一種羧基微球標(biāo)記蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫診斷試劑盒制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種新的、成本低、操作 簡便的羧基微球標(biāo)記蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納米微球被廣泛地應(yīng)用于體外診斷試劑中，極大地提高了試劑的靈敏度，可以檢 測到樣本含量極微的物質(zhì)。納米微球在診斷試劑中作為載體，大小均一，微球表面包被抗 體、抗原等蛋白分子，蛋白分子吸附到納米微球上，方法有兩種：物理吸附和化學(xué)偶聯(lián)。物理 吸附是比較傳統(tǒng)有效的方法，但是其也有對(duì)體系變化敏感，穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)；化學(xué)偶聯(lián)可以 避免這些缺陷?；瘜W(xué)偶聯(lián)狹義上是指利用市售的活性交聯(lián)劑，把蛋白和納米微球通過化學(xué) 反應(yīng)連接在一起，一旦連接成功，納米微球會(huì)非常穩(wěn)定。
[0003] 用于化學(xué)偶聯(lián)的納米微球表面會(huì)被修飾一些化學(xué)基團(tuán)，譬如羧基、氨基、羥基等， 其中羧基微球應(yīng)用比較廣泛。把羧基活化，進(jìn)一步與抗體等蛋白分子交聯(lián)，目前普遍的方法 有兩種：一步法，是指在合適條件下，把交聯(lián)劑碳二亞胺（EDC)、羧基微球和蛋白分子三種 成分混合在一起，反應(yīng)1個(gè)小時(shí)以上，再終止反應(yīng)，離心或者切向流過濾等方法把羧基微球 分離出來；兩步法，引入了另外一種試劑，即N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)或Sulfo-NHS，具體 操作為先在羧基微球中同時(shí)加入EDC和NHS或Sulfo-NHS，室溫活化5~20min，再通過離 心或切向流過濾等方法去掉多余的EDC和NHS或Sulfo-NHS，然后用pH7~9的緩沖液重 懸，加入抗體室溫反應(yīng)3h以上，再通過離心或切向流過濾等方法把偶聯(lián)了蛋白分子的羧基 微球分離出來，用合適的緩沖液重懸儲(chǔ)存。
[0004] 一步法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，利用EDC作為交聯(lián)劑，雖然比較簡便，但是這種方法不 可控，最終產(chǎn)物除了目的產(chǎn)物外，可能還會(huì)有大量的多個(gè)抗體自連產(chǎn)物，這樣不僅浪費(fèi)抗 體，還大大降低了反應(yīng)率。二步法是利用EDC和NHS或Sulfo-NHS作為交聯(lián)劑，因?yàn)榉磻?yīng)是 分步進(jìn)行，第一步活化羧基，洗滌微球后再加入抗體，所以反應(yīng)的方向是一定的，具有可控 性，活化后洗滌微球最常用有兩種方法，一是離心，這種方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且高速離心 過程中微球的距離越來越近，表面電荷相互作用，可能會(huì)導(dǎo)致微球的自連沉淀，嚴(yán)重影響偶 聯(lián)的效率；二是切向流過濾，這種方法不會(huì)導(dǎo)致膠乳沉淀，但是其耗時(shí)較長，影響第二步反 應(yīng)的效率；如果是磁性羧基微球，則比較方便，可以使用磁性分離系統(tǒng)洗滌微球。兩種化學(xué) 偶聯(lián)的方法的共同缺點(diǎn)是對(duì)反應(yīng)條件的要求比較苛刻，比如一步法必須在偏酸性環(huán)境下反 應(yīng)，兩步法的第一步必須在偏酸性環(huán)境下，第二步最好在偏堿性環(huán)境下。因此本領(lǐng)域迫切需 要一種偶聯(lián)反應(yīng)可控、有效，操作簡便的羧基微球偶聯(lián)蛋白的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡便、成本低、用時(shí)少、偶聯(lián)效率高的羧基微球標(biāo) 記蛋白的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一種羧基微球標(biāo)記蛋白的方法，包括以下步驟：
[0007] (1)將羧基微球溶于活化液中，所述活化液為10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0 ;
[0008] (2)按照EDC與羧基微球表面羧基含量的摩爾比0? 8~2:1，向步驟（1)的體系中 加入EDC ;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其與EDC的摩爾比為1~3 :1，邊加邊攪拌；
[0009] (3)立即調(diào)節(jié)步驟⑵體系的pH值為8~10,調(diào)節(jié)完畢立即加入待標(biāo)記的蛋白， 攪拌；
