【具體實施方式】
[0024] 下面結合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0025] 本實驗中用到的試劑和儀器： 限制性內切酶（Hpa II)、甲基轉移酶（M. SssI)、S-腺甲硫氨酸（SAM) (Thermo， Scientific，美國）；苯胺（aniline)、氯化血紅素（hemin)、過氧化氫（H2O2)、牛血清蛋白 (BSA)、二硫蘇糖醇（DTT)(國藥集團化學試劑有限公司）；掃面電子顯微鏡（SEM，JEM-2100， JE0L，日本）；原子力顯微鏡（AFM，Nanoscopy Ilia，美國）；CHI660電化學工作站(上海辰華 儀器有限公司），三電極體系：金電極(直徑2 mm)為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘 汞電極（SCE)為參比電極。
[0026] 所用到人工合成的DNA序列（5' -3'）（上海生物工程有限責任公司）： (1)用于合成正四面體DNA探針的四條DNA : tetra-A ：ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAG AGCCGCCATAGTATTTTTTGTAGATCCGGTTCATA tetra-B : SH- (CH2)「TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAA TAGATGCGAGGGTCCAATAC tetra-C : SH- (CH2) 6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGA ATCTACTATGGCGGCTCTTC tetra-D : SH- (CH2) 6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGT TTGTATTGGACCCTCGCAT (2 )目標 DNA : CK^TMCKKtiK^TTCKKGGGGGCTCTTCCGCCAGCA TATGAACCGGATCTAC 標注下劃線加粗的序列是限制性內切酶特定識別并切割的序列，標注斜體加粗的序列 是用于生成DNA模擬酶的富G序列。
[0027] 實施例1 : 基于DNA模擬酶誘導苯胺聚合的電化學檢測DNA甲基轉移酶活性的分析方法，檢測步 驟是： 電極修飾步驟：取tetra-A，tetra-B，tetra-C，tetra-D以1: 1: 1:1的比例加入到緩沖 溶液中，90 °C反應5分鐘，4 °C反應0. 5小時后得到正四面體DNA探針。取正四面體DNA探 針溶液滴加到金電極表面，室溫反應12小時后，取目標DNA溶液滴加到金電極表面，37 °C 反應2小時。電極上每步反應結束后都需要用緩沖溶液清洗電極。
[0028] 甲基轉移酶活性檢測步驟：在修飾電極表面加入不同量的M. SssI (0、0. 05、0. 1、 0. 5、1、2. 5、5、10、15、20 U/mL)和50 μΜ SAM充分混勻后，37 °C恒溫反應1小時，然后加入 10 U Hpa II，混勻后，繼續(xù)37 °C恒溫反應2. 5小時后，加入氯化血紅素（hemin)，37 °C反應 1小時，最后加入苯胺和過氧化氫，室溫條件反應1. 5小時后，對修飾后的金電極進行電化 學檢測。分析得到差分脈沖伏安譜圖，作出甲基轉移酶線性圖。實驗結果見圖2:甲基化的 差分脈沖伏安信號明顯強于不加甲基轉移酶的信號；圖3 :在有甲基化轉移酶存在的金電 極成功實現(xiàn)苯胺聚合生成聚苯胺；圖4 :甲基轉移酶M. SssI在0. 05 U/mL到10 U/mL呈良 好的線性關系，檢測限是0.015 U/mL。說明對DNA甲基化的檢測效果好。
[0029] 實施例2 基于DNA模擬酶誘導苯胺聚合的電化學檢測DNA甲基轉移酶活性的分析方法，檢測步 驟是： 電極修飾步驟：取tetra-A，tetra-B，tetra-C，tetra-D以1: 1: 1:1的比例加入到緩沖 溶液中，95 °C反應5分鐘，8 °C反應0. 5小時后得到正四面體DNA探針。取正四面體DNA探 針溶液滴加到金電極表面，室溫反應24小時后，取目標DNA溶液滴加到金電極表面，37 °C 反應3小時。電極上每步反應結束后都需要用緩沖溶液清洗電極。
[0030] 甲基轉移酶活性檢測步驟：在修飾電極表面加入不同量的M. SssI (0、0. 02、0. 1、 0. 2、0. 5、1、2、5、10、20 U/mL)和50 μΜ SAM充分混勻后，在37 °C恒溫反應2小時，然后加 入15 U Hpa II，混勻后，繼續(xù)37 °C恒溫反應2. 5小時后，加入氯化血紅素（hemin)，37 °C 反應1小時，最后加入苯胺和過氧化氫，室溫條件反應I. 5小時后，對修飾后的金電極進行 電化學檢測。實驗結果：甲基轉移酶M. SssI在0.1 U/mL到10 U/mL呈良好的線性關系，檢 測限是0.05 U/mL。
