一種慶大霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。特別是檢測(cè)牛奶、奶粉等樣 品中慶大霉素殘留量的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 慶大霉素（Gentamicin)是由小單胞菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素。廣泛 應(yīng)于質(zhì)量革蘭氏陰性菌引起的感染。慶大霉素抗菌譜較廣，可以有效抑制細(xì)菌的生長和繁 殖，是目前中國農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)常用的獸藥之一。但是隨著慶大霉素的廣泛使用，一 些細(xì)菌逐漸對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性，而且對(duì)腦神經(jīng)、聽覺以及腎臟的損害嚴(yán)重，隨著該藥物的大 量使用，其殘留檢測(cè)也漸漸被人們所重視。我國及歐盟對(duì)慶大霉素的殘留有嚴(yán)格要求，在牛 奶中的最大殘留限量不能高于1〇〇yg/kg。
[0003] 慶大霉素殘留量常用的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、氣相色譜法 (GC)、高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法（HPLC-MS/MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS)、薄層色 譜法（TLC)、免疫測(cè)定法等。由于昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜繁瑣的操作過程，以及對(duì)檢驗(yàn)人員 的高技能要求，使得上述儀器檢測(cè)方法不適合大量樣品的篩查。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和膠體金 免疫層析檢測(cè)法雖然屬于快速篩檢方法，但由于方法靈敏度較低，假陰性率和假陽性率較 高，逐漸被靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)時(shí)間短的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法所替代，磁免疫化學(xué) 發(fā)光免疫檢測(cè)試劑配套磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)食品中慶大霉素的殘留，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程 的全自動(dòng)化，減少人為操作誤差，靈敏度可達(dá)到〇. 1yg/L，準(zhǔn)確度高，檢測(cè)成本低，適用于大 批量樣品中慶大霉素殘留量的篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題自在于提供一種慶大霉素檢測(cè)試劑盒，采用該試劑盒 進(jìn)行慶大霉素的檢測(cè)時(shí)具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種慶大霉素的檢測(cè)方法，采用該試劑盒配合化學(xué) 發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行慶大霉素的檢測(cè)時(shí)不僅具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，而且實(shí)現(xiàn)了 全自動(dòng)化檢測(cè)，縮短檢測(cè)時(shí)間，減少人為操作誤差。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種慶大霉素檢測(cè)試劑盒，其包含的主要試劑有：酶 標(biāo)抗原、酶標(biāo)抗原稀釋液、磁標(biāo)抗體、磁標(biāo)抗體稀釋液、慶大霉素系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液、化學(xué)發(fā)光 底物A、B液。
[0007] 所述的酶標(biāo)抗原是辣根過氧化物酶標(biāo)記的慶大霉素半抗原的標(biāo)記物，慶大霉素半 抗原是用重鉻酸吡啶將慶大霉素原藥中的醇羥基氧化成酮基，得到單酮基慶大霉素，然后 單酮基慶大霉素與對(duì)甲酸苯肼進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到帶有羧基的慶大霉素半抗原產(chǎn)物。
[0008] 所述磁標(biāo)抗體是慶大霉素單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)得到。
[0009] 所述磁珠表面含有-0H、-C00H或_順2活性基團(tuán)。
[0010] 所述慶大霉素單克隆抗體是由慶大霉素半抗原與牛血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作 為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得。
[0011] 所述化學(xué)發(fā)光底物A液為含有魯米諾和對(duì)甲苯酚的三羥甲基氨基甲烷的溶液。化 學(xué)發(fā)光液B液為含有檸檬酸、無水Na2HP0jPC0(NH2) 2 ?H202的水溶液。
[0012] 所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃縮復(fù)溶液和濃縮洗滌液。
[0013] 所述試劑盒可以配套化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行動(dòng)物源性樣品中慶大霉素殘留量的檢 測(cè)。
