專利名稱：一種生物技術(shù)用于物品防偽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防偽技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及抗原-抗體反應(yīng)用于物品防偽的方法。
目前，假冒偽造已成世界范圍內(nèi)的一大公害。隨之而來，防偽制品也成為保證真品，維護(hù)消費(fèi)者利益必不可少的重要措施。傳統(tǒng)的防偽標(biāo)識大多是物理或化學(xué)性質(zhì)的制品，如激光全息、光學(xué)變色膜、圖象擾頻、熱變油墨、磁條、智能卡、軟件鎖等等。但由于受其本身物理或化學(xué)特性的限制，這些防偽標(biāo)識都有一定的局限性、易仿性和非特異性的缺點(diǎn)，而利用現(xiàn)代分子生物學(xué)所具有的特異性、難仿性和難破譯性的特點(diǎn)研制的防偽制品，可彌補(bǔ)物理方法或化學(xué)方法的不足。
眾所周知，抗原-抗體反應(yīng)是生物界廣泛存在的現(xiàn)象，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域里已研究多年，使用廣泛。近代示蹤，標(biāo)記技術(shù)也已趨成熟并廣為使用。自然界存在無法計(jì)數(shù)的抗原物質(zhì)，抗原與抗體之間呈現(xiàn)高度的專一性反應(yīng)，即特異性反應(yīng)。采用自然界的天然抗原和人工制備的抗原，可以很容易地在動(dòng)物體內(nèi)或體外培養(yǎng)細(xì)胞中制造出抗體，純化的抗原或抗體均可加以標(biāo)記，以識別相應(yīng)的抗體或抗原，用肉眼可見或用儀器檢測，就像鑰匙識別鎖一樣。將這種生物物質(zhì)(抗原或抗體)加于防偽物品之中或附于其表面，就可以像用已知的鑰匙去識別加密的鎖，以辯真?zhèn)?。這種技術(shù)的特點(diǎn)是高度專一、準(zhǔn)確、應(yīng)用廣泛、可選性強(qiáng)，使用方法或簡或繁，依加密目的級別而可調(diào)整。既可加于被防偽物品之中，又可附于其外，是一種不可破譯的現(xiàn)代生物隱形防偽技術(shù)。
在新型的生物防偽技術(shù)方面，已有EP O 327 163 A2。該專利以m-苯氧基苯甲酸(半抗原)為防偽標(biāo)識物質(zhì)，和蛋白質(zhì)連接做成完全抗原而制成單克隆抗體。此種抗體可以加入水溶性或油溶性液體之中，即用于液相物品(標(biāo)記物和被檢物均混于液相)，檢測方法是用試劑盒。檢測原理為六十年代發(fā)展起來的競爭性酶聯(lián)免疫法。本發(fā)明人等在這方面已進(jìn)行了長時(shí)間的研究，并于1996年申請了“核酸密碼分析技術(shù)應(yīng)用于防偽的方法”的專利(申請?zhí)?6109232.7，申請日960802)，現(xiàn)在為了完善和進(jìn)一步發(fā)展生物防偽技術(shù)，特提出“一種生物技術(shù)用于物品防偽的方法”。本發(fā)明的方法與上述歐洲專利不同之處是采用固相物品，標(biāo)記于被檢物的一定位置，檢測方法是采用八十年代發(fā)展起來的非競爭性快速斑點(diǎn)免疫結(jié)合反應(yīng)技術(shù)(包括斑點(diǎn)免疫滲濾法、滴金免疫測定法、斑點(diǎn)免疫層析法)、致敏乳膠凝集技術(shù)、熒光素標(biāo)記技術(shù)和化學(xué)熒光技術(shù)等。
本發(fā)明的目的在于，提供一種辨別真?zhèn)胃叨葴?zhǔn)確、靈敏、保密性強(qiáng)、難破譯和偽造、用途廣泛、技術(shù)性強(qiáng)和使用方便的防偽方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的特征在于利用抗原-抗體反應(yīng)技術(shù)鑒別物品的真?zhèn)危瑢⒖乖蚩贵w及其標(biāo)識物固定于固相物品上，檢測方法采用非競爭性免疫技術(shù)；使用的抗原-抗體為天然存在的或人工合成的，具有免疫原性和反應(yīng)原性的蛋白質(zhì)或多肽、核酸或多核苷酸、多糖或寡糖、類固醇以及類脂；抗體制備是采用單克隆抗體技術(shù)或多克隆抗體技術(shù)；所使用的非競爭性免疫技術(shù)的測定方法為免疫斑點(diǎn)結(jié)合測定；免疫金屬離子(金、銀)及硒的標(biāo)記測定；致敏微球(人工、天然)測定；熒光素標(biāo)記測定；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記測定；本防偽方法可用于下列固相物品的防偽，如文物、衣物、皮革制品、中藥、西藥、食品、保健品、香煙、化肥、農(nóng)藥、種子、工藝品、汽車、摩托車、建筑材料、電器、磁盤、光盤、計(jì)算機(jī)、錄像機(jī)、攝像機(jī)、照相機(jī)、通訊器材、音響、電視機(jī)、手機(jī)、儀表、珠寶首飾、醫(yī)療器械，以及紙張、塑料和尼龍制造的文件、證件、證券、信用卡、發(fā)票、紙幣、商標(biāo)、海關(guān)申報(bào)單、字畫、古董、圖書。
本防偽方法也可用于下列流體和半流體物品的防偽，如酒類、飲料、化學(xué)試劑、印泥、油墨、墨水、油類、潤滑油、化妝品、有機(jī)溶劑、保健食品、發(fā)酵食品、化肥、農(nóng)藥、石油制品、生物制品、藥物制品。
本防偽方法還可用于所述固相物品、流體和半流體物品的包裝、商標(biāo)、容器、瓶蓋或任何的其他附屬物。
下面，結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1制備作為防偽標(biāo)識的抗原。用人胎盤丙種球蛋白作防偽標(biāo)識抗原，其提純方法如下取健康產(chǎn)婦胎盤一個(gè)，絞成肉糜，加750mL蒸餾水，懸浮組織，再加NaCl至4％，加苯酚至0.3％防腐，攪勻。浸泡過夜。在10000rpm離心30分鐘，吸出上清，棄沉淀。加等體積飽和硫酸銨，攪勻，放置1小時(shí)，離心，收集沉淀。沉淀懸于500mL蒸餾水，加明礬至10％，pH4.2，離心棄沉淀。用1N NaOH調(diào)pH 7.7-7.9。此時(shí)產(chǎn)生AL(OH)3膠體，過濾。澄清之濾液含丙種球蛋白，加等量飽和硫酸銨，即產(chǎn)生丙種球蛋白沉淀，離心，用0.01mol/L磷酸緩沖液pH7.4透析。
DEAE纖維素離子交換層析用0.01mol/L磷酸緩沖液，pH 7.4，平衡柱體，將上述粗丙種球蛋白上樣過柱，雜質(zhì)吸附在柱上，丙種球蛋白不吸附，被洗脫下來，然后凍干保存。其純度可達(dá)95％以上，足以作為防偽標(biāo)識用。
將蛋白質(zhì)抗原稀釋后吸附在固相物體上，干燥后用物理方法(如塑料薄膜、金屬薄膜等)或化學(xué)方法(如海藻糖、明膠等)進(jìn)行密封，其用量極微。每個(gè)防偽標(biāo)識用0.1微克抗原足夠做檢測。
小分子半抗原本例采用半抗原皮質(zhì)素-21-半琥珀酸偶聯(lián)甲狀腺球蛋白制備抗體，其方法如下取700mg皮質(zhì)素-21-半琥珀酸酯，加15mL二氧六環(huán)使之溶解，然后冷卻至10℃，再加0.35mL三正丁胺和0.91mL氯甲酸異丁酯，生成混合酐，待用。另取130mL二氧六環(huán)/水(1∶1)混合液，加甲狀腺球蛋白2.5g和2.5mL 1N NaOH，在充分?jǐn)嚢韬屠鋮s下將混合酐溶液加入其中。1小時(shí)后加1mL NaOH使pH升至8.5。繼續(xù)攪拌和冷卻3小時(shí)，流水透析過夜。再用1N HCl調(diào)pH 4.5，冷卻過夜。離心，沉淀物用NaHCO3調(diào)至pH5.5，以溶解沉淀。流水透析4小時(shí)，凍干，得1.6g皮質(zhì)素-21-半琥珀酸-甲狀腺球蛋白。該復(fù)合物具有很強(qiáng)的免疫原性，而防偽標(biāo)識抗原則僅用皮質(zhì)素即可。
實(shí)施例2制備防偽標(biāo)識抗原的特異抗體。
將防偽標(biāo)識抗原蛋白(或半抗原-大分子蛋白偶合物)5mg/mL與等體積的福氏佐劑混勻加5mg/mL卡介苗充分乳化后，注射雄性綿羊，在二側(cè)頜下淋巴結(jié)和二側(cè)腹股溝淋巴結(jié)各注射1mL。每隔10天注射一次共二次。以后每周一次，連續(xù)三次。在最后一次注射后一周，采少量血，制成血清，以測定抗體效價(jià)。
