定位生物和非生物介質(zhì)中的納米顆粒的三維圖像處理的制作方法
【專利說明】定位生物和非生物介質(zhì)中的納米顆粒的三維圖像處理
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年3月12日提交的具有序列號61/776, 977的標題為 ^THREE-DIMENSIONAL IMAGE PROCESSING TO LOCATE NANOPARTICLES IN BIOLOGICAL AND N0NBI0L0GICAL MEDIA"的共同未決的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，將其全部內(nèi)容通過引用并入 本文。
[0003] 背景
[0004] 將藥物和化學(xué)制劑向活細胞內(nèi)的引入最近開始在作為載體的各種配置中利用在 本文被稱為受驗顆粒的小于100納米尺寸的納米級物體和/或微觀物體。例如，治療藥物 可被涂覆到諸如金和銀的納米尺寸的顆粒上或裝入諸如金和銀的納米尺寸的顆粒內(nèi)。功能 化受驗顆粒然后被引入身體內(nèi)，其中它被吸收到組織內(nèi)并最終被細胞占有。僅將應(yīng)接收藥 物的細胞作為目標的能力由被細胞表面識別的在顆粒上的功能涂層啟用。對于在受驗顆粒 的細胞攝取過程和藥物顆粒的細胞內(nèi)處理的研究對藥物治療過程的發(fā)展很重要。由使用各 種技術(shù)的很多不同類型的研究說明在細胞內(nèi)的攝取和分布中涉及的細胞-受驗顆粒交互 作用。
[0005] 最廣泛使用的工具之一是通過熒光顯微術(shù)的細胞成像。常規(guī)熒光顯微術(shù)不允許細 胞的三維體積被查看。因此，共焦熒光顯微術(shù)被用于使在一個體積之上的細胞的薄切片成 像以查看在三維中的細胞結(jié)構(gòu)。然而，這些方法需要對熒光標記的引入。熒光團到受驗顆 粒或細胞結(jié)構(gòu)的附著可改變對藥物輸送的預(yù)期作用并明顯增加細胞制備的困難。允許在三 維中的對受驗顆粒位置的確定而不改變對藥物輸送的預(yù)期作用的系統(tǒng)和方法因此是有意 義的，且有可能在增加對毫微級藥物輸送的理解中起重要作用，因而促進納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
[0006] 概述
[0007] 本公開提供了寬視場顯微術(shù)方法，其可確定在未染色和發(fā)熒光細胞內(nèi)或在半透明 非生物介質(zhì)和光可穿過其傳輸?shù)闹T如纖維基質(zhì)的其它介質(zhì)中的受驗顆粒的位置。本公開提 供了用于從未染色和發(fā)熒光細胞制備內(nèi)的功能化受驗顆粒獲得圖像數(shù)據(jù)的新穎方法。與 需要熒光細胞和顆粒的當(dāng)前的方法相反地，還提供了用于使用從細胞體積散射的寬帶照明 來產(chǎn)生三維細胞-受驗顆粒圖像的方法?？赏ㄟ^暗視場照明方法和對圖像劃分技術(shù)的使用 而不是通過使用為特定熒光團設(shè)計的濾色塊的傳統(tǒng)熒光方法來獲取這種圖像。在美國專利 第 7, 564, 623 "Microscope Illumination Device and Adapter Therefor"和美國專利第 7,542,203 "Microscope Illumination Device and Adapter Therefor" 中教導(dǎo)了適當(dāng)?shù)?照明系統(tǒng)和方法的非限制性例子，這兩個專利都通過引用全部被并入本文。
[0008] 此外，本公開還提供了新穎的計算方法以進行暗視場圖像段的三維去卷積并從而 揭示受驗顆粒相對于細胞結(jié)構(gòu)的位置。與為特定熒光團波長設(shè)計的單PSF相反地，新方法 使用多點擴展函數(shù)（PSF)來校正在整個寬光譜范圍內(nèi)的圖像焦點。新PSF可被設(shè)計成對用 于暗視場顯微術(shù)的可變和固定虹膜物鏡有效。新去卷積方法通過對感興趣的每個細胞結(jié)構(gòu) 和受驗顆粒的類型使用單獨的PSF來自動檢測圖像中的細胞結(jié)構(gòu)和受驗顆粒以優(yōu)化三維 圖像重建。作為例子，受驗顆粒可以在窄的波長范圍上是反射的，而細胞圖像在寬的波長范 圍上或在不同的波長范圍上產(chǎn)生。
[0009] 去卷積的獨特特征是所有受驗顆粒的三維圖像到球形圖標的轉(zhuǎn)換，球形圖標精確 地位于在三維體積中的受驗顆粒坐標處。從這種方法產(chǎn)生包括所有受驗顆粒位置的數(shù)據(jù) 集，且使用該數(shù)據(jù)集，用戶可接著通過沿著三個維度移動顯微鏡載物臺來檢查感興趣的特 定受驗顆粒，以便檢查受驗顆粒的位置。例如，用戶可通過對超光譜顯微術(shù)的使用來檢查特 定的受驗顆粒以評估報告藥物是否被附著到顆?；驈念w粒分離的光譜特性。
[0010] 本公開的方法是不同的和獨特的，因為它們能夠使用標準研究寬視場顯微鏡而不 是共焦顯微鏡來操作。對熒光標記的需求的消除減小了功能化受驗顆粒的復(fù)雜性，這在很 多情況下可改變功能。在其上可渲染三維圖像的寬光譜范圍允許以不同的受驗顆粒配置使 用本方法，其中可在可見光到近紅外波長范圍內(nèi)的任何地方觀察到不同的受驗顆粒配置。 在光學(xué)顯微術(shù)的領(lǐng)域中不存在已知的可自動確定在細胞內(nèi)的受驗顆粒位置的當(dāng)前技術(shù)方 法。
