本發(fā)明涉及藥材檢測領(lǐng)域，且特別涉及一種銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法。

背景技術(shù)：

銀翹散是清代著名溫病學(xué)家吳瑭(鞠通)所創(chuàng)制的名方，載于其所著的《溫病條辨》一書中，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部。本藥由金銀花、連翹、薄荷、荊芥等10味藥材組成，是“銀翹公英湯”、“銀菊白虎湯”和“銀花解毒湯”三方加減化裁而得。銀翹散的處方包括：金銀花60g、連翹45g、薄荷30g、荊芥30g、淡豆豉30g、牛蒡子45g、桔梗25g、淡竹葉20g、甘草20g，具有辛涼解表、清熱解毒的功效，在獸藥臨床上主要用于治療風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛以及瘡癰初起。

2015年版《中華人民共和國獸藥典》二部中銀翹散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有顯微鑒別和金銀花的薄層鑒別，很難控制其質(zhì)量，保證產(chǎn)品的安全性、有效性與質(zhì)量可控性。但現(xiàn)有技術(shù)中公開的淡竹葉薄層鑒別方法的效果較差，不能滿足需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法，該測定方法對淡竹葉具有優(yōu)異的展開性能，硅膠薄層板上斑點(diǎn)的分離度較佳，檢測過程中干擾因素少，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提出一種銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法，其包括以下步驟：

以銀翹散和淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品分別作為第一樣品和第二樣品，取等量第一樣品和第二樣品分別作為試驗(yàn)組和對照組，并進(jìn)行以下處理：

將第一樣品和第二樣品分別溶解于醇溶液中，過濾。

取等量第一樣品的濾液和第二樣品的濾液點(diǎn)樣于同一硅膠薄層板，然后用展開劑展開，干燥后置于紫外光條件下顯色。

上述展開劑為二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水以體積比2-2.4:4.6-5:2.3-2.7:0.6-1:1.3-1.7混合后的混合溶劑。

對比試驗(yàn)組和對照組在紫外光條件下的顯色斑點(diǎn)在硅膠薄層板上的位置。

本發(fā)明實(shí)施例的銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法的有益效果是：以體積比為2-2.4:4.6-5:2.3-2.7:0.6-1:1.3-1.7的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，能針對性地對淡竹葉所含成分進(jìn)行充分展開，且能避免銀翹散中的其它組成成分對淡竹葉成分的展開產(chǎn)生影響。此檢測方法展開效果較佳，色斑分離度良好，檢測過程中干擾因素少，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實(shí)施例的銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法進(jìn)行具體說明。

本發(fā)明實(shí)施例提供的銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法，主要包含取樣、樣品處理、展開和顯色等步驟。

薄層色譜檢測方法是色譜法中的一種，其原理為：利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能的不同，或和其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)，進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配等作用，從而將各組份分開。

該檢測方法是一種微量、快速和簡便的色譜方法。由于各種化合物的極性不同，吸附能力不相同，在展開劑上移動，進(jìn)行不同程度的解析，根據(jù)原點(diǎn)至主斑點(diǎn)中心及展開劑前沿的距離，計算比移值(rf)。

化合物的吸附能力與它們的極性成正比，具有較大極性的化合物吸附較強(qiáng)，因此rf值較小。在給定的條件下(吸附劑、展開劑、板層厚度等)，化合物移動的距離和展開劑移動的距離之比是一定的，即rf值是化合物的物理常數(shù)，其大小只與化合物本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此可以根據(jù)rf值鑒別化合物。

此外，薄層色譜可適用小量樣品(幾到幾十微克甚至0.01μg)的分離，也可用于多達(dá)500mg樣品的分離，是近代有機(jī)化學(xué)中用于定性，定量的一種重要手段。特別適用于那些揮發(fā)性小的化合物，以及在高溫下易發(fā)生化學(xué)變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。

具體地，本實(shí)施例中將含有淡竹葉的銀翹散作為第一樣品(試驗(yàn)組)，然后將第一樣品溶解于醇溶液中，過濾，取濾液。因甲醇溶液價格低廉且較易夠買，故上述醇溶液優(yōu)選為甲醇溶液。此外，第一樣品還可溶解于其它具有揮發(fā)性的有機(jī)溶劑中，如氯仿。第一樣品不宜溶解于水溶液中，其原因在于：水分子與吸附劑的相互作用力較弱，當(dāng)它占據(jù)了吸附劑表面上的活性位置時，就使吸附劑的活性降低，而使斑點(diǎn)擴(kuò)散，最后得到的分離效果則較差。

