基于dna模擬酶誘導(dǎo)苯胺聚合的電化學(xué)檢測dna甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種識別特殊甲基化位點(diǎn)和定量分析DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的生物傳 感技術(shù)，具體是指DNA甲基化后，被甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶識別并切割特定的序列后， 觀測電化學(xué)信號分子聚苯胺信號的改變，特別涉及了基于DNA模擬酶誘導(dǎo)苯胺聚合的電化 學(xué)檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化是指甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基自由基共價結(jié)合到特定DNA序列中的胞嘧啶 (C)上。這是表觀遺傳學(xué)中重要事件之一，在基因轉(zhuǎn)錄、真核生物發(fā)展、細(xì)胞分化和各種人類 疾病的發(fā)病機(jī)理如癌癥中起著至關(guān)重要的作用。
[0003] 在正常細(xì)胞中，大多數(shù)位于啟動子區(qū)域中CpG島（成百上千個CpG重復(fù)）是未甲基 化的，它的下游基因是在轉(zhuǎn)錄活躍的狀態(tài)下。相反，在癌癥細(xì)胞中啟動子區(qū)域的CpG島是呈 現(xiàn)甲基化的狀態(tài)，那么它的下游基因比如腫瘤抑制基因是始終保持沉默的狀態(tài)。基因啟動 子區(qū)域的CpG島異常甲基化將會改變正常的細(xì)胞功能和表型。對于大規(guī)模的表觀遺傳事 件、疾病診斷和研究生物對不同環(huán)境條件的響應(yīng)，DNA甲基化一直被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志 物。因此，分析DNA甲基化對遺傳性疾病的早期診斷是很重要的。特別是識別特定序列的 CpG甲基化有利于診斷癌癥的類型，提供基因表達(dá)機(jī)理的依據(jù)以及開發(fā)用于治療與CpG甲 基化相關(guān)癌癥的新藥。
[0004] 目前，DNA甲基化檢測主要涉及的技術(shù)是基于DNA上甲基胞嘧啶和胞嘧啶的區(qū)別。 例如，重亞硫酸鹽處理、限制性內(nèi)切酶、分子與生物/化學(xué)結(jié)合、電化學(xué)方法、各種各樣的基 于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR)、熒光分析方法、比色方法、高效液相色譜方法。兩種廣泛使用 的方法是基于重亞硫酸鹽處理的方法和基于限制性內(nèi)切酶的分析方法。在重亞硫酸鹽分析 方法中，在重亞硫酸鹽處理下胞嘧啶脫氨基后轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基胞嘧啶沒有改變是由 于其低的反應(yīng)性。還有在重亞硫酸鹽處理后，DNA上的甲基胞嘧啶通過PCR來放大。在基 于限制性內(nèi)切酶的分析方法中，限制性內(nèi)切酶能敏感地識別甲基化的位點(diǎn)和對特定序列的 DNA進(jìn)行切割。當(dāng)特定序列上的胞嘧啶被甲基化以后，限制性內(nèi)切酶的功能將會被抑制。雖 然這種方法會因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶對特定序列的DNA沒有完全作用，而有時會產(chǎn)生假陽性反 應(yīng)，但是它仍然可以提供一個經(jīng)濟(jì)的方法，在不知道主序列時來闡明序列上甲基化的位置。 因?yàn)榧谆D(zhuǎn)移酶在細(xì)胞分化和發(fā)展、基因表達(dá)、腫瘤發(fā)生和遺傳性疾病中扮演著一個重要 的角色，所以評估甲基轉(zhuǎn)移酶活性在藥物發(fā)現(xiàn)和臨床診斷的領(lǐng)域中是很重要的。甲基轉(zhuǎn)移 酶已經(jīng)成為一種治療癌癥的新穎的家庭藥理目標(biāo)。