檢測鹽酸克倫特羅膠體金免疫層析試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測鹽酸克倫特羅膠體金免疫層析試 紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸克倫特羅屬e-腎上腺激素類藥物，這種物質(zhì)在動物生長同時提高飼養(yǎng)效 率，抑制脂肪形成，促進脂類物質(zhì)分解，增加組織蛋白質(zhì)。但值得關(guān)注的是，食用含一定量 0 _腎上腺激素的動物組織或食品會對人體健康造成威脅。在美國和澳大利亞允許使用一 定量的萊克多巴胺用于豬和牛的飼養(yǎng)，中國和大多數(shù)歐洲國家禁止將0 _腎上腺激素類的 藥物添加于動物飼料中。
[0003] 考慮到0 _腎上腺激素的非法使用情況及其殘留對人體健康的危害性，目前急需 一種靈敏高的方法來檢測腎上腺激素?，F(xiàn)已有關(guān)于檢測鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和 其他腎上腺激素的檢測方法，報道多是定性法和定量法。定量方法中有液相色譜法、氣 相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用等，這些方法均需要較繁瑣的樣品前處理步驟及配合有專業(yè)技能的人 員進行操作；免疫分析方法多進行定性判斷，這類檢測方法快速且準確。
[0004] 此外，e -腎上腺激素的產(chǎn)量不斷增加，這類藥物會進入到減肥產(chǎn)品及運動員的飲 食中，因此需要高效快速的檢測手段實現(xiàn)該類藥物殘留的監(jiān)控。檢測方法應(yīng)當具備耗時少、 成本低，可滿足檢測大量樣品，利于簡單分析定性。已經(jīng)發(fā)展利用起來的免疫檢測方法包括 ELISA、免疫層析法和免疫S印aration-ELISA，這些方法可同時檢測0 -腎上腺激素中的幾 種。近年來，將免疫層析技術(shù)用于鹽酸克倫特羅的檢測已成熱門，低成本投入使許多生物公 司紛紛開始進行膠體金免疫層析試紙條的研制。
[0005] 在現(xiàn)有技術(shù)中，目前市售的鹽酸克倫特羅膠體金試紙條種類繁多，國內(nèi)各類生物 公司研制出的試紙條檢測范圍在3~5ppb，檢測多以豬尿液為主，對控制含有CLB豬肉流 入市場較為有效。但檢測工作仍以抽檢方式進行，不能確保所有流入市場的動物生鮮肉品 及其相關(guān)產(chǎn)品都是安全可靠的，對于動物活體組織為對象的鹽酸克倫特羅膠體金試紙條尚 未有開發(fā)，這主要是基于對于此類樣本的處理，目前還沒有一個完善科學的處理方法。
[0006] 有鑒于此，本發(fā)明人研宄和設(shè)計了一種檢測鹽酸克倫特羅膠體金免疫層析試紙條 及其制備方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、操作簡便，檢測快速、準確并適合現(xiàn)場使用 的專門用于檢測動物物體組織的檢測鹽酸克倫特羅膠體金免疫層析試紙條及其制備方法， 以符合實際的檢測需求，依據(jù)本試紙條可以確保流入市場的動物生鮮肉品及其相關(guān)產(chǎn)品的 安全可靠性。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是：
[0009] 一種檢測鹽酸克倫特羅膠體金免疫層析試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素 包被膜、吸水墊及PVC底板，所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述硝酸纖維素包被膜及所述吸水 墊依次搭接在所述PVC底板上，所述結(jié)合墊包被設(shè)有鹽酸克倫特羅單克隆抗體-膠體金標 記物；所述硝酸纖維素包被膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線包被有鹽酸克倫特羅抗 原，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG。
[0010] 一種檢測鹽酸克倫特羅膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0011] 步驟一、膠體金的制備：取1個2501^燒杯，加入10011^0.01%氯金酸溶液，于恒 溫磁力攪拌器上使用溫度檔400°C對其進行加熱，轉(zhuǎn)速為300r/min，加熱至沸騰狀態(tài)后，沸 騰時的實際溫度為l〇〇°C，向燒杯中快速加入1. 8mL 1 %檸檬酸三鈉溶液，燒杯中的溶液變 為紅色后再加熱lOmin，直至溶液透亮，冷卻至室溫，4°C密封保存，即制得膠體金；
