對(duì)照。上樣時(shí),陰性樣本及各濃度標(biāo)品取100 y L,滴 于樣品墊,觀察各組顯線情況。當(dāng)試紙條質(zhì)控線(C線)處有紅色條帶形成,說(shuō)明試紙條正 常有效的,否則該試紙條作廢;當(dāng)試紙條產(chǎn)生兩條清晰紅色條帶,即質(zhì)控線(C線)、檢測(cè)線 (T線)均發(fā)生免疫反應(yīng),兩線顯色程度一致,此時(shí)說(shuō)明陰性樣本正常;當(dāng)?shù)渭硬煌瑵舛葮?biāo)品 時(shí),檢測(cè)線(T線)顯色程度隨著CLB濃度的增加而降低,將恰好消除T線時(shí)的標(biāo)品濃度定 為試紙條的靈敏度。
[0056] 將梯度稀釋的鹽酸克倫特羅標(biāo)液等體積上樣于制備好的試紙條,當(dāng)檢測(cè)線(T線) 恰好消線時(shí),作為試紙條靈敏度值。如圖2所示,由左至右標(biāo)品濃度依次為0ng/mL、20ng/ mL、10ng/mL、8ng/mL、5ng/mL、3ng/mL,在8ng/mL時(shí),試紙條檢測(cè)線(T線)恰好消線,當(dāng)濃度 繼續(xù)減小時(shí)結(jié)果為假陰性,因此本實(shí)驗(yàn)制備的試紙條靈敏度在8ng/mL。
[0057] 4. 2交叉反應(yīng)率
[0058] 選擇與CLB性質(zhì)相似的0 -受體激動(dòng)劑,常用的有萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他 林和馬布特羅,用0.0 lmol/L PB緩沖液稀釋上述高濃度標(biāo)品,分別配制成濃度為5ng/mL、 25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL待測(cè)液,此外再將這五類(lèi)標(biāo)品配制成兩種混合溶液, 每種各組分比例相同,即每毫升各含5ng (混合0 -受體激動(dòng)劑25ng/mL)、15ng (混合0 -受 體激動(dòng)劑75ng/mL)。取100 y L作為待檢液,觀察試紙條檢測(cè)線(T線)顯色情況。
[0059] 如表2所示,除了鹽酸克倫特羅標(biāo)品在25~100ng/ml范圍內(nèi)檢測(cè)為陽(yáng)性外,其他 各單類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng);混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中,混標(biāo)1檢測(cè)為陰性,混標(biāo)2檢測(cè)為陽(yáng)性; 綜上說(shuō)明,試紙條特異性好,與其他0 _受體激動(dòng)劑無(wú)交叉反應(yīng),即使混合上樣,只要鹽酸 克倫特羅含量高于檢測(cè)線便可被檢測(cè)。
[0060] 表2試紙條交叉反應(yīng)測(cè)試
[0062] 注:" + "表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,"一"表示檢測(cè)結(jié)果為陰性,"/"表示未實(shí)驗(yàn)
[0063] 4. 3試紙條的穩(wěn)定性
[0064] 試紙條研發(fā)應(yīng)處于恒定的溫濕度環(huán)境,保證每次制備出的試紙條性能穩(wěn)定。將試 紙條分別密封存放在4°C、室溫16~18°C及37°C,存放30天后取出分別進(jìn)行陰性、陽(yáng)性試 驗(yàn),觀察存放溫度對(duì)試紙條性能的影響。
[0065] 對(duì)同批次制備出的試紙條分別在室溫干燥的鋁箔袋中存放10天、30天、60天和90 天;對(duì)不同批次制備的試紙條比較存放30天后試紙條性能變化。分別上樣后觀察陰性組和 陽(yáng)性組的顯線情況。
[0066] 如圖3所示,同批次制備的試紙條在4°C、室溫、37°C保存30天后,每個(gè)溫度下分別 用陰性樣本和8ng/mL鹽酸克倫特羅標(biāo)品上樣,每組3個(gè)平行。明顯看出,37°C下保存后試 紙條陰性樣本檢測(cè)線(T線)顯色程度下降,金標(biāo)抗體與包被抗原免疫反應(yīng)減弱,影響檢測(cè) 結(jié)果判斷。4°C與室溫保存的試紙條性能相對(duì)穩(wěn)定,故試紙條保存時(shí)可放于4°C或室溫。
[0067] 如圖4反映在室溫下隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)試紙條性能變化,均以陰性樣本和陽(yáng)性 標(biāo)液作參照,在10~60天內(nèi)試紙條性能穩(wěn)定,各組顯色程度無(wú)差異,結(jié)果正確,靈敏度好; 當(dāng)保存90天后,試紙條穩(wěn)定性受到影響,陰性樣本檢測(cè)線(T線)明顯顏色變淡,可能包被 抗原活性降低,單抗更多的與羊抗鼠發(fā)生反應(yīng)。綜上,在室溫下試紙條可以穩(wěn)定保存60天。
[0068] 不同批次間試紙條質(zhì)量對(duì)比見(jiàn)表3所示,五個(gè)批次下,室溫保存30天后,分別抽取 30個(gè)試紙條進(jìn)行實(shí)驗(yàn),陰性、陽(yáng)性對(duì)照各15個(gè),其中僅有個(gè)別試紙條性能不穩(wěn)定,試紙條質(zhì) 量合格率在97%,說(shuō)明試紙條制備工藝較為合理,不同批次間差異性小,可用于實(shí)際樣品檢 測(cè)。