抗體效價(jià)測定方法用雙向免疫擴(kuò)散法，具體操作如下。用0.5μ巴比妥緩沖液(pH8.6)配制1％瓊脂糖凝膠，在微波爐中令其融化。當(dāng)融化的瓊脂糖凝膠溫度降至50-55℃時(shí)，傾倒在水平放置的載玻片上，室溫放置15分鐘，4℃放置10分鐘。用直徑3mm的打孔器在玻片中央打一孔。圍繞中心孔周圍5mm距離延圓周方向打5-6個(gè)孔。將作為防偽標(biāo)識的抗原配制100μg/mL濃度的水溶液，取10μL加在中心孔中，羊抗血清成倍稀釋，如1∶2，1∶4，1∶16，1∶32，1∶64，各取10μL加在周圍的孔中。加樣后在濕潤的環(huán)境中37℃保溫過夜。檢查抗原孔與抗體孔之間出現(xiàn)的白色沉淀線。如能在1∶32和1∶64孔出現(xiàn)沉淀線，該抗體作為防偽標(biāo)識的鑒定效果極佳。
當(dāng)抗體滴度超過1∶32時(shí)，可以從免疫效價(jià)高的羊進(jìn)行抗血清制取，方法是從頸動(dòng)脈抽血。血液先置室溫凝固30分鐘，再放37℃溫箱1小時(shí)，最后放4℃冰箱以使血塊收縮凝固。用玻棒將血塊輕輕剝離，收集血清并在5000g4℃離心20分鐘。剝離的血塊攪碎，再置4℃過夜，再次離心，吸取血清?？寡逯瞥珊蠹?.02％NaN3，在-20℃凍存，供進(jìn)一步純化IgG及標(biāo)化用。
實(shí)施例3抗體致敏乳膠凝集法檢測防偽標(biāo)識。
制備作為防偽標(biāo)識的抗原蛋白或多肽的抗體γ-球蛋白(主要含IgG)或F(ab)2片段。將抗血清與等體積的飽和硫酸銨滴加混合，冰箱過夜。次日在1000rpm冷凍離心，沉淀為γ-球蛋白，溶于生理鹽水，透析后進(jìn)行DEAE-52離子交換層析，用0.01M磷酸緩沖液(pH＝7.4)洗脫IgG，即可得到其純品。
制備F(ab)2將純化的IgG用胃蛋白酶水解，然后通過Sephadex G-75柱，用0.1mol/LpH8.0硼酸緩沖液洗脫，收集第一峰，得F(ab)2。
制備致敏乳膠取聚苯乙烯乳膠(直徑0.8μm)，用緩沖液洗滌后加提純的IgG或F(ab)2，置37℃反應(yīng)1小時(shí)。離心充分洗滌致敏乳膠，最后懸浮于含1％牛血清白蛋白的0.01mol/L甘氨酸氯化鈉緩沖液(GBS)中(pH＝9.2)。每毫升乳膠致敏后懸于30mL GBS，置4℃?zhèn)溆谩?br> 將含有某種特定抗原的隱形防偽標(biāo)識取下，用幾滴生理鹽水浸泡數(shù)分鐘，將防偽標(biāo)識中的抗原溶解下來，然后取一滴，點(diǎn)在黑色玻璃板小凹槽內(nèi)(直徑30mm)，加一滴60％聚乙二醇6000-GBS，最后加一滴致敏乳膠，混勻。同時(shí)做一份標(biāo)準(zhǔn)的特定抗原作陽性對照，15分鐘后可用肉眼觀察到在黑色玻璃板背景下，出現(xiàn)清晰的白色凝集顆粒，與標(biāo)準(zhǔn)抗原凝集現(xiàn)象相似。即可判定在防偽標(biāo)識中存在某種抗原，能與該抗原的抗體所致敏的乳膠反應(yīng)，形成凝集作用。如防偽標(biāo)識不存在該種抗原，則不出現(xiàn)白色凝集顆粒，反應(yīng)液體呈清涼透明既可判定檢測樣屬偽品。如果將上述防偽標(biāo)識抗原與致敏乳膠的凝集反應(yīng)置于96孔板中進(jìn)行，則可以通過自動(dòng)比濁分析儀進(jìn)行快速分析記錄。與本法所述化學(xué)乳膠凝集技術(shù)原理類似，也可用抗體致敏的脂質(zhì)體、紅血球或明膠顆粒進(jìn)行凝集試驗(yàn)檢定防偽標(biāo)識中的特定抗原，達(dá)到辨?zhèn)巫R真的目的。在實(shí)用上，化學(xué)乳膠顆?？梢晕皆跒V紙或薄膜上，進(jìn)行固相檢測，更為方便。
實(shí)施例4快速斑點(diǎn)免疫結(jié)合法檢測防偽標(biāo)識。