[0010] (4)使微球與未標(biāo)記蛋白分離，用儲(chǔ)存液重懸微球，所述儲(chǔ)存液為10~50mM Tris，0. 1 ~1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 0 ~8. 0〇
[0011] 本發(fā)明所述的羧基微球?yàn)轸然z乳微球或羧基磁性微球。
[0012] 本發(fā)明方法步驟（1)中，羧基微球溶于活化液的終濃度為0. 5%~1%，所述％為 質(zhì)量百分比。
[0013] 本發(fā)明方法步驟（2)攪拌時(shí)間為10~20min。攪拌方法可以為磁珠攪拌，也可以 為玻棒攪拌。
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明方法步驟（2)中，EDC與羧基微球表面羧基含量的摩爾比為1:1， EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩爾比為 1:1。
[0015] 本發(fā)明方法步驟（3)加入待標(biāo)記蛋白后使其終濃度為0. 1~lmg/mL。
[0016] 本發(fā)明所述的膠乳微球，直徑大小為50~200nm，表面羧基含量為0. 1~ 0. 3mmol/g，大小均一。
[0017] 本發(fā)明所述的待標(biāo)記蛋白可以為抗原、抗體、親和素等其他應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域 的診斷、檢測用蛋白。待標(biāo)記蛋白的初始濃度5~1 Omg/mL。
[0018] 本發(fā)明方法步驟（3)攪拌時(shí)間為2~4h。
[0019] 本發(fā)明方法步驟（4)用儲(chǔ)存液重懸膠乳顆粒使其終濃度為0. 5%~1%，所述％為 質(zhì)量百分比。
[0020] 步驟（4)中的分離方法可采用離心或者切向流過濾方法是膠乳顆粒與未連接的 抗原、抗體或其他待標(biāo)記的蛋白分離。
[0021] 本發(fā)明提供了上述方法在制備適用于免疫比濁法的抗原或抗體檢測試劑盒中的 應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種以羧基膠乳微球?yàn)檩d體的檢測試劑盒，含有R1試劑和R2試 劑，
[0023] 其中R1試劑為：在10~50mM Tris，pH值為7~9的緩沖液中加入終濃度為2. 5% 的NaCl、0. 5%的Tween-20,攪拌均勻即得；
[0024]R2試劑通過以下方法制備得到：
[0025] (1)將羧基膠乳微球溶于活化液中，所述活化液為10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0026] (2)按照EDC與羧基膠乳微球表面羧基含量的摩爾比0.8~2:1，向步驟⑴的體 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其與EDC的摩爾比為1~3 :1，邊加邊攪拌；
[0027] (3)立即調(diào)節(jié)步驟⑵體系的pH值為8~10,調(diào)節(jié)完畢立即加入待標(biāo)記的蛋白， 攪拌；
[0028] (4)使微球與未標(biāo)記蛋白分離，用儲(chǔ)存液重懸微球，所述儲(chǔ)存液為10mM Tris， 0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0029] 進(jìn)一步地，R2試劑制備方法的步驟（2)中，EDC與羧基微球表面羧基含量的摩爾比 為 1:1，EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩爾比為 1:1。
[0030] 進(jìn)一步地，R2試劑制備方法的步驟（3)中，立即調(diào)節(jié)步驟（2)體系的pH值為9. 5。
[0031] R2試劑制備方法的步驟（4)中，用儲(chǔ)存液重懸膠乳微球使其終濃度為0. 05 %~ 〇. 1%，所述％為質(zhì)量百分比。
[0032] 本發(fā)明還提供一種以羧基磁性微球?yàn)檩d體的檢測試劑盒，含有磁微粒分離試劑， 所述磁微粒分離試劑是通過以下方法制備得到的：
[0033] (1)將羧基磁性微球溶于活化液中，所述活化液為10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0034] (2)按照EDC與羧基磁性微球表面羧基含量的摩爾比0? 8~2:1，向步驟（1)的體 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其與EDC的摩爾比為1~3 :1，邊加邊攪拌；
[0035] (3)立即調(diào)節(jié)步驟⑵體系的pH值為8~10,調(diào)節(jié)完畢立即加入待標(biāo)記的蛋白， 攪拌；
[0036] (4)使羧基磁性微球與未標(biāo)記蛋白分離，用儲(chǔ)存液重懸微球，所述儲(chǔ)存液為10mM Tris,0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0037] 優(yōu)選地，步驟（2)EDC與羧基微球表面羧基含量的摩爾比為1:1，EDC:NHS或 Sulfo-NHS的摩爾比為1:1。