[0014] 本發(fā)明還提供一種利用試劑盒配套化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)慶大霉素的方法，包括下列步 驟：
[0015] 1)將酶標(biāo)抗原與酶標(biāo)抗原稀釋液按照1:10~1:20的體積比進(jìn)行稀釋，裝入化學(xué) 發(fā)光檢測(cè)儀酶標(biāo)抗原工作液容器中；
[0016] 2)將磁標(biāo)抗體與磁標(biāo)抗體稀釋液按照1:10~1:20的體積比進(jìn)行稀釋，裝入化學(xué) 發(fā)光檢測(cè)儀磁標(biāo)抗體工作液容器中；
[0017] 3)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀自分別動(dòng)吸取30yL~80yL酶標(biāo)抗原、30yL~80yL樣品 提取液和30yL~80yL磁標(biāo)抗體，依次加入到反應(yīng)區(qū)，在室溫下反應(yīng)15min，在磁分離區(qū)分 離4min，棄上清液后用洗滌液300yL~500yL對(duì)復(fù)合物沉淀清洗3~5次；
[0018] 4)將分離好的復(fù)合物放入測(cè)量暗箱，加入化學(xué)發(fā)光底物A液和B液各30yL~ 80yL，檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度（RLU)，樣品中慶大霉素的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以 通過RLU標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算慶大霉素的殘留濃度。
[0019] 本發(fā)明中分析測(cè)試方法所用的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀包括電源電路、反應(yīng)杯存儲(chǔ)裝置、 樣品存儲(chǔ)裝置、樣品臂、試劑存儲(chǔ)裝置、試劑臂、運(yùn)動(dòng)式冷藏裝置、清洗裝置、自動(dòng)注射泵、微 光檢測(cè)器，同時(shí)還配置有計(jì)算機(jī)與中文界面的Windows控制軟件，可進(jìn)行資料錄入、結(jié)果匯 總、質(zhì)量控制、結(jié)果存儲(chǔ)和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報(bào)告 結(jié)果，自動(dòng)生成并儲(chǔ)存和更新功能，兩點(diǎn)自動(dòng)修正標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020] 本發(fā)明所述的酶標(biāo)抗原是辣根過氧化物酶標(biāo)記的慶大霉素半抗原的標(biāo)記物，其保 存于含？耵.2~7.6，含吐溫0.03%~0.05%吐溫-20,0.02111〇1/1~0.05111〇1/1的磷酸鹽 緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0021] 所述酶標(biāo)抗原稀釋液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04濃度為0? 01mol/L、NaCl濃度為 0? 25mol/L的緩沖溶液。
[0022] 所述磁標(biāo)抗體是慶大霉素單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)得到。磁珠表面基團(tuán)的含量是 0?leq/g~0? 3eq/g，所述磁標(biāo)抗體保存在pH7. 2~7. 6,含吐溫0? 1 %~0? 3 %吐溫-20， 0. 02mol/L~0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0023] 所述磁標(biāo)抗體稀釋液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04濃度為0? 02mol/L、NaCl濃度為 0? 3mol/L的緩沖溶液。
[0024] 所述慶大霉素單克隆抗體通過慶大霉素半抗原與牛血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作 為免疫原免疫Balb/c小鼠、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選、亞克隆和小鼠腹水的效價(jià)測(cè)定 得到。
[0025] 所述化學(xué)發(fā)光底物A液為魯米諾含量為0. 01yg/L~0. 03yg/L、對(duì)甲苯酷含量 為0? 001yg/L~0? 005yg/L、pH為8. 0~9. 0的三輕甲基氨基甲燒溶液，B液為每100mL 水溶液含檸檬酸1.7§~2.3§，無水似2即0 42.2§~3.(^和體積百分含量為0.75%的 C0(NH2) 2 ?H2020. 5mL~0? 8mL。
[0026] 所述慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為：0 yg/L、0. 1yg/L、0. 3yg/L、0. 6yg/L、 1.8 1^/1、5.41^/1，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為口117.4，含0.05%吐溫-20,0.05111〇1/1的磷酸鹽緩沖 液。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0027] 所述濃縮復(fù)溶液具體為濃縮磷酸鹽緩沖液，是每升含4. 0g~7. 0g的 NaH2P04 ? 2H20、30. 0g~33. 0gNa2HP04 ? 12H20 的水溶液。