NC膜預(yù)包被將硝酸纖維素膜(NC，0.22μm至0.45μm)用鉛筆劃出3mm×3mm小格，再浸于0.01mol/L磷酸緩沖液-生理鹽水(PBS)pH＝7.4中30分鐘。然后取出NC膜，用濾紙吸干，在每一小格中加稀釋液的特定的多克隆抗體(或單克隆抗體)2微升，室溫干燥后浸入含15％小牛血清-0.05％吐溫-20的PBS中，43℃作用1.5小時(shí)，再用PBS洗3次，自然干燥后密封于塑料袋中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 將防偽標(biāo)識上的特定抗原用一滴生理鹽水浸泡數(shù)分鐘，以洗脫防偽標(biāo)識上的抗原。
取2μL已洗脫的防偽標(biāo)識抗原，和2μL已知標(biāo)準(zhǔn)抗原分別加于有抗體的NC膜不同小格中央，37℃反應(yīng)10分鐘，PBS洗3次，再將NC膜浸于稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體溶液中，37℃反應(yīng)10分鐘，再用前述含小牛血清和吐溫的PBS充分洗滌。
將上述洗滌的NC膜浸入3，3-二氨基聯(lián)苯胺底物溶液中再用流水沖洗NC膜。即可根據(jù)NC膜小格中央的顏色判定檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)抗原相似有深棕色斑塊的為陽性，表明隱性防偽標(biāo)識中存在待測的特異抗原物質(zhì)，所標(biāo)識的物件為真品。若在小格中央仍為白色而無顏色出現(xiàn)，即可鑒別被檢物為贗品。
與本法相關(guān)或相似以免疫斑點(diǎn)檢定技術(shù)均可包括在本實(shí)施例子。如用堿性磷酸酶代替辣根過氧化物酶進(jìn)行顯色呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，也可用β-半乳糖苷酶和脲酶代替進(jìn)行顯色反應(yīng)；斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測定，先將待測防偽抗原點(diǎn)在NC膜上，經(jīng)BSA封閉，洗凈后，加酶標(biāo)單克隆抗體反應(yīng)，再用底物顯色；所用NC膜也可用尼龍膜代替。
本法也可采用近年來發(fā)展的“斑點(diǎn)免疫滲濾法＂或稱＂免疫濃縮法＂進(jìn)行，其本質(zhì)均是以微孔薄膜作為載體，利用微孔膜的過濾作用和毛細(xì)管作用，使抗體，抗原溶液在滲濾過程中吸附在膜上，多余的水分被膜下吸水墊料吸走，故可在幾分鐘內(nèi)即可用肉眼觀察結(jié)果。
實(shí)施例5快速金銀標(biāo)記免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測防偽標(biāo)識。
制備特定防偽抗原的相應(yīng)抗體抗血清產(chǎn)生參見實(shí)施例1。所得抗血清經(jīng)50％飽和硫酸銨鹽析，透析等步驟，獲得純凈的γ-球蛋白。
膠體金溶液的制備(檸檬酸還原法)取0.01％氯金酸(HAuCl4.H2O，光譜純，上海試劑一廠)水溶液100mL，加熱至沸騰，在磁力攪拌下迅速加入1％檸檬酸三鈉水溶液1mL，約2分鐘后呈藍(lán)紫色，繼續(xù)加熱至變?yōu)槌燃t色為止，冷卻后恢復(fù)到原體積，可獲φ＝30nm顆粒的膠體金溶液。以0.1M K2CO3調(diào)pH至5.8。
金標(biāo)記抗體復(fù)合物的制備將所需量的純化抗體γ-球蛋白及膠體金(pH調(diào)至5.8)在室溫下磁力攪拌混合5分鐘，后加入1％PEG(MW＝20000)使最終濃度為0.05％，即成粗制膠體金結(jié)合物。在12000rpm，4℃離心45-60’，沉淀用50mMPBS(pH7.4)洗3次，最后沉淀用含0.1％NaN3和BSA及PEG的PBS(pH7.4)懸浮至A520nm值約2.5的濃度，最后用Sephacryl-S-300柱層析獲純化的金標(biāo)抗體。