[0012] 步驟二、金標抗體的制備及純化：取調(diào)好pH為7. 4的所述膠體金lmL于2. OmL離 心管中，向離心管中加入4. 5 y g/ml的鹽酸克倫特羅單克隆抗體，用渦旋儀渦旋lOmin后靜 置15min ;向離心管中加入60 y L 1% BSA溶液，用渦旋儀渦旋10min，4°C封閉，靜置lOmin， 制得金標抗體，即鹽酸克倫特羅單克隆抗體-膠體金標記物；
[0013] 同時，將制得的金標抗體溶液于4°C 2500r/min，離心10min，去除下層沉淀，將上 清液轉(zhuǎn)到另一離心管中，于4°C 11000r/min，離心30min，去除上清液，將沉淀用膠體金稀釋 溶液稀釋至原體積的1/20,于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0014] 步驟三、試紙條的組裝：（1)將硝酸纖維素包被膜，即NC膜，和吸水墊分別貼于PVC 底板上，吸水墊壓住NC膜上方l-2mm ; (2)將粘貼好NC膜和吸水墊的PVC底板在切條機上 切割成4_寬的試紙條；(3)將樣品墊和結(jié)合墊切成4_寬的條，同時將結(jié)合墊浸泡金標抗 體溶液中，并于37°C烘干，制得金標墊；(4)烘干后的金標墊剪成lcm長的小塊并貼于PVC 底板上，金標墊壓住NC膜下方l-2mm，同時用樣品墊壓住金標墊下方l-2mm，根據(jù)試紙條長 度修剪樣品墊；（5)在結(jié)合墊和吸收墊之間的NC膜上依次包被鹽酸克倫特羅抗原和羊抗鼠 IgG，分別作為檢測線和控制線，采用BioDot劃膜儀進行包被劃線，具體參數(shù)為平臺移動速 度40mm/s，單位噴量：檢測線為0. 8 yL/cm，質(zhì)控線為1. 0 yL/cm，使得鹽酸克倫特羅抗原包 被濃度為〇. 2mg/mL ;羊抗鼠IgG包被濃度為1. 0mg/mL。
[0015] 作為實施例的優(yōu)選方式，在所述步驟三（3)中，還包括對樣品墊和金標墊進行前 處理的步驟，即將樣品墊與金標結(jié)合墊用切條機分別切成4_寬的長條，用含有5%的蔗 糖、5% BSA和終體積濃度為0. 1 %的pH為7. 4的0. 01m〇l/L的PBS溶液進行浸泡，浸泡后 將溶液瀝干，在37°C條件下烘干12h備用。
[0016] 作為實施例的優(yōu)選方式，還包括步驟一之前對試驗所用容器的清洗：首先將試驗 所用容器在重鉻酸鉀洗液中浸泡24h，取出后用自來水進行若干次清洗，再用超純水清洗3 次；將清洗干凈的容器于二氯甲硅烷含量為5%的氯仿中浸泡lmin后進行硅化處理；將經(jīng) 過硅化處理過的容器放置于室溫條件下干燥，待干燥完成后用超純水清洗干凈并于烘箱中 37 °C進行干燥處理，備用。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點：
[0018] 1、本發(fā)明的檢測鹽酸克倫特羅的膠體金免疫層析試紙條，具有特異性強，靈敏度 高，檢測時間短等優(yōu)點，可以廣泛應(yīng)用于動物的活體組織檢測。
[0019] 2、本發(fā)明的檢測試紙條不需要任何特殊儀器、設(shè)備，可現(xiàn)場操作，檢測成本低。
[0020] 3、本發(fā)明的檢測試紙條操作簡便，不需要專業(yè)人員操作。
[0021] 4、本發(fā)明對樣品墊與金標墊進行了前處理，使得樣品墊與金標墊具有優(yōu)異的吸水 能力及釋放能力，進而大大提尚了檢測能力。
[0022] 5、本發(fā)明對試驗所用容器都進行清洗，最終增強了金標抗體的穩(wěn)定性。
[0023] 6、本發(fā)明可以同時檢測液體樣品和組織樣品，無需分開檢測，而傳統(tǒng)的試紙條對 于這兩種樣品是分開檢測的。
[0024] 7、本發(fā)明的膠體金標記抗體時最佳蛋白標記量的確定采用了氯化鈉破壞法與性 能實驗相結(jié)合的方法，在提高檢測的靈敏度的同時，節(jié)省了抗體使用量。
[0025] 說明書附圖
[0026] 圖1為本發(fā)明膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明實施例4試紙條靈敏度測試結(jié)果圖；
[0028] 圖3為本發(fā)明實施例4試紙條穩(wěn)定性測試保存溫度選擇；
[0029] 圖4為本發(fā)明實施例4試紙條穩(wěn)定性測試室溫保存10天、30天、60天、90天試紙 條性能對比；
[0030] 圖5為本發(fā)明實施例5樣品測試的豬肉組織粗提取方法選擇檢測結(jié)果，其中，從左 至右依次為粗提取方法一、方法二、方法三、方法四經(jīng)加標后的檢測結(jié)果；
[0031] 圖6為本發(fā)明實施例5樣品測