作為可選地，第一樣品可按以下方式溶解于甲醇溶液中：取2g含有淡竹葉的銀翹散，溶于10ml的甲醇溶液中。該比例下大部分的銀翹散的有效成分均能溶解于甲醇溶液中。

進(jìn)一步地，為了在減少甲醇用量的同時，能夠提高銀翹散的溶解度，本實(shí)施例中在將第一樣品溶解于甲醇溶液中后，還將其置于超聲條件下處理，超聲時間例如可以為25-35min，優(yōu)選為30min。然后再將超聲后的溶液進(jìn)行過濾，去除濾渣，收集濾液。經(jīng)超聲處理后，第一樣品中的所有醇溶性物質(zhì)均完全溶解于甲醇溶液中，從而確保了銀翹散中的淡竹葉物質(zhì)得以充分溶解，利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

因后續(xù)點(diǎn)樣所用的濾液量較少，本實(shí)施例中還可將濾液蒸干，然后再用少量甲醇溶劑，例如2ml進(jìn)行溶解，得到濃度較高、體積較少的樣品溶液。經(jīng)過蒸干濃縮再溶解后的樣品溶液更利于點(diǎn)樣和展開，以避免點(diǎn)樣時樣品濃度較低或較濃影響展開效果，造成拖尾或斑點(diǎn)分離度差的現(xiàn)象。

將上述濾液點(diǎn)樣于硅膠薄層板。硅膠為極性吸附劑，具有較大的吸附量，本實(shí)施例選擇硅膠薄層板，能針對性地分離酸性和中性物質(zhì)。上述硅膠薄層板可以自行購買，也可自制。若硅膠薄層板購自市面，使用前則可以將其于110℃的條件下活化25-35min。若為自制，則盡量使硅膠薄層板表面均勻、平整、光滑、無麻點(diǎn)、無氣泡、無破損及污染。

較佳地，本實(shí)施例中的硅膠薄層板為硅膠g薄層板。其原因在于一般的硅膠薄層板因硅膠薄層的機(jī)械性較差，故使用時在硅膠中加入5-20％的石膏，也即上述硅膠g薄層板。石膏起粘合作用，具有較好的耐腐性特點(diǎn)，將其加入硅膠薄層中，能提升硅膠薄層的機(jī)械性能。

點(diǎn)樣可用毛細(xì)管或點(diǎn)樣器械將濾液點(diǎn)樣于上述硅膠薄層板上。點(diǎn)樣的好壞直接影響分離效果，本實(shí)施例中優(yōu)選點(diǎn)樣成圓點(diǎn)狀或條帶狀，當(dāng)點(diǎn)樣為圓點(diǎn)狀時，圓點(diǎn)狀的直徑優(yōu)選為不大于4mm，最佳為不大于2mm，以提高后期的展開效果，避免拖尾現(xiàn)象。

然后，用展開劑展開。展開劑的選擇主要根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素綜合考慮。目前淡竹葉的薄層鑒別所采用的展開劑組合種類多樣，但由于不同藥物中各組成成分不同，各成分在展開過程中會相互影響，因此，適用于其他藥物的淡竹葉薄層鑒別用的展開劑的組合方式和組成比例并不能夠完全適合于銀翹散中淡竹葉的鑒別。

由于淡竹葉含有大量黃酮類化合物和生物活性多糖和其它有效成分，如酚酸類化合物、蒽醌類化合物和萜類內(nèi)酯，主要功能因子為黃酮糖苷和香豆素類內(nèi)酯。鑒于此，綜合考慮淡竹葉成分與銀翹散中所含的其它物質(zhì)的性質(zhì)，本實(shí)施例中的展開劑優(yōu)選為二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水混合后的混合溶劑。

作為可選地，上述二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水例如可以以體積比2-2.4:4.6-5:2.3-2.7:0.6-1:1.3-1.7混合。優(yōu)選地，二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水以體積比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5混合。

按上述優(yōu)選體積比混合所得的展開劑能針對性的對淡竹葉所含成分進(jìn)行展開，且銀翹散中的其它組成成分對淡竹葉成分的展開基本無影響，展開效果較佳。

將展開劑盛放于展開容器(如展開缸或展開槽)中，將點(diǎn)樣后的薄層板再放入盛有展開劑的展開容器內(nèi)，較佳地，薄層板浸入展開劑的深度為距原點(diǎn)5mm。