將硝酸纖維素微孔濾膜用鉛筆劃出小方格，然后浸入0.01mol/L的PBS(pH7.4)溶液中，30分鐘后取出，用濾紙吸干多余水分，在小方格中央點(diǎn)4μL按1∶5稀釋的步驟1所純化的γ-球蛋白，干燥后用1％的BSA在37℃封閉兩小時(shí)，Tris緩沖液(pH8.0，含0.05％吐溫-20)洗3次，每次10分鐘。濾紙吸干后，將防偽標(biāo)識抗原樣品用1滴生理鹽水溶解后取25μL點(diǎn)于濾膜小方格中央，待完全吸干后，靜置10分鐘，再在樣品的同一位置點(diǎn)上25μL金標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)10分鐘，最后用0.05mol/LPBS(pH7.4，含0.35％吐溫-20)洗滌2次，每次2分鐘。含防偽標(biāo)識抗原的真品顯出粉紅色，不含防偽標(biāo)識抗原的樣品仍為白色，是為贗品。
實(shí)施例6免疫熒光染色技術(shù)用于防偽標(biāo)識檢定。
許多熒光素都可用來標(biāo)記抗體或蛋白A(或蛋白G)檢測防偽標(biāo)識中的抗原。這些熒光物質(zhì)包括異硫氰酸熒光素(FITC，綠色熒光)；異硫氰酸四乙荃羅丹明(RBITC，桔紅色熒光)；藻紅素(紅色熒光)和香豆素(藍(lán)色熒光)。本例提供RBITC的標(biāo)記抗體和檢測防偽抗原的方法如下。①.取純化的γ-球蛋白，用0.005mol/L PBS配制成2％濃度。加入0.2mol/LNa2HCO3溶液，使pH至8.0。稱γ-球蛋白總量1/40的RFITC，總蛋白1/20體積的二甲醛甲酰胺，攪拌下逐滴加入球蛋白溶液中，同時(shí)用0.1N NaOH調(diào)pH使其維持在9.0-9.5之間。室溫?cái)嚢?-2小時(shí)。用SephadexG 50層析柱去除游離的RBITC。第一峰為RBITC結(jié)合的抗體，收集。分裝，-70℃凍存。將防偽標(biāo)識抗原用數(shù)滴生理鹽水浸洗下來，然后取10微升點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，待充分干燥后，用實(shí)施例4中的封閉液封閉，再將濾紙浸入RBITC標(biāo)記γ-球蛋白的溶液(10μg/mL)中，37℃保溫1小時(shí)，用PBS充分洗滌后用X底片曝光。含防偽抗原的樣品應(yīng)有感光斑點(diǎn)。
實(shí)施例7免疫化學(xué)發(fā)光檢測防偽標(biāo)識。
用生理鹽水50微升從防偽標(biāo)識上洗脫防偽抗原蛋白。取上述樣品10微升(含至少10微微克抗原)點(diǎn)在NC膜上，令其自然干燥。用緩沖液A(含0.1mol/L Tris，pH7.5和0.1mol/L NaCl)配制2％脫脂奶粉，取5ml在室溫處理NC膜60分鐘，以封閉NC膜上非特異的結(jié)合位點(diǎn)。加新配制的1∶1000稀釋的防偽抗原的抗血清1ml，在室溫輕搖保溫和60分鐘，再用緩沖液A漂洗三次，每次5ml及15分鐘。傾去抗血清溶液，加新稀釋(1∶5000)的第二抗體-堿性磷酸酶偶合物1ml，室溫輕搖30分鐘。傾去第二抗體溶液，用上述緩沖液A漂洗NC膜三次，每次15分鐘。用5ml緩沖液B(含0.1mol/L Tris，pH9.5，0.1mol/L NaCl和50mmol/L MgCl2)平衡NC膜2分鐘。將NC膜置于疏水的塑料硬透明膜上，加0.5ml發(fā)光試劑CSPD溶液(以能復(fù)蓋整個(gè)膜為準(zhǔn))，再小心復(fù)蓋另一張塑料硬透明膜，室溫放2分鐘。然后從膜上壓擠出多余的發(fā)光試劑，揭去透明膜，用保鮮膜復(fù)蓋NC膜，在暗室中壓X光片，曝光20～30分鐘。沖片后，在含防偽標(biāo)識的樣品上可以觀察到曝光的黑斑信號。偽品無曝光的黑斑信號。
實(shí)施例8抗原-抗體反應(yīng)用于服裝刷品和標(biāo)簽作為防偽標(biāo)識物。
例(1)、將抗原裝入一軟聚酯囊中。此包囊造形及外表面顏色精美。內(nèi)裝抗原無毒、無害、耐溫變、無污跡、易清洗、耐磨損。將抗體及其標(biāo)記物印制在服裝品牌標(biāo)簽上。外裝以透明聚酯小袋，標(biāo)牌縫于衣褲上。檢驗(yàn)時(shí)撕去品牌的聚酯小袋。將裝有抗原的小囊自衣服的飾鏈取下，擰開上口，滴于標(biāo)牌指定位置上。標(biāo)牌顯示圖案或數(shù)字，消費(fèi)者自辨真?zhèn)巍?br> 例(2)、將抗體裝入另一飾物。將裝抗原的小囊液體滴于裝抗體的飾物指定位置，飾物顯示圖案。
