一種食品中維生素的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品維生素含量檢測分析領(lǐng)域，特別是涉及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜法檢測食品中維生素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素是生命維持生理功能所必需的有機化合物，在食物的天然成分中含量極 少，盡管微量但是對基體的正常生理功能至關(guān)重要，如果缺少或不足將引起特殊的缺失綜 合征。目前已有13種物質(zhì)或物質(zhì)群被普遍認為是維生素，根據(jù)溶解度，可將其分為脂溶性 維生素和水溶性維生素。水溶性維生素的測定方法有微生物法、液相色譜法、高效液相色 譜-質(zhì)譜法等。其中傳統(tǒng)微生物法靈敏度高，應(yīng)用較廣泛，但是其耗時長、操作繁瑣，而且難 以大多數(shù)菌種都不是專一性的，會產(chǎn)生較大檢測誤差；分光光度法和熒光分析法由于測定 基質(zhì)干擾大、靈敏度低，應(yīng)用受到限制；高效液相色譜-質(zhì)譜法可獲得滿意的結(jié)果，但現(xiàn)有 技術(shù)多為單一維生素的檢測方法，使其檢測成本偏高。
[0003] 生物素（Biotin，VB7)，是一種水溶性B族維生素。生物素是構(gòu)成羧化酶的重要輔 酶，參與人體內(nèi)脂肪、糖類和氨基酸的代謝，對于維持機體正常生理功能有重要的作用。其 長期的攝入不足會導致免疫，代謝，基因表達方面的疾病。配方奶粉是嬰幼兒除母乳外主要 的營養(yǎng)來源，因此對其中生物素的檢測監(jiān)督是十分必要的。
[0004] 目前，國內(nèi)外關(guān)于生物素的檢測方法都比較復雜，常見的有微生物法、高效液相 法、酶聯(lián)免疫法和液質(zhì)聯(lián)用法。高效液相法的檢測下限過高，酶聯(lián)免疫法的檢測結(jié)果不夠穩(wěn) 定，經(jīng)典的微生物法雖然檢測結(jié)果準確，檢出限低，但檢測周期長，重復性差，費時費力，對 實驗操作環(huán)境有比較嚴格的要求。
[0005] 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法與上述方法相比，具有分離能力強、定性分 析結(jié)果可靠、檢出限低、分析時間快、自動化程度高等優(yōu)點。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu) 勢的互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏性及能夠提供相 對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS-MS)檢測食品（如奶粉） 中生物素的方法，特別地能夠?qū)崿F(xiàn)食品（如奶粉）中生物素、泛酸（Pantothenicacid，VB5)、 氰鈷胺素（Cyanocobalamin，VB12)的同時測定，是一種簡單、快速、準確的分析方法。
[0007] 本發(fā)明方法分離能力強，自動化程度高，檢測快速準確，檢出限低，可達到 0. g/100g，樣品前處理時間縮短為30min，分析快速，單個樣品檢測時間縮短為5min以 內(nèi)。
[0008] 本發(fā)明提供一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品（如奶粉）中生物素含量 的方法，包括以下步驟：
[0009] 1)制備供試樣品
[0010] 稱取樣品，加入水溶解或者乙酸銨緩沖液（5-10mm〇l/L)溶解，渦旋振蕩后超聲提 取1-3次；提取液加入高氯酸或三氯甲烷渦旋振蕩后，離心；上清液用超純水稀釋，經(jīng)微濾 膜過濾后即為供試樣品；
[0011] 例如，稱取樣品〇. 1-1. 〇g于50mL離心管中，按照1:5-1:20 (優(yōu)選1:10)的比例 (樣品重量與水或乙酸銨緩沖液體積之比）加入水或5-10mmol/L乙酸銨緩沖液（優(yōu)選 10mmol/L)溶解，潤旋振蕩l-3min(優(yōu)選lmin)，超聲5-20min(優(yōu)選lOmin);提取液按照 1:5-20 (優(yōu)選1:10)的體積比加入高氯酸或三氯甲燒，潤旋振蕩l-3min(優(yōu)選lmin)，離心 (10000r/min離心lOmin);上清液用超純水適當稀釋，經(jīng)0.22iimGHP(親水性聚丙烯）濾 膜過濾后即為供試樣品；