作為可選地，本實(shí)施例中的展開時間例如可以控制在15-30min，優(yōu)選地，展開時間為20min。展開時間控制在此范圍，可避免時間過短造成斑點(diǎn)分離不明顯。

展開后，干燥薄層板，然后置于紫外光條件下顯色。有熒光的物質(zhì)或顯色后可激發(fā)熒光的物質(zhì)可在紫外光燈下觀察熒光斑點(diǎn)。

本實(shí)施例中例如可將干燥后的薄層板置于波長為360-370nm的紫外光條件下顯色。最佳地，將干燥后的薄層板置于波長為365nm的紫外光條件下顯色。

根據(jù)樣品中化合物組分的極性，不同化合物在薄層板上移動的距離不同，極性強(qiáng)的化合物會“粘”在極性的硅膠上，在薄層板上移動的距離比較短；而非極性的物質(zhì)將會在流動的溶劑相中保留較長的時間，從而在板上移動較大的距離。化合物在薄層板上的移動距離大小用rf值來表達(dá)，由此，可以根據(jù)rf值來確定化合物的類型等。

此外，本實(shí)施例中以淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品作為第二樣品。

取與第一樣品等量的第二樣品(對照組)，按照上述第一樣品的處理步驟和方法，對第二樣品進(jìn)行相同的處理。值得說明的是，本實(shí)施例中第一樣品和第二樣品在獲得濾液后，是取等量第一樣品的濾液和第二樣品的濾液點(diǎn)樣于同一硅膠薄層板，然后展開、干燥和顯色。

對比經(jīng)相同處理后的試驗(yàn)組和對照組在硅膠薄層板上相對應(yīng)的位置是否有相同顏色的斑點(diǎn)。有則說明試驗(yàn)組和對照組所含化合物成分一致，無則說明試驗(yàn)組和對照組所含化合物成分不一致。

為了提高本檢測方法的準(zhǔn)確性，實(shí)施例中還設(shè)置了陰性比對組，該陰性比對組為不含淡竹葉的銀翹散。取與第一樣品及第二樣品等量的陰性比對組，并按照上述第一樣品、第二樣品的處理步驟和方法進(jìn)行相同處理。

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

以含有淡竹葉的銀翹散為第一樣品(試驗(yàn)組)并對其進(jìn)行以下處理：取2g第一樣品溶于10ml的甲醇溶液中，過濾，取濾液。將濾液點(diǎn)樣于硅膠g薄層板，點(diǎn)樣成直徑為4mm的圓點(diǎn)狀，然后用體積比2:4.6:2.3:0.6:1.3的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，對點(diǎn)樣后的硅膠g薄層板展開15min。展開后，干燥薄層板，然后置于波長為360nm的紫外光條件下顯色。

以淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品作為對照組，并按照上述步驟和方法進(jìn)行相同處理。對比經(jīng)相同處理后的試驗(yàn)組和對照組的薄層色譜相對應(yīng)的位置是否有相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)施例2

以含有淡竹葉的銀翹散為第一樣品(試驗(yàn)組)并對其進(jìn)行以下處理：取2g第一樣品溶于10ml的氯仿溶液中，過濾，取濾液。將濾液點(diǎn)樣于硅膠g薄層板，點(diǎn)樣成直徑為2mm的圓點(diǎn)狀，然后用體積比2.4:5:2.7:1:1.7的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，對點(diǎn)樣后的硅膠g薄層板展開30min。展開后，干燥薄層板，然后置于波長為370nm的紫外光條件下顯色。

分別以淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品和不含淡竹葉的銀翹散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗(yàn)組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進(jìn)行相同處理。對比經(jīng)相同處理后的試驗(yàn)組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應(yīng)的位置是否有相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)施例3

以含有淡竹葉的銀翹散為第一樣品(試驗(yàn)組)并對其進(jìn)行以下處理：取2g第一樣品溶于10ml的甲醇溶液中，超聲25min，然后過濾，取濾液。將濾液點(diǎn)樣于硅膠g薄層板，點(diǎn)樣成直徑為3mm的圓點(diǎn)狀，然后用體積比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，對點(diǎn)樣后的硅膠g薄層板展開17.5min。展開后，干燥薄層板，然后置于波長為363nm的紫外光條件下顯色。