方法制備抗原。制備軟囊。制備含有抗原的軟囊飾物。將軟囊飾物掛于適當(dāng)部位如拉鏈的持手。制備印有抗體及其標(biāo)記物的品牌。將(4)縫于衣服上。將軟囊取下，擰開上蓋，將含有抗原的液體滴加在涂有抗體的品牌飾物的適當(dāng)位置，飾物顯示圖案?？乖?、抗體及標(biāo)記物顯示的圖案、編號；顯示的顏色、品牌及裝抗原的軟囊，隨產(chǎn)品批號多變?？乖?、抗體、飾品及其標(biāo)記物，由國家有關(guān)監(jiān)督部門用儀器實(shí)行高級技術(shù)監(jiān)督，抽樣追蹤商品及其防偽標(biāo)識是否被仿造。


圖1A為牛仔褲，后兜蓋上有拉鏈的示意圖，其中裝有抗原的軟囊1；圖1B為裝有抗原的軟囊(放大)的示意圖，其中有拉鏈1、螺口栓2、抗原3；圖1C為品牌示意圖，其中有聚酯套1、空圈2；圖1D為翻折開的品牌的示意圖，其中有印有抗體及標(biāo)記物圖案1；圖1E為放大的圖案示意圖，其中有滴加抗原后顯示數(shù)字及字母隨批號可變，滴加抗原后顯示2正品、中國制造；圖2A為塑料制的、有夾層的頭型飾品標(biāo)牌的示意圖，其中有鉤環(huán)1、顯色2、試驗(yàn)3、夾層4、抗原滴加孔紅色5、外層圖案6、對照7、上層8；圖2B為下層的示意圖，其中有印涂抗體及標(biāo)記物部分1、硝酸纖維膜(Y型)2；圖2C為下層貼面，貼有硝酸纖維膜部分(虛線部分)的示意圖，其中有硝酸纖維膜1、濾紙層2、厚紙層3。
實(shí)施例9激光、抗原-抗體反應(yīng)在商標(biāo)防偽中的應(yīng)用。
設(shè)計(jì)一種商標(biāo)，由三層薄膜構(gòu)成。第一層為激光防偽薄膜，帶有多種激光加密特征。第二層為涂有抗原的硝酸纖維薄膜，表面印刷有文字或符號，但抗原隱蔽。檢驗(yàn)時(shí)揭去第一層，暴露印有文字符號的第二層。在第二層上滴加抗原洗脫液，將抗原洗脫下來，并滲入第三層，第三層上印有標(biāo)記抗體。當(dāng)?shù)谌龑拥臉?biāo)記抗體與第二層抗原反應(yīng)時(shí)，經(jīng)免疫化學(xué)發(fā)色反應(yīng)，顯示圖案。各層圖案按商品批號多變。
制備方法制備粘合劑。制備激光印刷、防偽標(biāo)簽(第一層)。制備浸有抗原的硝酸纖維薄膜，表面印刷文字符號，符號含有加密內(nèi)涵。制備與3條中的抗原呈特異性反應(yīng)的抗體及其標(biāo)記物。標(biāo)記物質(zhì)在抗原抗體反應(yīng)時(shí)顯色?？贵w及其標(biāo)記物印跡時(shí)按加密要求成特殊圖案或編號。將上述三層用粘合劑粘合。
應(yīng)用方法如下在特殊波長下識別第一層激光防偽圖案，為第一步防偽。揭去第一層，在第二層上顯示特殊加密符號，為第二步防偽。在第二層上滴加抗原洗脫液或?qū)⒋吮∧?含有第二、第三層)浸入抗原洗脫液中，經(jīng)過一定時(shí)間。揭去第二層，在第三層上顯有特殊圖案及符號。為第三步防偽。上述全部材料及文字符號、編碼圖案，均需在制造者及監(jiān)督部門登記保存，以備追蹤。第二層與第三層的抗原、抗體及標(biāo)記物均應(yīng)受技術(shù)監(jiān)督部門管理，并用特殊儀器如酶標(biāo)儀等，抽樣監(jiān)測。以保證商品及防偽標(biāo)記不受偽造。
圖3A為商標(biāo)標(biāo)簽，由三層薄膜粘合而成的商標(biāo)標(biāo)簽示意圖；圖3B為第一層有激光圖象的示意圖；圖3C為印刷符號(肉眼可見)的示意圖，其中有第一層背面1、第二層正面2、第二層硝酸纖維膜3，印跡有抗原，肉眼不可見；圖3D為浸入抗原洗脫液的示意圖，其中有第一層背面1；圖3E為滴加抗原洗脫液于第二層正面的示意圖；圖3F為揭去第二層顯示圖案的示意圖，其中有第一層1、第二層2。
實(shí)施例10抗原-抗體反應(yīng)用于密封簽的方法。
除無第一層激光防偽薄膜外，其余均與實(shí)施例8相同。
實(shí)施例11抗原-抗體反應(yīng)在珍貴字畫、重要印刷品、有價(jià)證券、單據(jù)、貨幣中防偽的應(yīng)用。