[0011] 附圖簡述
[0012] 參考以下附圖可更好地理解本公開的很多方面。在包括通過引用并入本文的任何 附圖的附圖中的部件不一定按比例，相反強調(diào)清楚地說明本公開的原理。而且，在附圖中， 相似的參考數(shù)字在全部幾個視圖中表示相應(yīng)的部件。
[0013] 圖1是示出根據(jù)本公開的各種實施方式的圖像形成的方法的流程圖。
[0014] 圖2是示出根據(jù)本公開的各種實施方式的受驗顆粒定位的方法的流程圖。
[0015] 圖3是示出根據(jù)本公開的各種實施方式的圖像形成的方法的流程圖。
[0016] 圖4是根據(jù)本公開的各種實施方式的計算設(shè)備的系統(tǒng)方框圖。
[0017] 詳細描述
[0018] 在下面的討論中，提供了對系統(tǒng)及其組件的一般描述，后面是對系統(tǒng)及其部件的 操作的討論。在本文描述了用于通過暗視場顯微術(shù)的使用來獲取和以計算方式處理在介質(zhì) 中的受驗顆粒的三維圖像數(shù)據(jù)的方法和系統(tǒng)的實施方式?？梢允鞘茯烆w粒的物體包括功能 化金屬和非金屬納米顆粒和納米棒、單壁和多壁碳納米管、金殼、量子點和納米絲。雖然在 本文討論的例證性實施方式可以指細胞介質(zhì)，本公開的方法和系統(tǒng)不限于生物介質(zhì)并可與 任何適當(dāng)?shù)耐该鳌胪该骰虬胪该鹘橘|(zhì)一起被使用。此外，雖然在細胞中的納米顆粒的成像 代表本公開的方法和系統(tǒng)的一個可能的應(yīng)用，在本公開中的受驗顆粒不需要限于納米尺寸 的顆粒，而可以是可使用本公開的方法和系統(tǒng)成像的任何尺寸的顆粒。此外，本公開的介 質(zhì)不需要限于諸如細胞的生物材料，而是可包括諸如纖維基質(zhì)、過濾基質(zhì)、乳劑和允許使用 本公開的方法和系統(tǒng)來獲取圖像的任何適當(dāng)?shù)耐该鳌胪该骰虬胪该鞑牧系姆窍拗菩缘睦?子。
[0019] 現(xiàn)在參考附圖，描述了本公開的一個或多個優(yōu)選實施方式。
[0020] 所公開的方法
[0021] 本文公開的方法和系統(tǒng)針對兩個一般類別。描述了用于使用暗視場顯微術(shù)獲取包 含受驗顆粒的生物和非生物介質(zhì)的三維（3D)圖像數(shù)據(jù)的獲得方法。此外，描述了將3D去 卷積處理擴展到以前它不能處理的圖像數(shù)據(jù)的方法和系統(tǒng)。
[0022] 獲得方法
[0023] 本章提出了用于獲取3D圖像數(shù)據(jù)的方法和系統(tǒng)。使用暗視場成像方法可做出包 含可散布有受驗顆粒的某種介質(zhì)的規(guī)定體積的記錄?？山Y(jié)合任何適當(dāng)?shù)陌狄晥鲲@微術(shù)系 統(tǒng)--例如作為非限制性的例子，在美國專利第7, 564, 623 "Microscope Illumination Device and Adapter Therefor"中描述的系統(tǒng)--來做出記錄。介質(zhì)可以是生物的，例如 細胞材料，或非生物的，例如纖維基質(zhì)。還可以使用相同的技術(shù)獲取對沒有受驗顆粒的介質(zhì) 的記錄。當(dāng)受驗顆粒被包括時，用在本公開中所述的處理，不需要為了檢測并定位它們而對 它們熒光地標記。介質(zhì)和細胞可由載玻片支承并在蓋玻片下穩(wěn)定，或它們可以在可支承活 細胞的環(huán)境流式小室中。
[0024] 記錄由以在每個圖像之間在垂直（或焦距）方向上的固定距離獲取的2D圖像棧 組成。在活細胞制備中，受驗顆粒的細胞和位置應(yīng)在獲取該圖像棧所需的幾秒期間以時間 和空間方式穩(wěn)定。通過交替地獲取圖像并隨后沿著垂直方向?qū)@微鏡載物臺移動到新的預(yù) 定位置來記錄該圖像棧。產(chǎn)生的圖像棧代表體積的低分辨率表示，并且是對于計算過程的 輸入。當(dāng)生物介質(zhì)和受驗顆粒都是未染色的（非熒光的）時，該過程允許使用任意地從細 胞和受驗顆粒反射的寬帶照明。如果受驗顆粒在特定波長下具有諧振峰值且未染色細胞具 有不同的反射光譜，則該過程允許兩個光譜，一個強調(diào)受驗顆粒峰值波長，而另一個強調(diào)綜 合考慮的細胞反射率、照明和攝像機靈敏度的特性。該方法同時解釋這兩個光譜，使得兩種 類型的物體有效地被成像。
[0025] 可選地，該過程允許將第一窄帶波長從受驗顆粒峰值移開，從而減少它對圖像的 貢獻。這個第二種情況是有用的，因為從在細胞研究中使用的很多受驗顆粒反射的光比細 胞反射強至少一個數(shù)量級。如果使用了最高效率，則當(dāng)細胞結(jié)構(gòu)在圖像中的合理值處時，圖 像將在受驗顆粒的位置處飽和。本公開還描述了用于使用兩個記錄來增加對兩種類型的物 體的記錄的動態(tài)范圍的方法，每個記錄使用高動態(tài)范圍攝像機而得到，在相同的焦距位