因此，發(fā)展一種敏感、選擇性好、簡單和 經(jīng)濟(jì)的方法來檢測甲基化轉(zhuǎn)移酶活性十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明中針對基因中CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析的DNA甲 基化檢測和測定甲基轉(zhuǎn)移酶活性方法，它具有快速、簡便、無標(biāo)記、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確地確定DNA甲 基化位點(diǎn)和檢測甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0006] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于DNA模擬酶誘導(dǎo)苯胺 聚合的電化學(xué)檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測方法，包括以下步驟： (1) 正四面體DNA探針和目標(biāo)DNA的選?。核稣拿骟wDNA探針和目標(biāo)DNA部分互 補(bǔ)，都包含可甲基化的CpG位點(diǎn)，并且目標(biāo)DNA的3'尾部多出富含鳥嘌呤的序列； (2) 正四面體DNA探針的組裝與其共價修飾到金電極表面； (3) 正四面體DNA探針與目標(biāo)DNA的雜交； (4) 甲基化轉(zhuǎn)移酶對CpG位點(diǎn)進(jìn)行甲基化； (5) 對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶（Hpa II)作用CpG位點(diǎn)； (6) 加入氯化血紅素； (7) 加入雙氧水和苯胺； (8) 利用電化學(xué)工作站對修飾電極進(jìn)行檢測。
[0007] 其中，上述苯胺聚合生成電化學(xué)信號分子聚苯胺。其中，上述苯胺在緩沖液中的終 濃度為5 ~ 150 mM。
[0008] 其中，上述檢測方法的具體步驟如下：取三條5'端標(biāo)記巰基的DNA和一條3'端標(biāo) 記一段含有CpG位點(diǎn)的DNA，以1:1:1:1的比例加入到甲基化作用的緩沖溶液中，90 ~ 95 。(:反應(yīng)5 ~ 10分鐘，4 ~ 8 °C反應(yīng)0.5 ~ 1小時后得到正四面體DNA探針；取正四面體DNA 探針溶液滴加到金電極表面，室溫反應(yīng)12 ~ 24小時后，取目標(biāo)DNA溶液滴加到金電極表 面，37 °C反應(yīng)2 ~ 3小時；然后在金電極上加入甲基轉(zhuǎn)移酶使其CpG位點(diǎn)上的胞嘧啶甲基 化，37°(：反應(yīng)1~2小時后，加入限制性內(nèi)切酶邱 &11，37°(：反應(yīng)2~3小時；加入氯化血 紅素，37 °C反應(yīng)0.5 ~ 1分鐘；最后加入苯胺和過氧化氫，室溫條件反應(yīng)1 ~ 1.5小時后， 對修飾后的金電極在電化學(xué)檢測的緩沖溶液中進(jìn)行電化學(xué)檢測。電極上每步反應(yīng)結(jié)束后都 需要用緩沖溶液清洗電極。
[0009] 其中，上述的正四面體DNA探針和目標(biāo)DNA濃度在緩沖液中的終濃度分別為1 ~ 5 μΜ〇
[0010] 其中，上述用于甲基化作用的緩沖溶液為含有NaCl、MgCl2、BSA和DTT的pH 7 ~ 8的10 ~ 80 mM的Tris-HCl，所述NaCl初始濃度為100 ~ 500 mM，MgCl2初始濃度為2 ~ 10 mM，BSA 初始濃度為 0· 05 ~ 5 mg/mL，DTT 初始濃度為 0· 05 ~ 10 mM。
[0011] 其中，上述用于電化學(xué)檢測的緩沖溶液為pH 3.5 ~ 4. 5的80 ~ 150 mM HAc-NaAc。當(dāng)緩沖液的pH值低于苯胺的pKa值時，質(zhì)子化的苯胺帶正電荷，可以通過靜電 作用富集在帶負(fù)電荷的DNA鏈上，在DNA模擬酶和過氧化氫的存在下，苯胺發(fā)生聚合反應(yīng)生 成聚苯胺。
[0012] 其中，上述甲基轉(zhuǎn)移酶在緩沖液中的終濃度為0 ~ 20 U/mL。
[0013] 其中，上述限制性內(nèi)切酶Hpa II在緩沖液中的終濃度為10 ~ 20 U/mL。
[0014] 其中，上述氯化血紅素在緩沖液中的終濃度為2.0 ~ 4.0 μΜ。氯化血紅素 (hemin)和富含鳥嘌呤的DNA形成G-四連體的DNA模擬酶，作為一類新興的人工模擬酶，在 近幾年來得到了飛速的發(fā)展，其催化作用的研究引起越來越多的關(guān)注，它具有與辣根過氧 化物酶相似的活性，能有效地催化以過氧化氫為媒介的反應(yīng)。DNA模擬酶具有易合成與復(fù) 制、可修飾、熱穩(wěn)定性好、不易水解等特點(diǎn)，可以代替辣根過氧化物酶用來催化苯胺聚合生 成聚苯胺。