珍貴字畫、重要印刷品，有價(jià)證券、貨幣、報(bào)單等，可利用抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性和多樣性加密防偽。將特制的抗原加于油墨、顏料、墨汁中。在上述需防偽的物品印刷或繪制、書寫過程中，標(biāo)識在一定部位上。需要檢查時(shí)，可用一種薄膜蓋在采樣部位上，用抗原洗脫劑浸潤此種薄膜，將抗原轉(zhuǎn)印在取樣薄膜上，以保存被檢商品的完整性。將取樣薄膜剪碎，再浸于抗原洗脫液，必要時(shí)予以濃縮。利用固相標(biāo)記的抗體檢測卡，浸于被檢抗原洗脫液中，抗原與標(biāo)記抗體相反應(yīng)，則可顯色或呈現(xiàn)圖案。
也可以用其它免疫化學(xué)技術(shù)標(biāo)記抗體，用酶標(biāo)儀、生物發(fā)光計(jì)檢測。
為提高檢測靈敏度，還可以用生物擴(kuò)大反應(yīng)的方法，如生物素標(biāo)記，地高辛標(biāo)記、葡萄球菌蛋白A等，提高檢出率?；蛴妹庖呓M織學(xué)方法，用免疫光鏡或電鏡檢查。
方法如下制備抗原，摻入印刷油墨，染料或?qū)Ｓ媚小Ｖ苽淇贵w檢測卡，由抗體及其標(biāo)記物組成。將含有抗原的染料書寫或繪畫到需加密的文物或印刷品上。取樣時(shí)用印跡轉(zhuǎn)移法將抗原轉(zhuǎn)到另一載體上。進(jìn)一步溶解抗原檢測抗原用檢測卡法、特殊儀器法或免疫組化形態(tài)學(xué)(光學(xué)或電子顯微鏡法)依檢測級別和需要而定。上述制備的抗原、抗體及其標(biāo)記物混有特殊抗原的油墨、印泥、顏料、墨汁及所書寫、繪制的文件。畫面與印刷品均需編號備案，并保存使用的材料，以備生產(chǎn)者、技術(shù)監(jiān)督部門核查、追蹤。根據(jù)需要和檢測級別，可用儀器檢查。
圖4A為圖章的示意圖；圖4B為在印泥中沾涂的示意圖；圖4C為加蓋于書畫的示意圖；圖4D為印跡(抗原)轉(zhuǎn)移的示意圖，其中有浸有抗原洗脫液的薄膜1；圖4E為印跡轉(zhuǎn)移后的示意圖；圖4F為破碎的示意圖；圖4G為裝入抗原洗脫液洗脫的示意圖；圖4H為離心，上層液轉(zhuǎn)至另一管的示意圖；圖4I為用鑷子夾持檢測卡浸入抗原液檢測卡印有抗體及標(biāo)記物的示意圖；圖4J為檢測卡顯示線條，證明抗原真?zhèn)蔚氖疽鈭D，其中有對照抗原線1、被測抗原線2；圖4K為偽品，不含有抗原或含有抗體無特異反應(yīng)的抗原不顯色的示意圖，其中有對照抗原線(+)1、被測抗原線(-)2。
實(shí)施例12酒類及飲品的抗原-抗體防偽。
將按食品法規(guī)規(guī)定的食品添加劑，如寡糖、核酸、核苷酸、多肽等，按允許濃度加入酒類或其它飲品。添加后質(zhì)量穩(wěn)定。不影響抗原的反應(yīng)原性。制備出相應(yīng)的抗體及其標(biāo)記物。在包裝物(如瓶蓋墊紙)上涂布抗體及其標(biāo)記物。飲用該飲品前從瓶或罐中滴加一滴被檢品于仰置的瓶蓋中。飲液中的抗原與蓋中墊紙上的抗體立即發(fā)生反應(yīng)，顯示顏色和圖案，消費(fèi)者迅速自行辨別真?zhèn)巍?br> 方法如下選擇適用添加劑，如寡糖、核酸、核苷酸、多肽、肽糖，作為加密物。免疫動(dòng)物制備抗體，純化抗體。制備抗體標(biāo)記物，如膠體金、膠體硒、乳膠顆粒、包被第一抗體。將標(biāo)記物及抗體固相化印跡于硝酸纖維膜，并印成一定圖案。印跡的圖案、形狀、顏色隨產(chǎn)品批號多變。所添加的抗原樣品、抗體及標(biāo)記物樣品均由生產(chǎn)者質(zhì)量監(jiān)督部門及各級技術(shù)監(jiān)督部門登記、留存。所使用的抗原(添加劑)、抗體及其標(biāo)記物由國家有關(guān)監(jiān)督部門用儀器(酶標(biāo)儀、實(shí)行高級技術(shù)檢測，抽樣追蹤商品及其防偽標(biāo)記是否被偽造。
圖5A為瓶蓋示意圖；圖5B倒置的蓋的示意圖；圖5C為放大倒置蓋的剖面圖，其中有硝酸纖維膜2、防水紙層3、厚紙或軟木層4、濾紙層；圖5D為現(xiàn)色圖案之一的俯視圖，其中有紅1、蘭2、紅3、蘭4；圖5E為現(xiàn)色圖案之二的俯視圖，其中有紅1、綠2、蘭3；圖5F為現(xiàn)色圖案之三的俯視圖。
