確立的。因此有可能引起時間間隔分配至校準(zhǔn)裝置中的濃度區(qū)域。在某些情況下應(yīng)考慮流速。
【附圖說明】
[0024]下面，將基于附圖以具體的示例性實(shí)施例再一次更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。在附圖中:
圖1示出根據(jù)本發(fā)明的裝置的實(shí)施例在截面中的簡圖，
圖2示出根據(jù)本發(fā)明的裝置的通道的簡圖，其中圖1A示出示意性的截面，且圖1B示出通道的示意性頂視圖，
圖3示出偏轉(zhuǎn)裝置的不同實(shí)施例的簡圖，其中圖3A示出具有機(jī)械導(dǎo)向件的偏轉(zhuǎn)裝置的透視圖，并且圖3B和圖3C示出具有磁泳導(dǎo)向件的偏轉(zhuǎn)裝置在每種情況下的示意性頂視圖，圖4示出在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施例中緊接著引入細(xì)胞樣本之后(圖4A)和施加磁場之后(圖4B)通道中的細(xì)胞樣本的簡圖，
圖5示出闡明在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施例中通道中的細(xì)胞的富集的簡圖，其中圖5A示出在一個時間點(diǎn)通道的頂視圖，且圖5B示出在不同時間偏轉(zhuǎn)裝置的區(qū)段的頂視圖，以及圖6示出其中在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施例中測定細(xì)胞濃度以及在不同時間的通道的四個部段的簡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下更詳細(xì)解釋的示例性實(shí)施例代表本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。在圖中，功能上等效的元件具有相同的附圖標(biāo)記。圖中的坐標(biāo)系K和K’幫助定向，其中豎直軸線“z”和與其垂直的水平軸線“X”簡化截面中的取向(圖1A)，并且其中水平軸線“X”和與水平軸線“X”和豎直軸線“z”垂直的軸線“y”簡化示例性通道14的頂視圖