分別以淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品和不含淡竹葉的銀翹散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗(yàn)組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進(jìn)行相同處理。對比經(jīng)相同處理后的試驗(yàn)組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應(yīng)的位置是否有相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)施例4

以含有淡竹葉的銀翹散為第一樣品(試驗(yàn)組)并對其進(jìn)行以下處理：取2g第一樣品溶于10ml的甲醇溶液中，超聲35min，然后過濾，取濾液。將濾液點(diǎn)樣于硅膠g薄層板，點(diǎn)樣成直徑為1.5mm的圓點(diǎn)狀，然后用體積比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，對點(diǎn)樣后的硅膠g薄層板展開20min。展開后，干燥薄層板，然后置于波長為368nm的紫外光條件下顯色。

分別以淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品和不含淡竹葉的銀翹散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗(yàn)組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進(jìn)行相同處理。對比經(jīng)相同處理后的試驗(yàn)組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應(yīng)的位置是否有相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)施例5

以含有淡竹葉的銀翹散為第一樣品(試驗(yàn)組)并對其進(jìn)行以下處理：取2g第一樣品溶于10ml的甲醇溶液中，超聲30min，然后過濾，取濾液。將濾液點(diǎn)樣于硅膠g薄層板，點(diǎn)樣成條帶狀，然后用體積比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，對點(diǎn)樣后的硅膠g薄層板展開20min。展開后，干燥薄層板，然后置于波長為365nm的紫外光條件下顯色。

分別以淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品和不含淡竹葉的銀翹散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗(yàn)組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進(jìn)行相同處理。對比經(jīng)相同處理后的試驗(yàn)組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應(yīng)的位置是否有相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)施例6

以含有淡竹葉的銀翹散為第一樣品(試驗(yàn)組)并對其進(jìn)行以下處理：取2g第一樣品溶于10ml的甲醇溶液中，超聲30min，然后過濾，取濾液。將濾液蒸干，再用2ml甲醇溶解，得到點(diǎn)樣樣品。將點(diǎn)樣樣品點(diǎn)樣于硅膠g薄層板，點(diǎn)樣成直徑為2mm的圓點(diǎn)狀，然后用體積比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，對點(diǎn)樣后的硅膠g薄層板展開20min。展開后，干燥薄層板，然后置于波長為365nm的紫外光條件下顯色。

分別以淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)品和不含淡竹葉的銀翹散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗(yàn)組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進(jìn)行相同處理。對比經(jīng)相同處理后的試驗(yàn)組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應(yīng)的位置是否有相同顏色的斑點(diǎn)。

試驗(yàn)例1

按實(shí)施例1-6的方法對銀翹散中的淡竹葉成分進(jìn)行薄層色譜檢測。實(shí)施例1-6的結(jié)果均顯示：試驗(yàn)組和對照組在薄層色譜對應(yīng)的位置均出現(xiàn)了相同顏色(紅色)的斑點(diǎn)，且色斑分離度極佳。此外，實(shí)施例2-6的結(jié)果還顯示陰性對比組的薄層色譜在試驗(yàn)組顯色斑點(diǎn)對應(yīng)的位置未出現(xiàn)相同顏色(紅色)的斑點(diǎn)，說明該陰性對比組對試驗(yàn)組未產(chǎn)生干擾，也即說明銀翹散中的其它組成成分對淡竹葉成分的檢測效果無影響，驗(yàn)證了本檢測方法的可行性。

試驗(yàn)例2

本試驗(yàn)例就實(shí)施例6中展開劑的溶劑組成比例進(jìn)行改變，用體積比2.2:4.8:2.5:0.8:0.6的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶劑作為展開劑，其余處理均相同。按本試驗(yàn)例處理后所得結(jié)果顯示：試驗(yàn)組和陰性對比組在薄層色譜對應(yīng)的位置均出現(xiàn)了相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對比組對試驗(yàn)組的結(jié)果干擾嚴(yán)重。

說明按此配比的展開劑對銀翹散中的淡竹葉成分進(jìn)行薄層層析檢測，會造成陰性對比組對試驗(yàn)組產(chǎn)生干擾，也即說明銀翹散中的其它組成成分對淡竹葉成分的檢測效果有影響。

因此，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)施例6中銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法的可行性。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例的銀翹散中淡竹葉的薄層色譜檢測方法對淡竹葉具有優(yōu)異的展開性能，硅膠薄層板上斑點(diǎn)的分離度較佳，檢測過程中干擾因素少，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。