[0038] 步驟（4)中，用儲(chǔ)存液重懸膠乳微球使其終濃度為0. 05%~0. 1%，所述％為質(zhì)量 百分比。
[0039] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，偶聯(lián)的待標(biāo)記蛋白為鏈霉親和素。將偶聯(lián)了鏈霉親和 素的羧基磁性微球用10mM Tris，0. 1 % BSA，0. 1 % NaN3, pH 7. 50的溶液稀釋到0. 01 %。
[0040] 本發(fā)明的羧基微球標(biāo)記蛋白的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0041] (1)操作簡便，實(shí)現(xiàn)羧基微球與待標(biāo)記蛋白的高效偶聯(lián)。
[0042] (2)通過加入合適比例的交聯(lián)劑，使微球表面的羧基數(shù)量和活化的羧基數(shù)量處于 最佳比例，有利于蛋白標(biāo)記和應(yīng)用于膠乳免疫比濁試劑盒中。
[0043] (3)通過調(diào)節(jié)pH值使得反應(yīng)體系快速從利于活化的條件轉(zhuǎn)為利于蛋白標(biāo)記的狀 態(tài)，且針對(duì)傳統(tǒng)的兩步法進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)于羧基膠乳微球，傳統(tǒng)的兩步法通過離心等方法洗 滌微球后再加待標(biāo)記蛋白進(jìn)行反應(yīng)，而本發(fā)明方法在加入待標(biāo)記蛋白前，省去了離心或切 向流過濾的步驟，避免了膠乳顆粒沉淀和活化的中間產(chǎn)物水解；對(duì)于羧基磁性微球，傳統(tǒng)的 兩步法通過磁性分離系統(tǒng)洗滌微球后再加待標(biāo)記蛋白進(jìn)行反應(yīng)，而本發(fā)明省去了洗滌這一 個(gè)步驟，節(jié)約了時(shí)間，在活化中間產(chǎn)物半衰期之內(nèi)盡快進(jìn)行下一步反應(yīng)。
[0044] (4)與現(xiàn)有技術(shù)的微球標(biāo)記方法相比，經(jīng)過本發(fā)明方法能夠有效降低試劑的用量， 節(jié)省了成本。
【附圖說明】
[0045] 圖1為根據(jù)BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0046]圖2為采用本發(fā)明實(shí)施例2制得的試劑盒對(duì)6種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果作的標(biāo) 準(zhǔn)曲線圖。
[0047] 圖3為采用本發(fā)明實(shí)施例4制得的試劑盒檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0049] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段； 實(shí)施例中所用的試劑為市售商品。本發(fā)明實(shí)施例所述的活化液為10~50mM MES，pH5. 0~ 7. 0 ;所述儲(chǔ)存液為 10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 5。
[0050] 實(shí)施例1羧基膠乳微球標(biāo)記胱抑素C抗體
[0051] 胱抑素C抗體為東方酵母公司產(chǎn)品，多抗，濃度為15mg/mL。該抗體僅與人胱抑素 C反應(yīng)，與其他抗原無交叉免疫反應(yīng)，基本滿足本試驗(yàn)所需。膠乳微球?yàn)镴SR公司產(chǎn)品，粒 徑為61nm，羧基含量為0. 190mmol/g，濃度為5. 2%，溶液為0. 09%疊氮化鈉的純化水。EDC 和NHS為Pierce公司產(chǎn)品。
[0052] 膠乳微球用10mM MES，pH 6. 00的活化液配制成0. 5%的溶液，攪拌均勻，根據(jù)膠 乳顆粒表面的羧基含量，按照摩爾比EDC:NHS: -C00H = 1:1:1的比例，計(jì)算所需EDC和NHS 的量，稱取后直接加入到膠乳微球溶液中，邊加邊攪拌，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)15min。立即用NaOH 調(diào)節(jié)膠乳顆粒溶液pH值為9. 80,隨即加入用活化液稀釋了濃度為5mg/mL的胱抑素C抗 體，使抗體終濃度為〇. 5mg/mL，邊加邊攪拌，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h。反應(yīng)完成后，離心清洗膠乳 顆粒，最后使連接有胱抑素C抗體的膠乳微球保存在10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 50的溶液中，微球濃度為0. 5%，可以長期保存。
[0053] 可以通過測定離心后上清中的胱抑素C抗體剩余量來測定抗體的偶聯(lián)