[0028] 所述濃縮洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)0? 02 %~0? 06 %吐溫-20的pH= 7. 4~7. 6， 0? 2mol/L~0? 5mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0029] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0030] 1)本發(fā)明試劑盒的具有較高的靈敏度和特異性，對(duì)慶大霉素的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到 0. 3yg/L〇
[0031] 2)本發(fā)明試劑盒配套化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)樣品中慶大霉素殘留量進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)檢 測(cè)過程的全自動(dòng)化，減少人為操作誤差，檢測(cè)時(shí)間短，僅需20min即可完成對(duì)樣品中慶大霉 素殘留量的檢測(cè)。
【附圖說明】
[0032] 圖1為慶大霉素半抗原合成反應(yīng)式。
[0033] 圖2為慶大霉素半抗原核磁共振氫譜圖。
[0034] 圖3為本發(fā)明磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 實(shí)施例1:試劑盒具體組分的制備
[0036] 1.慶大霉素半抗原合成
[0037] 慶大霉素半抗原是用重鉻酸吡啶將慶大霉素原藥中的醇羥基氧化成酮基，得到單 酮基慶大霉素，然后單酮基慶大霉素與對(duì)甲酸苯肼進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到帶有羧基的慶大霉 素半抗原產(chǎn)物。取〇. 6g~1. 2g慶大霉素加入到N，N_二甲基甲酰胺中溶解，再加入0. 80g~ 0. 85g重鉻酸吡啶，攪拌，加入0.lmL~0. 5mL乙酸，60°C油浴加熱攪拌6h，待反應(yīng)完全，停 止反應(yīng)并蒸干，加水和乙酸乙酯萃取，干燥，乙醇重結(jié)晶，得到產(chǎn)物1。取產(chǎn)物1加甲醇溶解， 再加0.lg~0. 6gK2C03，攪拌，向其中加入0. 2g~0. 7g甲酸苯肼，在室溫下攪拌8h，待有 沉淀物析出離心分離，用乙醇洗滌，再加乙酸乙酯重結(jié)晶得到慶大霉素半抗原產(chǎn)物0. 3g~ 0. 6g。合成反應(yīng)式如圖1所示。
[0038] 取上述慶大霉素半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁氫譜測(cè)定，如圖2所示，化學(xué)位移S=llppm 的位置為羧基氫共振吸收峰，化學(xué)位移S=7. 8、6.8ppm的位置為苯環(huán)上的氫共振吸收峰， 證明間隔臂連接成功，慶大霉素半抗原合成成功。
[0039] 2?酶標(biāo)抗原的制備
[0040] 取18mg~25mg慶大霉素半抗原，溶解于0? 8mL~1. 2mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF) 中；取25mg~30mg二氯乙烷（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)用0?lmL~0? 3mL水充 分溶解后加入半抗原溶解液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A;稱取辣根過氧化物酶 (HRP) 40mg~55mg，使之充分溶解在pH7. 2, 3. 8mL的磷酸鹽緩沖液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢 滴加到HRP溶液中，并于室溫下攪拌24h;用0.Olmol/L的磷酸鹽緩沖液于4°C透析3天，每 天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到慶大霉素酶標(biāo)抗原；分裝，于-20°C保存 備用。
[0041] 3.免疫原的制備
[0042] 將HRP30mg~70mg替換為牛血清白蛋白（BSA)40mg~60mg，制備方法同上，得到 免疫原。
[0043] 4.慶大霉素單克隆抗體的制備
[0044]A)動(dòng)物免疫：用上述制備出的免疫原（RAC-BSA)按100yg/只，以生理鹽水溶解 免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Balb/c雌鼠，初次免 疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以 免疫復(fù)合物100Ug/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。
[0045]B)細(xì)胞融合：按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的小鼠骨 髓瘤細(xì)胞（SP2/0)混合，然后在45秒內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑（PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT 培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37°C，5 %C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時(shí)候進(jìn)行全換液。
[0046]C)雜交瘤細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩 選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原（預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其 最佳包被濃度和陽性血清稀釋度）包被酶標(biāo)板，加入被測(cè)孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