[0012] 2)超高效液相色譜測定
[0013] 將步驟1)的供試樣品進行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，色譜條件為：
[0014] 色譜柱：WatersAcquity?HSST3 柱（1.OmmX100mm, 1. 8um)或BEH018柱 (lOOmmX2. 1mm, 1. 7um);
[0015] 流速：0? 2-0. 4mL/min;
[0016] 柱溫：30-40°C;(優(yōu)選 40°C);
[0017] 樣品溫度：10_15°C(優(yōu)選 15°C);
[0018] 進樣量：10iiL;
[0019] 流動相A:5-10mmol/L乙酸銨緩沖液（含0? 1%甲酸）；（優(yōu)選lOmmol/L);
[0020] 流動相B:乙腈；
[0021] 梯度洗脫；
[0022] 流動相梯度洗脫條件
【主權(quán)項】
1. 一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中生物素含量的方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1) 制備供試樣品 稱取樣品，加入水溶解或者乙酸銨緩沖液（5-10mm〇l/L)溶解，渦旋振蕩后超聲提取 1-3次；提取液加入高氯酸或三氯甲烷渦旋振蕩后，離心；上清液用超純水稀釋，經(jīng)微濾膜 過濾后即為供試樣品； 2) 超高效液相色譜測定 將步驟1)的供試樣品進行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，色譜條件為： 色譜柱：Waters Acquity@HSST3 柱（1.0mmX100mm，1.8iim)或BEH018柱(lOOmmX2. 1mm，1. 7um); 流速：〇? 2-0. 4mL/min; 柱溫：30-40°C;(優(yōu)選 40°C); 樣品溫度：10_15°C(優(yōu)選15°C); 進樣量：10iiL; 流動相A:5-10mmol/L乙酸銨緩沖液（含0? 1 %甲酸）；（優(yōu)選10mmol/L); 流動相B:乙腈； 梯度洗脫； 流動相梯度洗脫條件
3) 質(zhì)譜測定 離子源：電噴霧離子源正離子模式（ESI+); 監(jiān)測方式：多反應(yīng)檢測（MRM); 毛細管電壓：1. 5-2. 3kv;(優(yōu)選1. 5kv) 離子源溫度：150°C; 脫溶劑氣溫度：500°C; 錐孔氣流量（氮氣）：50L/h; 脫溶劑氣流量（氮氣）：700-1000L/h;優(yōu)選1000L/h; 碰撞氣流速（氦氣）：〇? 17mL/min; 母離子m/z= 245. 1，子離子m/z= 227和97,錐孔電壓20_30v(優(yōu)選22v)，碰撞能量 分別為 10_20ev(優(yōu)選 14ev)和 30_40ev(優(yōu)選 30ev); 4)計算結(jié)果 通過調(diào)整y軸截距（X=x+b/a)，由線性方程y=ax+b得到校正方程y=aX，y代表 峰面積，X代表樣品中分析物的濃度；取樣品經(jīng)樣品前處理后上機測試，得到峰面積，并根 據(jù)校正方程和稀釋倍數(shù)計算出樣品中分析物的濃度，平行測定6次（n= 6)，可以得到測定 結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中生物素含量的方 法，其特征在于，所述方法還包括標準工作液的配制：即精確稱取生物素標準品適量（精確 至0.Olmg)用水溶解，配制成100iig/mL的儲備液，冷藏避光保存；臨用時，用水稀釋成標準 系列濃度溶液，經(jīng)微濾膜（如〇. 22ymGHP濾膜）過濾，進行UPLC-MS-MS分析檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中生物素含量 的方法，其特征在于，步驟1)所述的制備供試樣品為稱取樣品〇. 1-1. 〇g于50mL離心管 中，按照1:5-1:20(優(yōu)選1:10)的比例（樣品重量與水或乙酸銨緩沖液體積之比）加入水 或5-10mmol/L乙酸銨緩沖液（優(yōu)選10mmol/L)溶解，潤旋振蕩l-3min(優(yōu)選lmin)，超聲 5-20min(優(yōu)選lOmin);提取液按照1:5-20 (優(yōu)選1:10)的體積比加入高氯酸或三氯甲烷， 潤旋振蕩l-3min(優(yōu)選lmin)，離心（10000r/min離心10min);上清液用超純水適當稀釋， 經(jīng)0.22