用法如下打開瓶蓋，滴加一滴瓶中液體，靜置。然后觀察。
綜上所述，本發(fā)明效果如下依據(jù)的原理充實(shí)、可信，沿用年久，使用廣泛；辨別真?zhèn)胃叨葴?zhǔn)確，靈敏，保密性極強(qiáng)，難破譯和偽造；適用的商品廣泛；應(yīng)用的是最先進(jìn)的免疫學(xué)技術(shù)，方法成熟，使用方便。
權(quán)利要求
1.一種生物防偽技術(shù)用于物品防偽的方法，其特征在于，利用抗原-抗體反應(yīng)技術(shù)鑒別物品的真?zhèn)?，將抗原或抗體及其標(biāo)識物固定于固相物品或流體和半流體物品上，檢測方法采用非競爭性免疫技術(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防偽方法，其特征在于所使用的抗原為天然存在或人工合成的，具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽、核酸或核苷酸、多糖或寡糖以及類脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防偽方法，其特征在于抗體制備是采用單克隆抗體技術(shù)或多克隆抗體技術(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防偽方法，其特征在于所使用的非競爭性免疫技術(shù)的檢測方法為免疫斑點(diǎn)結(jié)合測定；免疫金屬離子(金、銀)及硒的標(biāo)記測定；致敏微球(人工、天然)測定；熒光素標(biāo)記測定；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記測定。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的防偽方法，其特征在于所述的固相物品為文物、珠寶、首飾、衣物、皮革制品、藥品、食品、保健品、香煙、化肥、農(nóng)藥、種子、工藝品、汽車、摩托車、建筑材料、光盤、磁盤、計(jì)算機(jī)、錄像機(jī)、攝像機(jī)、錄音機(jī)、照相機(jī)、音響、電視機(jī)、通訊器材、儀表、醫(yī)療器械以及各種紙張、塑料或尼龍制造的文件、證件、證券、信用卡、發(fā)票、紙幣、商標(biāo)、海關(guān)申報(bào)單、字畫、古董、圖書。
6.如權(quán)利要求1所述的防偽方法，其特征在于所述的流體和半流體物品為酒類飲料、化學(xué)試劑、印泥、油墨、墨水、油類、潤滑油、化妝品、有機(jī)溶劑、保健食品、發(fā)酵制品、化肥、農(nóng)藥、石油制品、生物制劑、藥物制劑。
7.如權(quán)利要求5或6所述的防偽方法，其特征在于所述的固相物品或流體和半流體物品還包括物品的包裝、商標(biāo)、容器、瓶蓋或任何形式的其他附屬物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物防偽技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及將固相抗原-抗體反應(yīng)和非競爭性檢測技術(shù)用于固相物品或流體和半流體物品防偽的方法?？乖瓰樘烊淮嬖诨蛉斯ず铣傻模哂忻庖咴院?或反應(yīng)原性的蛋白質(zhì)或多肽、核酸或核苷酸、多糖或寡糖以及類脂?？贵w由單克隆或多克隆技術(shù)制備。標(biāo)記方法采用的是金標(biāo)、硒標(biāo)和酶標(biāo)等技術(shù)。由于抗原-抗體反應(yīng)所具有的特異性和難仿性，故難以模仿和假冒。該法主要用于任何形狀物品的外部標(biāo)識，也可用于物品之中。
文檔編號G01N33/00GK1163399SQ97103930
公開日1997年10月29日 申請日期1997年4月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月16日
發(fā)明者郭興華 申請人:郭興華