[0069] 表3不同批次間試紙條穩(wěn)定性測(cè)試
[0071] 實(shí)施例5樣品測(cè)試
[0072] 鹽酸克倫特羅試紙條目前在豬尿檢測(cè)中應(yīng)用廣泛,直接接取個(gè)體豬的尿液,適量 上樣即可,對(duì)控制含有CLB豬肉流入市場(chǎng)較為有效。但檢測(cè)工作仍以抽檢方式進(jìn)行,不能確 保所有流入市場(chǎng)的動(dòng)物生鮮肉品及其相關(guān)產(chǎn)品都是安全可靠的,因此選擇合理的樣品處理 方式,使試紙條得以充分發(fā)揮作用。
[0073] 5. 1生鮮豬肉組織中鹽酸克倫特羅粗提方法
[0074] 鹽酸克倫特羅易溶于水,新鮮的動(dòng)物組織有彈性,含水分較高,組織液中可殘留鹽 酸克倫特羅,為了較快的獲得檢測(cè)液,設(shè)計(jì)粗提取方法如下:
[0075] 方法一:均質(zhì)組織樣品,稱(chēng)取2g樣品于10mL離心管中,80~100 °C水浴加熱 lOmin,20°C、8000r/min離心5min,取組織滲出液待檢。
[0076] 方法二:均質(zhì)組織樣品,稱(chēng)取2g樣品于10mL離心管中,加入提取液lmL,高速渦旋 混勾lmin,20°C、8000r/min,離心5min,取上層液待檢。
[0077] 方法三:均質(zhì)組織樣品,稱(chēng)取2g樣品于10mL離心管中,加入提取液lmL,高速渦旋 混勾lmin,在80~100°C水浴加熱5~lOmin,8000r/min,離心5min,取上清液待檢。
[0078] 方法四:均質(zhì)組織樣品,稱(chēng)取2g樣品于10mL離心管中,加入提取液500uL,高速渦 旋混勾lmin,在80~100°C水浴加熱5~lOmin,8000r/min,離心3min,取上清液于一支新 離心管中,再向樣品組織中加入500 yL提取液,高速禍旋2min,10000r/min,離心3min,合 并兩次上清液待檢。
[0079] 上述方法中的生鮮豬肉組織,經(jīng)檢測(cè)不含鹽酸克倫特羅成分,因此可作為本實(shí)驗(yàn) 陰性樣品。
[0080] 粗提方法中所使用的每克樣品中均加入鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品25ng,方法中提取液 采用超純水,提取液不足lmL的用水補(bǔ)足。
[0081] 5. 2樣品提取緩沖液優(yōu)化
[0082] 采用方法三,樣品中不添加標(biāo)品物質(zhì),提取液選擇0? Olmol/L鹽酸、0? Olmol/L Na0H、0. 01m〇l/L乙酸銨、0? 01m〇l/L pH7. 4PBS,根據(jù)試紙條檢測(cè)情況確定合理的提取液。
[0083] 5. 3試紙條在豬肉組織檢測(cè)中的應(yīng)用
[0084] 根據(jù)5. 1和5. 2確定的樣品粗提取方法,在每克豬肉樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品50ng、 40ng、30ng、25ng、20ng、18ng、15ng、0ng,取上層提取液定容至lmL,混勾后分別取100 y L上 樣,觀察試紙條對(duì)豬肉組織中CLB檢測(cè)情況。
[0085] 5. 4樣品前處理方法優(yōu)化
[0086] 樣品粗提法僅適用于生鮮組織,對(duì)一些加工食品(如豬肉松、牛肉干)及肝臟組織 則需要更充分的處理,提取環(huán)節(jié)進(jìn)一步優(yōu)化,方法如下:
[0087] 優(yōu)化方案一:稱(chēng)取均質(zhì)組織樣品2g,加入lmL 10% K2C03,再加入5mL乙酸乙酯,高 速勻漿5分鐘;20°C、8000r/min,離心5分鐘;移取上層萃取液于另一支試管中,再向殘?jiān)?中加入10mL乙酸乙醋,渦旋2分鐘,相同條件離心后,合并兩次萃取液;65°C氮?dú)獯蹈?,加?lmL提取液復(fù)溶CLB,必要時(shí)用正己烷純化,吸取水相100 y L試紙條檢測(cè)。
[0088] 優(yōu)化方案二:稱(chēng)取2g均質(zhì)樣品與5mL 0. 2mol/L HC1-4% NaCl混合,振蕩3~5 分鐘,使溶液與樣品充分接觸;20°C、8000r/min,離心5分鐘;轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)離心管 中,加入lmL lmol/L NaOH禍旋30s,稱(chēng)取4~5g NaCl加入上清液中,禍旋振蕩lmin,保證 溶液為過(guò)飽和狀態(tài),加入10mL乙酸乙酯,振蕩混勻,靜置5分鐘,20°C、8000r/min,離心5分 鐘,吸取上層有機(jī)相于另一支離心管中,65°C氮?dú)獯蹈?,加入lmL提取液,,必要時(shí)用正己烷 純化,吸取水相100 U L試紙條檢測(cè)。
[0089] 在每克待測(cè)樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品Ong、15ng、20ng、25ng,樣品種類(lèi)包括