[0015] 其中，上述過氧化氫在緩沖液中的終濃度為20 ~ 100 mM。
[0016] 其中，上述苯胺在緩沖液中的終濃度為5 ~ 150 mM。
[0017] 本發(fā)明制備了正四面體DNA探針，該正四面體DNA的頂點(diǎn)是一段含有可甲基化的 CpG位點(diǎn)的DNA探針，其余三個支點(diǎn)分別標(biāo)記了巰基。利用金-硫鍵，正四面體DNA探針共價 修飾在金電極表面，正四面體DNA探針與尾部富含鳥嘌呤的目標(biāo)DNA雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu) 的DNA鏈，在CpG位點(diǎn)沒有被甲基化的情況下，限制性內(nèi)切酶會識別特定序列（5' -CCGG-3'） 并切割，目標(biāo)DNA從電極上脫落，因而不會有DNA模擬酶生成，無法催化苯胺聚合，電化學(xué) 信號弱；如果，CpG位點(diǎn)上的胞嘧啶在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下對其特定位點(diǎn)進(jìn)行甲基化，對甲 基化敏感的限制性內(nèi)切酶就不會識別并切割特定的序列，然后利用氯化血紅素（hemin)結(jié) 合目標(biāo)DNA尾部的富含鳥嘌呤序列生成具有類似辣根過氧化物酶催化活性的DNA模擬酶， 該DNA模擬酶在過氧化氫的存在下催化苯胺在雙螺旋DNA上聚合生成電化學(xué)信號分子聚苯 胺，電化學(xué)信號強(qiáng)。此法通過有無DNA模擬酶催化苯胺聚合的不同電化學(xué)信號實(shí)現(xiàn)檢測DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性的目的。
[0018] 有益效果：本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明無需標(biāo)記，可避免現(xiàn)有技術(shù)中對甲基化與未甲基化DNA進(jìn)行標(biāo)記而導(dǎo)致檢 測成本高、準(zhǔn)確性差的缺點(diǎn)。
[0019] (2)利用限制性內(nèi)切酶來識別特殊位點(diǎn)并切割來確認(rèn)特殊位點(diǎn)的甲基化，提高其 特異性。
[0020] (3)本發(fā)明的正四面體DNA探針富含雙螺旋DNA，為苯胺聚合提供大量的模板，且 無需制備復(fù)雜材料和標(biāo)記DNA探針，可避免材料制備及標(biāo)記DNA探針而導(dǎo)致檢測成本高、操 作煩瑣，重現(xiàn)性差的缺陷。本發(fā)明具有成本低、快速、簡便、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0021] 圖1顯示了基于正四面體DNA信號放大和DNA模擬酶誘導(dǎo)苯胺聚合的電化學(xué)檢測 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測方法的流程圖； 圖2顯示了金電極表面聚苯胺的電化學(xué)表征：（A)循環(huán)伏安圖（CV); (B)差分脈沖伏安 圖（DPVXa :沒有加甲基轉(zhuǎn)移酶；b :加甲基轉(zhuǎn)移酶。從圖中可以看出有甲基化轉(zhuǎn)移酶存在的 金電極成功實(shí)現(xiàn)苯胺聚合生成聚苯胺。其電化學(xué)信號明顯強(qiáng)于沒有加甲基轉(zhuǎn)移酶的信號。
[0022] 圖3顯示了金電極表面聚苯胺的（A)掃描電鏡圖（SEM)和原子力顯微鏡圖（AFM)。 從圖中可以看出有甲基化轉(zhuǎn)移酶存在時，聚苯胺成功聚合在金電極表面。
[0023] 圖4顯示了檢測甲基轉(zhuǎn)移酶活性的差分脈沖伏安圖；A :在不同量的甲基轉(zhuǎn)移酶作 用下，得到的差分脈沖伏安圖（甲基轉(zhuǎn)移酶的濃度：(a)0、（b)0.05、（c)0.1、（d)0.5、（e)l、 (f)2. 5、（g)5、（h)10、（i)15、（j)20 U/mL) ;B :差分脈沖伏安信號強(qiáng)度與甲基轉(zhuǎn)移酶濃度的 標(biāo)準(zhǔn)曲線；插圖：差分脈沖伏安信號強(qiáng)度與甲基轉(zhuǎn)移酶之間的線性關(guān)系；從圖中可以看出 甲基轉(zhuǎn)移酶M. SssI在0. 05 U/mL到10 U/mL呈良好的線性關(guān)系。