[0031] 實施例3 基于DNA模擬酶誘導苯胺聚合的電化學檢測DNA甲基轉移酶活性的分析方法，檢測步 驟是： 電極修飾步驟：取三條5'端標記巰基的DNA和一條3'端標記一段含有CpG位點的 DNA，以1:1:1:1的比例加入到緩沖溶液中，90 °C反應10分鐘，4 °C反應60分鐘后得到正 四面體DNA探針。取正四面體DNA探針溶液滴加到金電極表面，室溫反應18小時后，取目 標DNA溶液滴加到金電極表面，37 °C反應2. 5小時。電極上每步反應結束后都需要用緩沖 溶液清洗電極。
[0032] 甲基轉移酶活性檢測步驟：在修飾電極表面加入不同量的M. SssI (0、0. 03、 0.09、3、6、9、12、15、20 U/mL)和50 μ M SAM充分混勻后，37 °C恒溫反應1小時，然后加入 20 U Hpa II，混勻后，繼續(xù)37 °C恒溫反應2. 5小時后，加入氯化血紅素（hemin)，37 °C反應 1小時，最后加入苯胺和過氧化氫，室溫條件反應1. 5小時后，對修飾后的金電極進行電化 學檢測。實驗結果：甲基轉移酶M. SssI在0.03 U/mL到15 U/mL呈良好的線性關系，檢測 限是 0. 02 U/mL。
[0033] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種基于DNA模擬酶誘導苯胺聚合的電化學檢測DNA甲基轉移酶活性的檢測方法， 其特征在于，包括以下步驟： (1) 正四面體DNA探針和目標DNA的選取：所述正四面體DNA探針和目標DNA部分互 補，都包含可甲基化的CpG位點，并且目標DNA的3'尾部多出富含鳥嘌呤的序列； (2) 正四面體DNA探針的組裝與其共價修飾到金電極表面； (3) 正四面體DNA探針與目標DNA的雜交； (4) 甲基化轉移酶對CpG位點進行甲基化； (5) 對甲基化敏感的限制性內切酶作用CpG位點； (6) 加入氯化血紅素； (7) 加入雙氧水和苯胺； (8) 利用電化學工作站對修飾電極進行檢測。2. 根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法的具體步驟如下：取三 條5'端標記巰基的DNA和一條3'端標記一段含有CpG位點的DNA，以1: 1: 1:1的比例加 入到甲基化作用的緩沖溶液中，90 ~ 95 °C反應5 ~ 10分鐘，4 ~ 8 °C反應0.5 ~ 1小時 后得到正四面體DNA探針；取正四面體DNA探針溶液滴加到金電極表面，室溫反應12 ~ 24 小時后，取目標DNA溶液滴加到金電極表面，37 °C反應2 ~ 3小時；然后在金電極上加入 甲基轉移酶使其CpG位點上的胞嘧啶甲基化，37 °C反應1 ~ 2小時后，加入限制性內切酶 Hpa II，37 °C反應2 ~ 3小時；加入氯化血紅素，37 °C反應0.5 ~ 1分鐘；最后加入苯胺和 過氧化氫，室溫條件反應1 ~ 1.5小時后，對修飾后的金電極在電化學檢測的緩沖溶液中進 行電化學檢測。3. 根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的正四面體DNA探針和目標DNA 濃度在緩沖液中的終濃度分別為I ~ 5 yM。4. 根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述甲基化作用的緩沖溶液為含有 NaCl、MgCl2、BSA 和 DTT 的 pH 7 ~ 8 的 10 ~ 80 mM 的 Tris-HCl，所述 NaCl 初始濃度為 100 ~ 500禮，1%(：12初始濃度為2~10 1111，834初始濃度為0.05~5 11^/1^，01'1'初始濃度為 0. 05 ~10HiMd5. 根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述用于電化學檢測的緩沖溶液為 pH 3. 5 ~ 4.5 的 80 ~ 150 mM HAc-NaAc。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于DNA模擬酶誘導苯胺聚合的電化學檢測DNA甲基轉移酶活性的檢測方法。制備了正四面體DNA探針，該正四面體DNA的頂點是一段含有可甲基化的CpG位點的DNA探針，其余三個支點分別標記了巰基。利用金-硫鍵，正四面體DNA探針共價修飾在金電極表面。因此本發(fā)明利用有無DNA模擬酶催化苯胺聚合的不同電化學信號實現(xiàn)檢測DNA甲基轉移酶活性的目的。本發(fā)明制備的正四面體DNA探針富含雙螺旋DNA，為苯胺聚合提供大量的模板，且無需制備復雜材料和標記DNA探針，可避免材料制備及標記DNA探針而導致檢測成本高、操作煩瑣，重現(xiàn)性差的缺陷。本發(fā)明具有成本低、快速、簡便、靈敏度高的優(yōu)點。
【IPC分類】G01N27/26, G01N27/327
【公開號】CN105136882
【申請?zhí)枴緾N201510612334
【發(fā)明人】趙宏宇, 楊永峰, 吳旭平
【申請人】南京市第二醫(yī)院
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月23日